3824.4 青贮饲料质量检测与评价技术规范 第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程

ICS65.120

B 46 DB37 山东省地方标准

DB 37/T 3824.4—2019

青贮饲料质量检测与评价技术规范第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程

Technical specification for silage quality testing and evaluation—Part4: Technical

regulation of mycotoxin detection in silage

2019-12-24发布2020-01-24实施

前言

DB37/T 3824—2019《青贮饲料质量检测与评价技术规范》分为4个部分：

——第1部分：全株玉米制作青贮饲料机械揉搓质量评价技术规范；

——第2部分：青贮玉米中可吸收淀粉含量的测定；

——第3部分：多功能饲草粉碎机作业质量技术规范；

——第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程。

本部分为DB37/T 3824—2019的第4部分。

本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本部分由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本部分由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本部分起草单位：山东省畜牧总站、山东五征高北农牧机械有限公司、德州农慧农牧专业合作联合社、东营市畜牧兽医工作站、山东芳华农业机械有限公司。

本部分起草人：翟桂玉、刘栋、姜慧新、王兆凤、曹阳、刘刚、张文娟、仲崇岳、纪中良、王志坚、郭爱华、张磊、王玉霞。

青贮饲料质量检测与评价技术规范第4部分：青贮饲料霉菌毒素

检测技术规程

1 范围

本标准规定了青贮饲料中霉菌毒素的酶联免疫吸附检测和高效液相色谱检测的方法、步骤和技术要求。

本标准适用于青贮饲料中的霉菌毒素的检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 18980 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法GB/T 28716 饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化-高压液相色谱法

GB/T 28718 饲料中T2毒素的测定免疫亲和柱净化-高压液相色谱法

3 术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

酶联免疫吸附法enzyme linked immunosorbent assay，ELISA

利用抗原抗体反应原理，将已知抗原吸附在酶标板上，加入酶标记抗体和样品提取液并混合均匀，充分反应后用去离子水洗去多余抗体，再加入酶的底物，产生有色物质，最后加入终止液使反应终止，用酶标仪测定酶底物的降解量，参照标准曲线计算试样中的抗原量。

3.2

高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC

试样中各组分在色谱柱的流动相和固定相间分配系数不同，在色谱柱中运行时，会反复多次吸附－脱附－放出，经过一定柱长后，彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。高压液相色谱是把流动相改为高压输送，最高输送压力达3.5×104 kPa，色谱柱用小粒径的填料填充的色谱分析方法。

4 酶联免疫吸附技术

4.1 试剂

本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

4.1.1 甲醇。

4.1.2 石油醚。

4.1.3 三氯甲烷。

4.1.4 无水乙醇。

4.1.5 乙酸乙酯。

4.1.6 二甲基甲酰胺。

4.1.7 四甲基联苯胺（TMB）。

4.1.8 吐温-20。

4.1.9 30 %过氧化氢（30 %H2O2）。

4.1.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。

4.1.11 抗原。霉菌毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物。

4.2 ELISA 缓冲液系统

4.2.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，称取1.59 g碳酸钠（Na2CO3），2.93 g碳酸氢钠（NaHCO3），加水稀释至1 000 mL。

4.2.2 洗液为含0.05 %吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T），配制方法为：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）2.9 g，氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾（KCl）0.2 g，吐温-20 0.5 mL，加水至1 000 mL。

4.2.3 底物缓冲液为pH

5.0的磷酸－柠檬酸缓冲液，配制方法为：

——甲液：0.1 mol/L 柠檬酸（C6H8O7?H2O），即称取柠檬酸19.2 g，加水至1 000 mL；

——乙液：0.2 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），即称取磷酸氢二钠71.7 g，加水至1 000 mL；

——取甲液24.3 mL，乙液25.7 mL，加水至100 mL，即可。

4.2.4 底物溶液：取50 μL TMB（10 mg TMB溶于1 mL二甲基甲酰胺中）溶液＋10 mL底物缓冲液＋10 μL 30 %过氧化氢，混均。

5 霉菌毒素标准溶液

用甲醇配成1 mg/mL 霉菌毒素贮备液，-20 ℃冰箱贮存。于检测当天，精确吸取贮备液，用20 %甲醇的PBS（配制方法PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。

6 仪器

所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。

6.1 酶标检测仪。

6.2 酶标板（40孔或96孔）。

6.3 电动振荡器。

6.4 电热恒温水浴锅。

6.5 具0.2 mL尾管的10 mL小浓缩瓶。

7 测定步骤

7.1 提取

取样品通过20目筛粉碎的样品20 g ，置200 mL 具塞锥形烧瓶中，加8 mL 水和100 mL 三氯甲烷－无水乙醇（4：1），加塞密封，振荡1 h ，通过滤纸过滤，取25 mL 滤液于蒸发皿中，置90 ℃水浴上通风挥干。用50 mL 石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250 mL 分液漏斗中，再用20 mL 甲醇－水（4：1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5 min ，静置约15 min ，收下层甲醇－水提取液。 7.2 层析净化

装备层析柱，在层析管中先装入0.5 g 中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4 g 活性碳，敲紧，在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1 g 脱纸棉，尽量塞紧，将7.1收集的提取液层析净化。 7.3 浓缩备用

将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3 mL 乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3 mL 乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95 ℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20 %甲醇的PBS 定容，供ELISA 检测之用。 8 ELISA 检测

8.1 用霉菌毒素与载体蛋白结合物包被酶标板，每孔100 μL ，4 ℃过夜。

8.2 酶标板用PBS-T 洗3次，每次3 min 后，加入不同浓度的标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测样品毒素含量）与抗体－酶结合物溶液（1：100）的混合液（1：1，每孔100 μL ，该混合液应于使用的前一天配好，4 ℃过夜备用），置37 ℃ 1.5 h 。

8.3 酶标板洗3次，每次3 min ，加入底物溶液。每孔100 μL ，37 ℃ 30 min 。 8.4 用1 mol/L 硫酸溶液终止反应，每孔50 μL ，于450 nm 处测定吸光度值。 9 计算

试样霉菌毒素浓度按式（1）计算：

m D V V C g ng 1

)/21???

=霉菌毒素浓度（ (1)

式中：

C ――酶标板上所测得的霉菌毒素的量（ng ），根据标准曲线求得； V 1 ――样品提取液的体积，mL ； V 2 ――滴加样液的体积，mL ；

D ――样液的总稀释倍数； m ――样品质量，g 。 10 精密度

每个试样称取两份进行平行测定,以其算术平均值为分析结果。 其分析结果的相对相差应不大于20 %。 11 高效液相色谱测定技术（HPLC ） 11.1 试剂

本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

11.1.1 色谱甲醇。

11.1.2 乙腈。

11.1.3 石油醚。

11.1.4 氢氧化钠。

11.2 仪器

11.2.1 高效液相色谱仪配荧光检测器。

11.2.2 震荡器（或高速搅拌器）。

11.2.3 高速离心机。

11.2.4 高压气泵。

11.2.5 泵流操作架。

11.3 高效液相色谱条件

11.3.1 色谱柱：C18柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 um。

11.3.2 荧光检测器：激发波长365 nm，发射波长435 nm。

11.3.3 流动相：乙腈-水（25：75）。

11.3.4 流速：1.0 mL/min。

11.3.5 进样量：20 μL。

11.3.6 柱温：室温。

11.4 标准品溶液的配制

取霉菌毒素标准品，用乙腈稀释成0.5 ug/mL的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10 μL、20μL、50 μL、100 μL、200 μL的霉菌毒素标准储备液，置5 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的标准工作液。

11.5 样品前处理

11.5.1 称样预提

称取过20目筛粉碎的混匀试样5 g，置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇。

11.5.2 匀质提取

将预提液用高速均质器在9 500 r/min，高速匀质5 min，超声提取30 min。

11.5.3 上清液收集

将匀质提取液在6 000 r/min下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

11.5.4 残留物的再提取

在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。

11.5.5 提取液浓缩

将下层溶液移到100 mL 圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL ；浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4)5 mL 分2次洗涤，洗涤液一并倒入50mL 离心管中，加水稀释至约50 mL ，在6 000 r/min 下离心5 min ，上清液供制备测试溶液。 11.6 供试样品溶液的制备 11.6.1 注入

将免疫亲和柱连接于50 mL 玻璃注射器，准确移取50.0 mL 净化测试溶液，注入玻璃注射器；将空气压力泵与注射器连接，调节压力使测试溶液以约2 mL/min ～3 mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2 mL ～3 mL 空气通过柱体。 11.6.2 冲洗

更换10 mL 注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10 mL 水，调节压力使水以约6 mL/min 流速清洗亲和柱。 11.6.3 洗脱

准确加入4 mL 色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min ～2 mL/min ，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。乙腈洗脱时，乙腈分2～4次加入，每次加入后，让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2 min ，洗脱后的乙腈溶液，水浴30 ℃加热吹干。 11.6.4 定容备用

将收集的上清液用10 %乙腈定容后上液相色谱仪测定。 11.7 测定

11.7.1 标准曲线制作

精密量取1 ng/mL 、2 ng/mL 、5 ng/mL 、10 ng/mL 、20 ng/mL 的标准品液各20 uL ，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 11.7.2 试样测定

精密量取供试品溶液20 uL ，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于霉菌毒素的量。 12 计算

试样霉菌毒素浓度按式（2）计算：

m V A A C g ng 1)/21???

=霉菌毒素浓度（ (2)

式中：

C ——标准溶液的霉菌毒素浓度，ng/mL ； A 1――试样中霉菌毒素的峰面积； A 2――标准液中霉菌毒素的峰面积； V ――试样溶液最终定容体积，mL ； m ——样品质量，g 。

测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后一位。

13 重复性

同一实验室由同一操作人员使用同一台仪器完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于20 %。_________________________________