蛋白质相互作用的研究方法

举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。

在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。

虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。

一、生物物理学方法

1. 融合蛋白pull-down实验

融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。

被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。

GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。

该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。

2. 亲和印迹

亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。

3. 免疫共沉淀

如果在非变性的条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持，所以就可利用免疫共沉淀方法找出相互作用的蛋白质。这其中的例子包括Harlow等。

利用抗体沉淀腺病毒的EIA蛋白时发现了真核细胞中有与EIA蛋白特异结合的蛋白质；McMahon等利用该方法确定了转录结构域相关蛋白质可以与E2F1和c-Myc转录因子相互作用的蛋白质。

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE 鉴定。

免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

4. 荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移技术的原理是：处于激活状态的供体，可以将其本身的荧光传递到与之十分邻近（通常在10 nm 之内）的受体上。因此，如果用遗传突变的绿色荧光蛋白（GFP）或是合成的荧光染料标记蛋白质，则可以通过荧光体之间的能量传递来确定两蛋白质的相互作用。

这种方法较之上述的方法有两个优点：

（1）蛋白质之间的相互作用是发生在完整细胞里，比较完整地反映了蛋白质在生理状态的活动。

（2）利用这种方法，可以观察到蛋白质在细胞内的定位。

二、分子生物学方法

1. 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。

2. 酵母双杂交

1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域，DNA 结合域（DNA binding domain，BD）及转录激活域（DNA activating domain，AD），将已知基因（诱饵基因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上，当这两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD 与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如His及LacZ 等基因的表达，从而在特定的缺陷培养基上生长。

因此，利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研究已知蛋白间的相互作用。利用酵母双杂交技术筛选cDNA文库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白间的相互作用，一般首先考虑的问题是诱饵载体的构建。编码诱饵蛋白的基因经酶切处理后，

按照正确的读码框与诱饵载体如pGBTK7相连接，再经酶切或测序做进一步的验证分析。

构建好诱饵载体还要同时转化诱饵蛋白酵母菌株如Y187和靶蛋白酵母菌株如AH109，进行毒性和自激活性检测，证明诱饵蛋白的表达对酵母正常生长没有毒性，同时也不能自身激活酵母报告基因的表达，可用于筛选文库或研究蛋白间的相互作用。第二个要考虑的问题就是靶蛋白载体或酵母双杂cDNA文库的构建。

一般在编码靶蛋白的基因或cDNA两端加上同源重组序列，然后与靶蛋白载体如pGADT72Rec 共同转化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重组酶的作用下，靶蛋白基因或cDNA序列整合到载体上，完成靶蛋白载体或cDNA文库的构建。最后一步就是筛选文库或直接研究两个蛋白间的相互作用。

分别含有诱饵蛋白载体和靶蛋白载体的酵母杂交后，在酵母体内融合表达BD诱饵和AD靶蛋白。诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用，导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达，根据报告基因的表达情况，从而达到分离蛋白或研究蛋白互作的目的。

三、遗传学技术

合成致死筛选

合成致死效应是指两个基因同时发生突变时会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时，则无致死效应。这总遗传学方法可以用于分析两个育幼相同重要功能的蛋白之间的相互作用。由于合成致死突变株是不能存活的，不能直接得到致死菌株，因此，在实验室中多使用条件突变菌株。如温度敏感菌株是可以在某些温度条件下致死的突变型。合成致死筛选所得到的两种相互作用蛋白可能是同一复合物的两种组分或是一种蛋白对另一种蛋白所有的调节作用。

四、展望

蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。

新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。

依赖基因序列来分析蛋白质相互作用的分析方法正在形成。而这些先进的、简易的、大规模分析蛋白质相互作用的技术发展又推动了蛋白质组学的进步。可以预见在不久的将来，随着基因组研究和蛋白质组学的不断深入，生命科学中的种种疑难将被逐一攻破。

蛋白质之间的相互作用

蛋白质之间的相互作用，我个人认为可能可以从六个角度理解：蛋白质-蛋白质的相互作用，蛋白质-DNA的相互作用，蛋白质-RNA的相互作用，从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，研究具体的基因的功能，蛋白质在相互作用过程中的结构改变或重折叠或者去折叠。下面分别简单叙述一下。

蛋白质-蛋白质的相互作用研究技术：酵母双杂交，免疫共沉淀，蛋白质-蛋白质共结晶后X-ray

diffraction,NMR,pull-down，质谱（ESI-MS可以用检测蛋白质-蛋白质的相互作用），荧光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-蛋白质的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-蛋白质的相互作用位点，低温冷冻电镜观测等，光镊技术目前尚在研究开发阶段。

蛋白质之间的相互作用如果不是直接相互作用，也可以通过蛋白质-RNA的相互作用和蛋白质-DNA的相互作用而间接产生。

蛋白质-DNA的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，CHIP,DNA-蛋白质共结晶后X-ray diffraction,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-DNA 的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-DNA 的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-DNA的相互作用的特异作用位点的化学交联等。

蛋白质-RNA的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，RNA-蛋白质共结晶后X-ray diffraction（核糖体大小亚基的晶体结构就是这样测定的）,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-RNA的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-RNA的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-RNA的相互作用的特异作用位点的化学交联等。

另外，可以从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，比如可以模拟与预测生物大分子相互作用前后的结构变化推测计算出具体的相互作用位点和构象和能量变化等，生物大分子相互作用在细胞中构成复杂的网络-----比如小世界网络，等级网络，scale-free网络等，可以应用系统生物学的和图论的方法探测出细胞在基因表达的某些方面的相互作用分子体系构成的网络，然后根据网络的抽象的一般特征去研究有关分子间的可能的作用机理和网络整体运行机制。

研究具体的基因的功能也是研究基因表达相互作用的方法。具体我不谈了，我只强调一点：除了基因敲除或敲入，应用蛋白质（比如抗体）亲和作用在细胞内抑制功能蛋白质的功能等降低基因功能的方法外，增强基因功能或者基因异位表达也是研究基因功能的重要方法，非常突出的是iPS cell。

产生诱导多能干细胞的方法

"It(iPS cell) is now possible to reprogram mouse and human somatic cells to a pluripotent state by ectopic expression of the factors OC T4, SOX2, KLF4and c-MYC or a different set of four factors (OCT4, SOX2, NANOG and LIN28 ).Human iPS cells closely resemble ES cells in gene expression, pluripotency and epigenetic states, and hold great potential for regenerative medicine and in v it ro disease modeling. More studies are needed to determine whether iPS cells and ES cells are equivalent in all aspects of function and potential.

Retroviral Infection

The day before transduction, Plat-E cells (Morita et al., 2000) were

seeded at 8X106cells per 100 mm dish. On the next day, pMXs-based

retroviral vectors were introduced into Plat-E cells using Fugene 6 transfection reagent (Roche) according to the manufacturer’s recom-mendations. Twenty-seven microliters of Fugene 6 transfection re-agent was diluted in 300 m l DMEM and incubated for 5 min at room tem-perature. Nine micrograms of plasmid DNA was added to the mixture,which was incubated for another 15 min at room temperature. After in-cubation, the DNA/Fugene 6 mixture was

added drop by drop onto Plat-E cells. Cells were then incubated overnight at 37 centigrade with 5% CO2 。Twenty-four hours after transduction, the medium was replaced.

MEFs or TTFs were seeded at 8X105 cells per 100 mm dish on mito-mycin C-treated STO feeders. After 24 hr, virus-containing superna-tants derived from these Plat-E cultures were filtered through a 0.45 m m cellulose acetate filter (Schleicher & Schuell) and supple-mented with 4mg/ml polybrene (Nacalai Tesque). Target cells were in-cubated in the virus/polybrene-containing supernatants for 4 hr to overnight. After infection, the cells were replated in 10 ml fresh medium. Three days after infection, we added G418 at a final concen-tration of 0.3 mg/ml. Clones were selected for 2 to 3 weeks.

The c-Myc protein has many downstream targets that enhance proliferation and transformation (Adhikary and Eilers, 2005), many of which may have roles in the generation of iPS cells. Of note, c-Myc associates with histone acetyltransferase (HAT) complexes, including TRRAP, which is a core subunit of the TIP60 and GCN5 HAT complexes ( McMahon et al., 1998), CREB binding protein (CBP), and p300 ( Vervoorts et al., 2003). Within the mammalian genome, there may be up to 25,000 c-Myc binding sites ( Cawley et al., 2004), many more than the predicted number of Oct3/4 and Sox2 binding sites ( Boyer et al.,2005; Loh et al., 2006 ). c-Myc protein may induce global histone acetylation ( Fernandez et al., 2003 ), thus allowing Oct3/4 and Sox2 to bind to their specific target loci. Klf4 has been shown to repressp53 directly ( Rowland et al., 2005 ), and p53 protein has been shown to suppress Nanog during ES cell differentiation (Lin et al., 2004 ). Kazutoshi Takahashi and Shinya YamanakaInduction found that iPS cells showed levels of p53 protein lower than those in MEFs (Figure 7 A). Thus, Klf4 might contribute to activation ofNanog and other ES cell-specific genes through p53 repression. -

Klf4 might function as an inhibitor of c-Myc-induced apoptosis through the repression of p53 in system of Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamana kaInduction。The balance between c-Myc and Klf4 may be important for the generation of iPS cells. Klf4 can both activate and repress transcription.

Alternatively, Klf4 might function as an inhibitor of Myc-induced apoptosis through the repression of p53 in our system ( Zindy et al., 1998 ). On the other hand, Klf4 activates p21 CIP1, thereby suppressing cell proliferation ( Zhang et al., 2000 ). This antiproliferation function of Klf4 might be inhibited by c-Myc, which suppresses the expression of p21 CIP1(Seoane et al., 2002 ).The balance between c-Myc and Klf4 may be important for the generation of iPS cells."

-------Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka,Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell ,2006, Vol-126 , 663–676.

蛋白质在相互作用过程中的结构改变或重折叠或者去折叠，可用温度跳跃，NMR，差热分析，红外光谱测定二级结构，点突变测定蛋白质的折叠路径与终态改变等。

以前回答一篇基因相互作用的帖子，今天投篮略修改后发上来。具体如何做，看你们实验室实测中基因表达调控还是蛋白质结构与研究，或是生物信息学和系统生物学，或蛋白质折叠等，而决定。

蛋白质相互作用的研究方法

举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀

蛋白质组学研究方法选择及比较

蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：

●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合

域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子

蛋白质相互作用的主要研究方法

蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G 琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原2体的使用有助于避免污染的产生。（． 的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的。这需要进行蛋白质的定位来确定。免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白。例如E1A与p60的共沉淀就是间接的相互作用。其实际上是E1A与p107直接相互作用，而p107与p60直接相互作用的结果。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀试验的灵敏度不够高。这与抗原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏相互作用的天然状态。 免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法，也是较常用的方法。它的优点是：与蛋白亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应；蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在。Schaerer与他的同事们利用

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和

激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统

DNA-蛋白质相互作用的研究方法

DNA-蛋白质相互作用的研究方法2008-02-21 12:21一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE 分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相

蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法

蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法 XX 化工与制药专业化药XX班学号XXX 指导老师XX老师 摘要 蛋白质棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式，对象主要是胞质蛋白质，对蛋白质功能产生多重影响。近年来由于相关新技术引入，对蛋白质棕榈酰化主要修饰酶及其对靶蛋白功能调节方面的研究已渐成为新热点。本文主要对近几年来蛋白质棕榈酰化修饰及其研究方法作了综述。 关键词：棕榈酰化修饰蛋白质酰基转移酶 DHHC 蛋白

前言 人类基因组计划揭示了基因组的结构,但对多数基因功能仍知之甚少。基因功能通常通过蛋白质实现，因此蛋白质组研究成为近年来生命科学研究的重点领域。蛋白质具有生物活性之前要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程。其中脂质化修饰是一种重要的翻译后修饰形式，目前已知约有5种脂质共价修饰形式，其中100多种蛋白质发生棕榈酰化修饰，赋予蛋白质极其复杂的生理功能[1]。

1．蛋白质棕榈酰化修饰及其相关蛋白质 1．1蛋白质棕榈酰化修饰 30年前蛋白质棕榈酰化修饰形式被发现，然而对其修饰酶的研究最近十年才有所进展。在酿酒酵母中首次发现蛋白质酰基转移(PAT)， 由5O 个氨基酸残基组成，其序列特征为锌指样DHHC-CRD(半胱氨酸残基聚集域)，类似Cys2His2锌指模体，常位于跨膜域TM2和TM3之间。但是至今仍未明确棕榈酰基团修饰识别模体， 推测其保守序列为C-x 2 C-x 9-H-Cx 2-C-x 4-DH-H-C-x 5 C-x 4-N-x 3一F(x 为 任意氨基酸)[2] 。 根据介导和连接方式不同， 棕榈酰化修饰有三种方式和两种类型[2,3,4]。三种修饰方式包括：(1)PAT 介导棕榈酰基转移，为目前主要研究方式；(2)棕榈酰辅酶A 介导转移；(3)棕榈酰辅酶A 为辅酶的转移蛋白质介导转移。两种类型包括：(1)N 型，通过酰胺键连接半胱氨酸(Cys)，(2)S 型，通过硫脂键连接Cys 。S 型较为多见，可分为四个亚类：修饰位点位于或临近跨膜域；修饰位点为N-或C-端Cys ；酰化依赖C-端CAAX 盒异戊烯化修饰；酰化依赖N ．端SH4结构域豆蔻酰化修饰。与异戊烯化、豆蔻酰化、胆固醇脂化、糖基磷脂酰肌醇化(GPI)四种修饰形式不同，棕榈酰化由PAT 、硫酯酶(PPT)动态调节蛋白质酰化和脱酰化， 具有可逆性， 该修饰还常常与其他修饰形式共同修饰蛋白质[5,6]近几年， 相关蛋白质陆续被识别发现。 1．2 DHHC 蛋白 目前将富含DHHC 结构域的蛋白质称为DHHC 蛋白， 它们组成DHHC 蛋白质家族。多数家族成员具有PAT 活性，而且棕榈酰化主要修饰具有DHHC —CRD 的蛋白质，所以多种DHHC 蛋白既是酶又是底物[2]。0hno 等[7]荧光观察发现，人类和酵母DHHC 蛋白主要位于细胞内质网和／或高尔基体，其中少数蛋白质如Pfa5、DHHC-5位于细胞膜，还有少数如Vac8、Pfa3位于酵母液泡。人类DHHC 蛋白普遍存在，其中许多蛋白质呈组织特异性分布，在器官发生晚期合成，发育组织表达高，而成熟组织表达低[2]。 1．3酵母的棕榈酰化蛋白质 最早在酵母中发现j 个促进棕榈酰化修饰的蛋白质是Ras 功能效应子 (Erf2)，锚蛋白重复域蛋白(Akr1)和 SNARE 家族成员Ykt6，但没有确定它们具有PAT 功能；随后经证实Erf2-Erf4/Shr5蛋白质复合体，Akrl 和Swfl 具有PAT

蛋白质相互作用

蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳

第35卷　第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 　收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 　基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002)　作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 　引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄　艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏　南京　210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化

组蛋白修饰的研究方法

组蛋白修饰的研究方法 一、背景 许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM （即甲基化，乙酰化，泛素化和SUM 化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域却是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/ 或核小体改构复合体来实现。 组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下 也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此, 组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响PTM特异性结合蛋白的相 互作用将继续成为重大的研究领域。 确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴侣。这里所描述的方法将对这些方面进行总结，其中包括了详述组蛋白纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的PTM结合蛋 白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总结。二、组蛋白修饰的研究方法 ①细胞裂解 通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDSLaem m样品缓冲液提取

得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言，离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样；然而需要注意的是，一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。然而, 如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分，将可溶性的全细胞提取物留在上 清中。 ②组蛋白富集 在一些实际应用中，有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白；富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细胞或者酵母中提取细胞核十分简单，基本上只需要三个步骤：低渗膨胀（酵母要先将细胞壁消化掉以后）、利用机械力剪切进行细胞膜裂解（例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡）和通过离心分离细胞核（图1A）。染色质粗分离也是很简单的，只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可（图1B）。 ③组蛋白纯化 一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的，并且易于遵循。在这里介绍的方法中，组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的，然后通过柱层析纯化（图1C）。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的，可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有 组蛋白的组分就可以用三氯乙酸（TCA来沉淀，并且如果需要的话，可以通

蛋白质相互作用研究方法及其应用

?技术与方法? 生物技术通报 B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N 2006年增刊 蛋白质相互作用研究方法及其应用 王海波　安学丽　张艳贞　王爱丽　李巧云　晏月明 (首都师范大学生命科学学院,北京　100037) 摘　要:　过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。 关键词:　P DT Y2H T AP FPET SPR Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing (College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t:　W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2 teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced . Key wo rd s:　P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@https://www.sodocs.net/doc/0316399174.html, 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 1　噬菌体展示技术(P DT ) 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人 [1] 将R I 核酸内切酶基因片段 连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人 [2] 利用噬菌体展示技术构建了随机多

研究蛋白质的相互作用的方法

研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术