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ENZYME

New FadB Homologous Enzymes and Their Use in Enhanced Biosynthesis of Medium-Chain-Length Polyhydroxyalkanoates in fadB Mutant Escherichia coli

Si Jae Park,1*Sang Yup Lee 1,2

Metabolic and Biomolecular Engineering National Research Laboratory,Department of Chemical &Biomolecular Engineering and BioProcess Engineering Research Center,Daejeon 305-701,Republic of Korea 2

Department of BioSystems and Bioinformatics Research Center,Korea Advanced Institute of Science and Technology 373-1Guseong-dong,Yuseong-gu,Daejeon 305-701,Republic of Korea;

telephone:82-42-869-3930;fax:82-42-869-8800;e-mail:leesy @kaist.ac.kr

Received 21September 2003;accepted 2February 2004

Published online 23April 2004in Wiley InterScience (https://www.sodocs.net/doc/0d6438196.html,).DOI:10.1002/bit.20065Abstract:Recombinant Escherichia coli harboring the me-dium-chain-length (MCL)polyhydroxyalkanoate (PHA)syn-thase gene has been shown to accumulate MCL-PHAs from fatty acids when FadB is inactive.However,the enzymes in fadB mutant E.coli responsible for channeling the h -oxidation intermediates to PHA biosynthesis have not been fully elucidated.Only recently,two enzymes encoded by yfcX and maoC have been found to be partially responsible for this.In this study,we identified five new FadB homologous enzymes in E.coli :PaaG,PaaF,BhbD,SceH,and YdbU,by protein database search,and exa-mined their roles in the biosynthesis of MCL-PHAs in a fadB mutant E.coli strain.Coexpression of each of these genes along with the Pseudomonas sp.61-3phaC2gene did not allow synthesis of MCL-PHA from fatty acid in recombinant E.coli W3110,which has a fully functional h -oxidation pathway,but allowed MCL-PHA accumulation in a fadB mutant E.coli WB101.In particular,coexpression of the paaG,paaF,and ydbU genes resulted in a MCL-PHA production up to 0.37,0.25,and 0.33g/L,respectively,from 2g/L of sodium decanoate,which is more than twice higher than that obtained with E.coli WB101expressing only the phaC2gene (0.16g/L).These results suggest that the newly found FadB homologous enzymes,or at least the paaG,paaF,and ydbU genes,are involved in MCL-PHA biosynthesis in a fadB mutant E.coli strain and can be employed for the enhanced production of MCL-PHA.

B 2004Wiley Periodicals,Inc.

Keywords:polyhydroxyalkanoates;h -oxidation pathway;fadB ;FadB homologous enzymes;yfcX ;ydbU ;paaG ;paaF ;Escherichia coli

INTRODUCTION

Polyhydroxyalkanoates (PHAs)are polyesters of various hydroxycarboxylic acids accumulated in the cytoplasm

of numerous bacteria as carbon (energy)and/or reducing power storage material (Lee,1996;Madison and Huis-man,1999).

PHA synthase,the key enzyme in PHA biosynthesis,accepts various acyl-CoAs hydroxylated at 3,4,5,or 6carbon positions as substrates,all of which are in (R )-configuration if they contain an asymmetric center at the position of hydroxyl group (Steinbu ¨chel and Valentin,1995).The most favorable substrate for PHA synthase,(R )-3-hydroxyacyl-CoA (R3HA-CoA),can be formed through various metabolic pathways,including fatty acid h -oxidation and biosynthesis pathways.It has been reported that enoyl-CoA,3-ketoacyl-CoA,(S )-3-hydroxyacyl-CoA,and (R )-3-hydroxyacyl-acyl carrier protein (ACP)serve as major precursors for medium-chain-length (MCL)R3HA-CoAs having 6–12carbon atoms (Lee,1996;Madison and Huisman,1999).

Recently,the MCL-PHA biosynthesis pathway was es-tablished in Escherichia coli defective in the fatty acid h -oxidation pathway by introducing the Pseudomonas aeruginosa MCL-PHA synthase gene (Langenbach et al.,1997;Qi et al.,1997,1998).Also,the coexpression of the 3-ketoacyl-ACP reductase or (R )-specific enoyl-CoA hydratase along with the MCL-PHA synthase gene in E.coli having a fully functional or partially defective (FadA àand/or FadB à)h -oxidation pathway allowed the synthesis of MCL-PHAs in E.coli (Park and Lee,2003;Park et al.,2002;Ren et al.,2000;Taguchi et al.,1999;Tsuge et al.,2000,2003).

For the biosynthesis of PHA in the absence of functional FadA and/or FadB,there must exist unidentified enzymes in E.coli ,which convert h -oxidation intermediates to R3HA-CoA.Recently,YfcX,which is homologous to FadB,was found to be necessary for the MCL-PHA formation in a fadB mutant E.coli strain (Snell et al.,2002).Also,coexpression of the yfcX gene with the PHA synthase gene in an fadB

B 2004Wiley Periodicals,Inc.

Correspondence to:S.Y.Lee

*Current address:LG Chem,Ltd./Research Park 104-1,Moonji-dong,Yuseong-gu,Daejeon 305–380,Republic of Korea.

Contract grant sponsor:Korean Systems Biology Project of the Ministry of Science and Technology;BK21project

mutant E.coli strain resulted in enhanced biosynthesis of MCL-PHA compared with the only expression of the PHA synthase gene(Park and Lee,2003).More recently,a new enoyl-CoA hydratase,MaoC,was found to be important for the synthesis of MCL-PHA in a fadB mutant E.coli(Park and Lee,2003).

It has been reported that several FadB homologous enzymes besides YfcX constitute a crotonase superfamily and possess the active sites similar to that of FadB(Haller et al.,2000).Therefore,it was reasoned that these enzymes might be involved in the MCL-PHA biosynthesis in an fadB mutant E.coli strain and be employed for the production of MCL-PHA.

In this study,we identified five new FadB homol-ogous enzymes of E.coli by protein database search and achieved enhanced biosynthesis of MCL-PHA in fadB mutant E.coli by the amplification of these new FadB homologous enzymes.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial Strains and Plasmids

Bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Table I.Escherichia coli XL1-Blue was used as a host strain for plasmid construction.Escherichia coli W3110 (KCTC2223)and its fadB mutant E.coli WB101(W3110 fadB::Km)(Park and Lee,2003;Park et al.,2003)were used for the synthesis of MCL-PHA from fatty acid.All the gene fragments used in the study were obtained from the chromosomal DNA of E.coli W3110by polymerase chain reaction(PCR)with the primers listed in Table II.All the primers were designed based on the previously reported genome sequence of E.coli K12(Blattner et al.,1997). PCR was performed by the PCR Thermal Cycler MP (Takara Shuzo,Shiga,Japan)using Expand High Fidelity PCR System(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim, Germany).DNA sequencing was carried out with Bigdye terminator cycle sequencing kit(Perkin-Elmer,Boston, MA)and Taq polymerase using ABI Prism377DNA sequencer(Perkin-Elmer).Plasmid pMCS104613C2con-taining the gntT104promoter and the Pseudomonas sp. 61-3phaC2gene(Matsusaki et al.,1998)was previously described(Park and Lee,2003;Park et al.,2003).Plasmid vectors for the expression of the E.coli fadB homologous genes were constructed by the insertion of PCR-amplified genes at Eco RI and Hin dIII sites of plasmid p10499A (Park et al.,2002,2003).

Culture Conditions

Escherichia coli XL1-Blue was cultured at37j C in Luria-Bertani(LB)medium(containing per liter:10g tryptone, 5g yeast extract,and5g NaCl).For the production of

Table I.Bacterial strains and plasmids.

Strain or plasmid Relevant characteristics Reference or source

E.coli strains

XL1-Blue recA1,endA1,gyrA96,thi,hsdR17,suppE44,relA1,là,lacà,F V[proAB lacl q

lacZ D M15,Tn10(tet)r]

Stratagene a

W3110FàmcrA mcrB IN(rrnDàrrnE)1kàKCTC b

WB101W3110(fadB::Km)Park and Lee,2003;Park et al.,2003 Plasmids

p10499A pTrc99A derivative;Ap r;gntT104promoter Park et al.,2002,2003

pMCS104613C2pBBR1MCS derivative;gntT104promoter,Pseudomonas sp.61-3phaC2gene Park et al.,2003

p10499SceH p10499A derivative;E.coli sceH gene This study

p10499B1394p10499A derivative;E.coli paaG(B1394)gene This study

p10499YdbU p10499A derivative;E.coli ydbU gene This study

p10499B2341p10499A derivative;E.coli yfcX(B2341)gene Park and Lee,2003

p10499BhbD p10499A derivative;E.coli bhbD gene This study

p10499PaaF p10499A derivative;E.coli paaF gene This study

a Stratagene Cloning System,La Jolla,CA.

b Korean Collection for Type Cultures,Daejeon,Republi

c of Korea.

Table II.List of primers used in PCR experiments using the E.coli

W3110chromosome as a template.a

Primer Primer sequence Target gene

Primer15-g gaattc atgcaactggtaaatgaactg

sceH

Primer25-ccc aagctt ttagcgtcctttaaagtcggg

Primer35-g gaattcat gatggagttcatcctcagtcatgtagaa

paaG

Primer45-ccc aagctt ttatttccccgtgaactgcggtga

Primer55-g gaattc atgatgataaatgtgcaaactgtg

ydbU

Primer65-ccc aagctt ttatgactcataaccgctctc

Primer75-g gaattc atgactatcagcgacttgccggac

bhbD

Primer85-ccc aagctt ttatgactcataaccgctctc

Primer95-g gaattc atgagcgaactgatcgtcagc

paaF

Primer105-ccc aagctt ttagcgtcctttaaagtcggg

a Restriction enzyme sites are shown in bold.

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MCL-PHA,recombinant E.coli strains were cultivated for 96h in250-mL flasks containing100mL of LB medium supplemented with2g/L of sodium decanoate(Sigma,St. Louis,MO).Flask cultures were carried out in triplicates in a rotary shaker at250rpm and30j C.Ampicillin(Ap, 50mg/L)and chloramphenicol(Cm,34mg/L)were added to the medium.

Analytical Procedures

The PHA concentration and monomer composition were determined by gas chromatography(Donam,Seoul,Korea) equipped with a fused silica capillary column(Supelco SPB-5,30m?0.32mm ID0.25A m film,Bellefonte,PA)using benzoic acid as an internal standard(Braunegg et al.,1978). Cell concentration,defined as dry cell weight per liter of culture broth,was determined as previously described(Choi et al.,2002).The residual cell concentration was defined as the cell concentration minus PHA concentration.The PHA content(wt%)was defined as the percentage of the ratio of PHA concentration to cell concentration.

RESULTS

Identification of the E.coli Genes Homologous to the fadB Gene Through Database Search

Several genes homologous to the E.coli fadB gene were found to exist in E.coli through the protein homology search by BLAST(https://www.sodocs.net/doc/0d6438196.html,/BLAST/). These genes include yfcX,bhbD,paaF,sceH,paaG,and ydbU.As shown in Table III,the deduced amino acid sequence of the yfcX gene showed high homology(34% identity of695homologous amino acids)with that of the fadB gene.The deduced amino acid sequences of the other genes also showed high homology to that of the fadB gene to different extents(Table III).Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of FadB homologous enzymes with FadB showed that catalytically important amino acid residues are well conserved in these enzymes (Fig.1).

Production of PHA in Recombinant E.coli Strains Harboring the MCL-PHA Synthase Gene and the fadB Homologous Gene

To examine whether the fadB homologous genes can sup-ply R3HA-CoAs from the h-oxidation pathway,various re-combinant strains of E.coli W3110and WB101harboring pMCS104613C2and p10499A derivative containing one of the fadB homologous genes were constructed,and were cultivated in LB medium containing2g/L of sodium decanoate at30j C(Table IV).Recombinant E.coli W3110 harboring only the Pseudomonas sp.61-3phaC2gene did not produce PHA from sodium decanoate(Park et al.,2002, 2003).Furthermore,introduction of one of the fadB homo-logous genes along with the phaC2gene into recombinant E.coli W3110did not allow PHA accumulation. Escherichia coli WB101harboring only the phaC2 gene accumulated PHA consisting of3-hydroxyhexanoate (3HHx),3-hydroxyoctanoate(3HO),and3-hydroxydeca-noate(3HD)from sodium decanoate as previously reported by other groups(Langanbach et al.,1997;Qi et al.,1997, 1998).The effect of the coexpression of one of the fadB homologous genes with the phaC2gene was notable in E.coli WB101,resulting in the increase of PHA content and PHA concentration.Among those genes,the coex-pression of the paaG,paaF,and ydbU genes along with the phaC2gene resulted in the accumulation of PHA up

to Figure1.Partial sequence alignment of the FadB homologous enzymes with the FadB identified by the protein database search.Catalytically important amino acid residues are shown in boxes(Haller et al.,2000).

Table III.Amino acid homology of six enzymes in E.coli with FadB.a

Enzyme Identity of amino acids

YfcX(714amino acids)34%of695homologous amino acids

PaaG(262amino acids)29%of194homologous amino acids

YdbU(475amino acids)31%of280homologous amino acids

PaaF(255amino acids)34%of179homologous amino acids

SceH(224amino acids)38%of143homologous amino acids

BhdD(507amino acids)31%of280homologous amino acids

a FadB is composed of729amino acids.

PARK AND LEE:NEW FADB HOMOLOGOUS ENZYMES683

0.37,0.25,and 0.33g/L,respectively,which are more than twice higher than that obtained with E.coli WB101har-boring the phaC2gene only (0.16g/L).The coexpression of the fadB homologous genes did not much affect the monomer composition of PHA (Table IV).DISCUSSION

Various intermediate metabolites of fatty acid metabolism can be channeled into the PHA biosynthetic pathway.Metabolic link between the h -oxidation and the PHA biosynthetic pathways has been established by the intro-duction of (R )-specific enoyl-CoA hydratase and 3-ketoacyl-ACP reductase (Park and Lee,2003;Park et al.,2002;Ren et al.,2000;Taguchi et al.,1999;Tsuge et al.,2000,2003).The roles of these enzymes in generating R3HA-CoAs are quite clear.Recently,MCL-PHA bio-synthetic pathway was also successfully established by expressing the MCL-PHA synthase gene in the fadA and/or fadB mutant E.coli strains (Langanbach et al.,1997;Park et al.,2002,2003;Qi et al.,1997,1998;Ren et al.,2000;Snell et al.,2002).In these cases,there should be unidentified enzymes in E.coli responsible for supplying PHA monomers.

Table IV.Results of flask cultures of recombinant E.coli WB101strains harboring pMCS104613C2and a p10499A derivative containing different fadB homologous gene.a

Strain Conditions

DCW (g/L)PHA conc.(g/L)PHA content (wt%)

Monomer composition

3HB 3HHx 3HO 3HD WB101

pMCS104613C2+p10499A

0.88F 0.010.16F 0.0117.9F 0.909F 238F 253F 2pMCS104613C2+p10499B2341b 1.13F 0.030.39F 0.0434.5F 3.609F 233F 258F 2pMCS104613C2+p10499YdbU 1.08F 0.010.33F 0.0331.0F 3.008F 234F 258F 2pMCS104613C2+p10499B1394 1.03F 0.020.37F 0.0235.9F 0.707F 239F 254F 2pMCS104613C2+p10499PaaF 0.98F 0.050.25F 0.0126.0F 0.2012F 239F 249F 2pMCS104613C2+p10499SceH 0.85F 0.040.22F 0.0325.8F 2.306F 234F 260F 2pMCS104613C2

p10499BhbD

0.85

F 0.08

0.20

F 0.02

22.9

F 0.5

10F 2

38F 2

52F 2

Cells were cultivated for 96h at 30j C in LB medium supplemented with 2g l à1of sodium decanoate.Cultures were carried out in triplicates.b

Data were taken from Park and Lee,

2003.

Figure 2.Inherent and engineered metabolic pathways in recombinant E.coli for MCL-PHA biosynthesis from fatty acid through h -oxidation.The exact reaction step(s)that are not known for the pathway are represented by the dashed line.Characters in parenthesis represent:Question mark (?),enzymes that have not been elucidated in E.coli ;X,enzymes that should be inactivated to supply PHA precursors from fatty acid (*enzymes that are only marginally effective in channeling the h -oxidation intermediate to PHA biosynthesis;1Park and Lee,2003;2Snell et al.,2002;3Taguchi et al.,1999;Park et al.,2002;4

Langenbach et al.,1997;Park et al.,2003;Qi et al.,1997;Ren et al.,2000;5Park et al.,2002;Qi et al.,1998).

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Recent studies on the h-oxidation pathway offer some clues for explaining this phenomenon.Haller et al.(2000) reported that crotonase superfamily exists in E.coli,which is highly homologous to FadB and shares the same active site.These include YfcX,PaaF,and PaaG.All of these enzymes are possible candidates for substituting FadB when the E.coli loses FadB activity.Among these,the role of YfcX in PHA biosynthesis in a fadB mutant E.coli strain was recently revealed(Snell et al.,2002).When the yfcX gene was removed from the chromosomal DNA of the fadB mutant E.coli LS1298,PHA biosynthesis from fatty acid could not be achieved by expressing the MCL-PHA synthase gene(Snell et al.,2002).Plasmid-based expres-sion of the yfcX gene in a fadB yfcX double mutant E.coli strain restored PHA formation from fatty acid.Enzymatic analysis of YfcX revealed that YfcX is also a multifunc-tional protein like FadB possessing hydratase and dehy-drogenase activities(Snell et al.,2002).More recently, YfcX was found to form an anaerobic h-oxidation pathway together with YfcY using nitrate as a terminal respiratory electron acceptor(Campbell et al.,2003).It was also shown that they function in mutant strains lacking the enzymes of the aerobic h-oxidation pathway(Campbell et al.,2003). These results strongly suggest that YfcX is involved in the PHA biosynthesis and degradation of acyl-CoAs in the fadB mutant E.coli,and that the other enzymes belonging to the crotonase superfamily may be as well.Therefore,we examined the roles of other FadB homologous enzymes for PHA biosynthesis in a fadB mutant E.coli strain. Several enzymes having high homologies to FadB were identified by a protein database search.Five new homo-logous enzymes,BhbD,PaaF,SceH,PaaG,and YdbU, were identified.Multiple alignment of these enzymes with FadB showed that catalytically important amino acid re-sidues are well conserved,suggesting that these may be involved in the PHA biosynthesis similar to YfcX when the FadB is inactivated(Fig.1).

When one of these genes was coexpressed with the phaC2 gene in E.coli W3110possessing a functional h-oxidation pathway,PHA was not synthesized from sodium decanoate. Previously,we obtained the same result in the case of the coexpression of the yfcX gene with the phaC2gene in E.coli W3110(Park and Lee,2003).This means that FadB homologous enzymes do not have any ability to supply PHA monomers from the h-oxidation pathway when the FadB is functional,which might be due to the weak hydration of eoyl-CoA in an(R)-specific manner or lower activity towards enoyl-CoA compared with FadB.Similar results were obtained when the Pseudomonas oleovorans fadBA genes were expressed in recombinant E.coli having a functional h-oxidation pathway;PHA was not accumulated (Fiedler et al.,2002).However,when a fadB mutant E.coli strain was employed,amplification of PaaG,PaaF,or YdbU allowed2–2.5-fold enhanced PHA production compared with that obtained without the amplification of these enzymes.These results suggest that the above enzymes are able to generate R3HA-CoAs by linking the PHA bio-

synthetic pathway with the h-oxidation pathway in the absence of FadB activity.These results,together with the previous findings related to the MCL-PHA biosynthesis in the fadB mutant E.coli strain,are summarized in Figure2.

To date,MCL-PHA has mainly been produced by the wildtype and recombinant pseudomonads from alkane,al-kanol,and fatty acid(Witholt and Kessler,1999).Advances in our understanding of fatty acid metabolism will allow us to develop better metabolic engineering strategies for the production of MCL-PHAs by recombinant E.coli.The new enzymes found in this study can be employed for this purpose.

We thank Professor Y.Doi(Riken,Japan)for kindly providing the

Pseudomonas sp.61-3phaC2gene.Hardware support for computa-

tional analysis by the IBM-SUR program is greatly appreciated.

References

Blattner FR,Plunkett G,Bloch CA,Perna NT,Burland V,Riley M, Collado-Vides J,Glasner JD,Rode K,Mayhew GF,Gregor J,Davis

NW,Kirkpatrick HA,Goeden MA,Rose DJ,Mau B,Shao Y.1997.

The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.Science

277:1453–1462.

Braunegg G,Sonnleitner B,Lafferty RM.1978.A rapid gas chromato-graphic method for the determination of poly-h-hydroxybutyric acid

in microbial biomass.Eur J Appl Microbiol Biotechnol6:29–37.

Campbell JW,Morgan-Kiss RM,Cronan JE Jr.2003.A new Escherichia coli metabolic competency:growth on fatty acids by a novel anaerobic

h-oxidation pathway.Mol Microbiol47:793–805.

Choi J,Lee SY,Shin K,Lee WG,Park SJ,Chang HN,Chang YK.2002.

Pilot scale production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvaler-

ate)by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli.Biotechnol

Bioprocess Eng7:371–374.

Fiedler S,Steinbu¨chel A,Rehm BHA.2002.The role of the fatty acid beta-oxidation multienzyme complex from Pseudomonas oleovorans

in polyhydroxyalkanoate biosynthesis:molecular characterization of

the fadBA operon from,P.oleovorans and of the enoyl-CoA hydratase

genes phaJ from,P.oleovorans and Pseudomonas putida.Arch

Microbiol178:149–160.

Haller T,Buckel T,Retey J,Gerlt JA.2000.Discovering new enzymes and metabolic pathways:Conversion of succinate to propionate by

Escherichia coli.Biochemistry39:4622–4629.

Langenbach S,Rehm BHA,Steinbu¨chel A.1997.Functional expression of the PHA synthase gene phaC1from Pseudomonas aeruginosa in

Escherichia coli results in poly(3-hydroxyalkanoate)synthesis.FEMS

Microbiol Lett150:303–309.

Lee SY.1996.Bacterial polyhydroxyalkanoates.Biotechnol Bioeng49: 1–14.

Madison LL,Huisman GW.1999.Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates):from DNA to plastic.Microbiol Mol Biol Rev

63:21–53.

Matsusaki H,Manji S,Taguchi K,Kato M,Fukui T,Doi Y.1998.Cloning and molecular analysis of the Poly(3-hydroxybutyrate)and Poly(3-

hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate)biosynthesis genes in Pseu-

domonas sp.strain61-3.J Bacteriol180:6459–6467.

Park SJ,Lee SY.2003.Identification and characterization of a new enoyl coenzyme A hydratase involved in biosynthesis of medium-chain-

length polyhydroxyalkanoates in recombinant Escherichia coli.

J Bacteriol185:5391–5397.

Park SJ,Park JP,Lee SY.2002.Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates

rich in specific monomers.FEMS Microbiol Lett214:217–222.

Park SJ,Park JP,Lee SY,Doi Y.2003.Enrichment of specific monomer in medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates)by amplification PARK AND LEE:NEW FADB HOMOLOGOUS ENZYMES685

of fadD and fadE genes in recombinant Escherichia coli.Enzyme Microb Technol33:62–70.

Qi Q,Rehm BHA,Steinbu¨chel A.1997.Synthesis of poly(3-hydroxy-alkanoates)in Escherichia coli expressing the PHA synthase gene phaC2from Pseudomonas aeruginosa:comparison of PhaC1and PhaC2.FEMS Microbiol Lett157:155–162.

Qi Q,Steinbu¨chel A,Rehm BHA.1998.Metabolic routing towards polyhydroxyalkanoic acid synthesis in recombinant Escherichia coli (fadR):inhibition of fatty acid beta-oxidation by acrylic acid.FEMS Microbiol Lett167:89–94.

Ren Q,Sierro N,Witholt B,Kessler B.2000.FabG,an NADPH-dependent 3-ketoacyl reductase of Pseudomonas aeruginosa,provides precursors for medium-chain-length poly-3-hydroxyalkanoate biosynthesis in Escherichia coli.J Bacteriol182:2978–2981.

Snell KD,Feng F,Zhong L,Martin D,Madison LL.2002.YfcX enables medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate)formation from fatty acids in recombinant Escherichia coli fadB strains.J Bacteriol184: 5696–5705.Steinbu¨chel A,Valentin HE.1995.Diversity of bacterial polyhydroxy-alkanoic acid.FEMS Microbiol Lett128:219–228.

Taguchi K,Aoyagi Y,Matsusaki H,Fukui T,Doi Y.1999.Co-expression of3-ketoacyl-ACP reductase and polyhydroxyalkanoate synthase genes induces PHA production in Escherichia coli HB101strain.

FEMS Microbiol Lett176:183–190.

Tsuge T,Fukui T,Matsusaki H,Taguchi S,Kobayashi G,Ishizaki A, Doi Y.2000.Molecular cloning of two(R)-specific enoyl-CoA hydratase genes from Pseudomonas aeruginosa and their use for polyhydroxyalkanoate synthesis.FEMS Microbiol Lett184:193–198. Tsuge T,Taguchi K,Taguchi S,Doi Y.2003.Molecular character-ization and properties of(R)-specific enoyl-CoA hydratases from Pseudomonas aeruginosa:metabolic tools for synthesis of polyhy-droxyalkanoates via fatty acid h-oxidation.Int J Biol Macromol31: 195–205.

Witholt B,Kessler B.1999.Perspectives of medium chain length poly(hydroxyalkanoates),a versatile set of bacterial bioplastics.Curr Opin Biotechnol10:279–285.

686BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,VOL.86,NO.6,JUNE20,2004

饲用酶制剂

动物对饲料的利用，是在消化道内各种消化酶的作用下将各种养分降解为小分子而被消化道吸收利用的。动物对饲料养分的消化能力决定于消化道内消化酶的种类和活力。近20多年的实践和研究证明，适合动物消化道内环境的外源酶能起到内源酶同样的消化作用。饲用酶制剂是将一种或多种用生物工程技术生产的酶与载体和稀释剂采用一定的加工工艺生产的一种饲料添加剂。饲用酶制剂可以提高动物，特别是年幼或有疾病动物的消化能力，提高饲料的消化率和养分利用率，改善畜禽生产性能，减少排泄物的污染，转化和消除饲料中的抗营养因子，并使一些新的饲料资源能被充分利用。饲用酶制剂大多属于助消化的酶类，其关键是要有较好的稳定性，能够承受加工过程的高温、消化道内酸性环境及内源蛋白酶的破坏作用。近十几年饲用酶制剂的研制、开发与应用发展很快，据调查统计，1998年世界工业酶制剂市场销售额15.6亿美元，其中饲料用酶占9%，为1.4亿美元。饲料用酶销售额1994-1998年五年的年平均增长率为11%，高于同期工业酶制剂总体增长率5%。一、饲用酶制剂的主要种类目前，饲料工业上使用的酶制剂主要是消化碳水化合物和植酸磷的酶，也有些产品包含有蛋白酶和脂酶。（一）消化碳水化合物的酶植物性能量饲料中的碳水化合物含量通常在60％以上。饲料中的碳水化合物是一组化学组成、物理特性和生理活性差异特别大的化合物，有易消化的淀粉，也有难消化的非淀粉多糖(NSP)(图4-2)。（引自《饲料添加剂学》陈代文，2003）因此，这类酶包括淀粉酶和非淀粉多糖(NSP)酶。非淀粉多糖酶又包括半纤维素酶、纤维素酶和果胶酶。半纤维素酶主要包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和半乳聚糖酶；纤维素酶包括C1酶、Cx酶和β-葡聚糖酶。 1、淀粉酶包括α和β—淀粉酶、糖化酶以及支链淀粉酶和异淀粉酶。α-淀粉酶作用于α-1，4—糖苷键，将淀粉水解为双糖、寡糖和糊精，只能分解直链淀粉和支链淀粉的直链部分。淀粉酶作用于淀粉的β—1，6—糖苷键(支链淀粉分支处)，将淀粉也水解为双糖、寡糖和糊精。糖化酶水解底物为双糖、寡糖和糊精，生成葡萄糖和果糖，并从淀粉的非还原末端，依次水解α—1，4—糖苷键生成葡萄糖。饲料中添加多用β—淀粉酶，使用时应加少量的碳酸氢钠或碳酸钠以中和胃酸，以利于淀粉酶的活化，防止该酶在胃肠道失活。 2、半纤维素酶包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和半乳聚糖酶等b：主要作用是将植物细胞中的半纤维素水解为多种五碳糖，且降低半纤维素溶于水后的黏度。小麦和黑麦等谷物中含有阿拉伯糖基木聚糖，这种糖可以与细胞壁的其他成分紧密结合，它含有1，4—糖苷键，而且可以吸收其自身重量

循证医学知识点总结.

循证医学:是遵循科学证据的医学,指的是临床医生在获得了患者准确的临床依据的前提下,根据自己纯熟的临床经验和知识技能,分析并抓住患者的主要临床问题,应用最佳的和最新的科学证据,作出科学的诊治决策,联系具体的医疗环境,并取得患者的合作和接受,以实践这种诊治决策的具体医疗过程。循证医学的基础:①素质良好的医生;②当前最佳的研究证据;③临床流行病学的基本方法和知识; ④患者的参与及合作;⑤必要的医疗环境和条件。循证医学实践的目的:①弄清疾病发病的危险因素,为疾病的防治提供依据;②提供可靠的诊断依据;③帮助医生为患者选择当前最科学、合理的治疗措施;④ 分析和应用促进患者康复的有利因素,改善患者预后和提高其生存质量;⑤提供可用于卫生管理的最佳研究证据,促进管理决策科学化。医学实践的基本步骤:①提出明确的问题;②系统检索相关文献,全面收集证据;③严格评价证据;④应用证据指导决策;⑤后效评价,通过实践进一步提高。证据的质量的分级:①第一级:按照特定病种的特定疗法收集所有多个质量可靠的随机对照试验后所作的系统评价;②第二级:单个的大样本随机对照试验;③第三级:有对照但未用随机方法分组的研究(如设计很好的队列研究、病例—对照研究或无对照。④第四级:无对照的系列病例观察⑤第五级:专家意见。医学如何评价证据是否最佳?①首先是分析评价证据的真实性;②其次是评价其对于临床医疗实践是否具有重要价值;③最后是分析是否能适用于面临的临床问题。Meta分析的目的是:①增加统计学检验效能;

②定量估计研究效应的平均水平;③评价研究结果的不一致性;④寻找新的假说和研究思路。Meta分析的指征是:目前认为Meta分析主要适用于随机化对照试验(RCT结果的综合,尤其存在以下指征:①需要做出一项紧急决定,而又缺乏时间进行一项新的试验;②目前没有能力开展大规模的临床试验;③有关药物和其他治疗,特别是副作用评价方法的研究;④研究结果矛盾时。 Meta分析的基本步骤:①提出问题,制定研究计划;②检索资料;③选择符合纳入标准的研究;④纳入研究的质量评价;⑤提取纳入文献的数据信息;⑥资料的统计学处理;⑦敏感性分析;⑧形成结果报告。考试要点研究证据的来源:(1原始资料来源包括专著、高质量期刊上发表的论著、电子出版物等。例如医学索引在线(Medline、Embase数据库(Embase Database、中国生物医学文献数据库(CBM、中国循证医学/Cochrane中心数据库(CEBM/CCD和国立研究注册(NRR等等。(2经系统评价的二次研究资料包括循证医学教科书、与证据有关的数据库、网站等。例如Cochrane图书馆(CL、循证医学评价(EBMR、循证医学杂志(EBM、国立指南库(NGC、指南(Guidelines等等。从发展的观点出发试说明循证医学的局限性:(1虽然循证医学将会大大提高医疗卫生服务的质量和效率,但它并不能解决所有与人类健康有关的问题,如社会、自然或环境问题;(2建立有效的产生、总结、传播和利用医疗证据的体系,需要花费一定的资源,虽然从长远看,循证医学会降低医疗费用,但其

十种常见的酶制剂

十种常见的酶制剂（1）纤维素酶纤维素酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了,随着在工业上的广泛应用,特别是在纺织工业、能源工业上的应用,纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的基础研究,包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能,以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止,登记在Swiss2Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条,基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代,迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达,以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展. 进入21世纪,利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇,可以避免对粮食作物的大量损耗,引起了各国政府和研究机构的重视,这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低,因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类,比活力至少要低1～2个数量级,如滤纸酶的比活力为1IU/mg左右,CMC的比活力约为 10IU/mg[7],从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题,也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量,从而提高酶的发酵水平.还可以通过改善发酵条件和工艺,如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要,深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式,进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种,发现具有开发潜力的新酶源. （2）脂肪酶脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；

循证医学重点教学内容

循证医学重点

1循证医学：临床医生在获取患者疾病相关资料的基础上，分析患者主要临床问题（病因、诊断、治疗、预后及康复等），通过检索评价当前最新的相关研究成果和最佳证据，在结合患者的实际临床问题与临床医疗的具体环境做出科学、适用的诊治决策，在患者的配合下付诸实施并最后做出相关分析与效果评价。 2临床问题的类型（1）背景问题：关于疾病一般知识的问题，主要由询证医学初学实践者提出。提出问题涉及的知识除基础医学外，还有人类健康和疾病的生物、心理及社会因素等诸多方面。（2）前景问题：往往是医学的前沿问题，是关于疾病最新治疗学、实验诊断学和当前关于病因知识的问题，这些问题是循证医学的核心问题。 3、*原始研究证据：是直接以人群，即病人和（或）健康人为研究对象，进行有关病因、诊断、预防、治疗和预后等研究所获得的第一手研究资料，经统计学处理、分析、总结而形成的研究报告。 4、*二次研究证据：是在全面收集针对某一问题的所有原始证据的基础上，应用科学的标准，经严格评价、整合处理、分析总结而形成的研究报告。它是对原始研究证据进行二次加工后得到的更高层次的研究证据。 5、系统评价：是指针对某一特定临床问题，系统全面的收集全世界所有已经发布或尚未发表的相关研究，采用统一的文献评价原则和方法，筛选出符合质量标准的文章，进行合并分析，尽可能的减少偏倚，得到综合、可靠的结论。可分为定性和定量两种。 6、Meta分析：又称荟萃分析，是对同一课题的多项独立研究的结果进行系统的、定量的综合性分析。是对文献的量化综述，是以同一课题的多项独立研究的结果为研究对象，在严格设计的基础上，运用适当的统计学方法对多个研究成果进行系统、客观、定量的综合分析。 7、病因学：研究病因作用于人体，在内外环境综合影响下，导致人体发病及其发病机制的科学。 8、危险因素：又称致病因素，是指与疾病的发生及其消长具有一定因果关系的因素，但尚未充分证据能阐明其致病效应。然而，当这些因素存在时或被消除后，其相关的疾病发生率会相应的增高或下降。 9、药物不良反应ADR：一般是指在正常用量和用法的情况下，药物在预防、诊断、治疗疾病或调节生理功能时所发生意外的、与防治目的无关的不利或有害的反应。 10、相对危险度RR：病因暴露组的发病率与未暴露组的发病率的比值，或治疗组不良反应的发生率与非治疗组不良反应的发生率的比值。 11、比值比OR：病例组中暴露于该因素者与未暴露者之间的比值为对照组中该项比值的倍数。 12、致成危害需要的人数NNH:导致一例病例的发生所需要暴露在该可疑危险的因素中易感个体的人数。

酶制剂产业现状

酶制剂产业现状一、酶制剂及产业现状介绍酶是由活细胞产生的、催化特定生物化学反应的一种生物催化剂。酶制剂是酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品，主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，其应用领域遍布食品、纺织、饲料、洗剂剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。酶制剂工业是知识密集型的高新技术产业, 是生物工程的重要组成部分。目前为止，已报道发现的酶类有3000多种，但其中已实现大规模工业化生产的只有60多种。全世界酶制剂市场正以平均11％的速度逐年增长。酶制剂产业的发展前景相当广阔。中国酶制剂产业经过50多年的长足发展，已进入世界酶制剂生产的大国行列，目前已实现规模化生产的酶制剂达到30种左右。但由于我国酶制剂产业起步只有半个世纪，导致我国的酶制剂产业和酶工程研究，与国际水平相比还有很大差距。四大酶制剂巨头依然被国外垄断，2017年世界四大酶制剂巨头企业：1、诺维信酶制剂公司；2、美国genencor；3、德国AB酶制剂公司；4、比利时BELDEM。二、国外酶制剂公司巨头—诺维信诺维信公司是全球工业酶制剂和微生物制剂的主导企业，拥有超过40%的世界市场份额。在研发工作中，诺维信运用了传统微生物学、现代生物化学和分子生物学领域的多项先进核心技术，包括表达克隆、重组技术、蛋白工程和高通量筛选技术等，力争为广大客户提供所需的各种酶类。自20世纪60年代以来，诺维信致力于对生物技术的探索和发掘，率先开发出几乎所有主要新型工业酶，先后推出75类，600多种广泛应用于洗涤剂、纺织、淀粉制糖、皮革、酒精、食品、啤酒酿造和饲料等40多个工业加工领域的酶制剂产品。以下介绍该公司的几种代表酶类: 1941年：诺维信推出第一个酶制剂产品Trypsin Novo。这是一种从胰腺提取出来的猪胰蛋白酶，用于皮革工业中皮的软化工艺。 1952年：诺维信开发出Thermozyme。这是世界上第一种用发酵方法制成的酶，使大规模生产用于工业领域的酶制剂成为可能。

食品化学酶的历史

酶的历史一、概念酶工程亦称酶工艺，是在生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化为有用物质的技术酶工程与发酵工程密切相关，是发酵工业发展的产物，是酶学原理与化工技术相结合而形成的一门理论性很强的应用技术。主要内容包括各种酶的开发、生产和利用，酶的分离、纯化技术、酶的化学修饰技术，固定化技术，酶反应器的研制和应用等。酶是生物催化剂，是生物体产生的具有活性的蛋白质。它可高效、专一地催化特定的生化反应，酶的催化作用可使反应速度提高10的8次到10的20次倍。酶促反应具有反应条件温和、能耗低、污染小、操作简单等优点。

2、1961 年国际生化联合会酶学委员会提出将酶分为：氧化还原酶：在生物体内参与产能、解毒和某些生物活性物质的合成；转移酶：在生物体内将某功能基团从一个化合物转至另一个化合物；水解酶：在生物体内外起降解作用，是人类应用最广的酶类；裂解酶：可脱去底物上某一基团而留下双链，或可相反地在双链处加入某一基团；异构酶：依生物代谢需要对某些物质进行分子异构化；连接酶（合成酶）：关系着许多生命物质的合成； 3、酶蛋白有3种组成形式：单体酶：是仅有1个活性部位的多肽链构成的酶，分子量为13000-35000 。寡聚酶：是由若干相同或不同的亚基结合而组成的酶。多酶复合物：是指多种酶进行连续反应的系统，前一反应产物为后一反应的底物。二、酶的探索与发现：公元前800年,古老的烹调方法中已使用来自微生物的酶。 1833-1835年,淀粉的第一次酶解法国化学家Anselme Payen和ean-Franois Persoz 描述了从大麦的麦芽中分离淀粉酶多聚体的过程，并将之命名为淀粉酶。 1836年,德国生理学家Theodor Schwann在研究消化过程时，分离出一种在胃内消化蛋白的物质，将它命名为胃蛋白酶。这是第一个从动物组织中提取到的酶。

第六章酶和辅酶

第六章酶化学（一）名词解释 1．米氏常数； 2 ．寡聚酶； 6.酶活力 7. 不可逆抑制作用； 3．活性中心； 4. 竞争性抑制作用； 8. 可逆抑制作用。 5. 非竞争抑制作用；（二）填充题 3.对于符合米氏方程的酶，v-[S] 曲线的双倒数作图（Lineweaver-Burk作图法）得到的直线，在横轴的截距为___________，纵轴上的截距为 ____________。 4.若同一种酶有n 个底物就有 ________个 K m值，其中 K m值最 ________的底物，一般为该酶的最适底物。 6.当底物浓度等于0.25K m时，反应初速度与最大反应速度的比值是_________。 7.酶催化反应的实质在于降低反应的______，使底物分子在较低的能量状态下达到______态，从而使反应速度______。 8.___________ 抑制剂不改变酶促反应V max， ___________抑制剂不改变酶促反应K m。 9. 含有腺苷酸的辅酶主要有、、和。 11. 维生素 A 缺乏可引起症；儿童缺乏维生素D引起；成人缺乏维生素 D 引起；维生素 C 缺乏引起；维生素 PP 缺乏引起；脚气病是由于缺乏———引起的；口角炎是由于缺乏引起的；维生素 B 缺乏引起；叶酸缺乏引 12 起。 12.维生素 B1在体内的活性形式是，维生素 B2在体内的活性形式是和。维生素PP 可形成和两种辅酶。维生素 B 是以和 6 ———形式作为转氨酶的辅酶，以形式作为氨基酸脱羧酶的辅酶。叶酸是的辅酶，叶酸在体内的活性形式是。生物素在体内的作用是。泛酸在体内的活性形式有和。（三）选择题（在备选答案中选出 1 个或多个正确答案） 1.酶催化作用对能量的影响在于 A ．增加产物能量水平 B ．降低活化能C．降低反应物能量水平 D．降低反应的自由能E．增加活化能 2.下列哪些项是K m值的意义？ A. K m值是酶的特征性物理常数，可用于鉴定不同的酶 B. K m值可以表示酶与底物之间的亲和力，K m值越小，亲和力越大 C.K m值可以预见系列反应中哪一步是限速反应 D.用 K m值可以选择酶的最适底物 E.比较 K m值可以估计不同酶促反应速度 7.酶的比活力是指 A. 以某种酶的活力作为 1 来表示其他酶的相对活力 B. 每毫克蛋白的酶活力单位数 C. 任何纯酶的活力与其粗酶的活力比 D. 每毫升反应混合液的活力单位 E.一种酶与另一种酶的活力比（四）判断题 1.测定酶活力时，底物浓度不必大于酶浓度。 2.当 [S]>>K m时， v 趋向于 V max，此时只有通过增加[E] 来增加 v。 3.酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间愈长，则最适温度愈高。 7.在酶的催化反应中，组氨酸残基的咪唑基既可以起碱化作用，也可以起酸化作用。 8.维生素对人体有益，所以摄入的越多越好。

循证医学规培大纲知识点

1. 循证医学:慎重、准确和明智地应用目前可获取的最佳研究证据，同时结合临床医师个人的专业技能和长期临床经验，考虑患者的价值观和意愿，完美地将三者结合在一起，制定出具体的治疗方案。 2. 遵循证据是EBM的核心思想。循证医学的核心是患者。 3. 狭义EBM：循证临床实践；广义EBM：包括一切医疗卫生服务的循证实践。 4. 循证临床实践（EBCP）三要素：患者意愿、临床医生地专业知识和研究证据。 5. 临床研究作为医学证据（按研究内容分类）： a关于病因的临床研究；b关于诊断或筛查的临床研究； c关于治疗或干预的临床研究；d关于预后的临床研究。 6. 证据的分类：原始研究证据(观察性研究：队列研究、病例对照研究、横断面调查、描述性研究、病例分析、个案报道，实验性研究：随机对照实验、非随机同期对照实验、交叉实验、前后对照实验)、二次研究证据(系统评价，临床实践指南，临床决策分析，卫生技术评估，卫生经济学研究) 8. 证据分级（干预的临床研究）一级：所有随机对照试验的系统评价/Meta-分析二级：单个的样本量足够的RCT结果三级：设有对照组但未用随机方法分组四级：无对照的病例观察五级：临床经验，专家意见

新9级：系统评价或Meta分析、随机双盲对照实验、队列研究、病例对照研究、病例系列报告、个案报告、专家的观点评述及意见、动物实验、体外/试管内实验 9.治疗性研究的设计类型: 系统评价、随机对照试验、非随机的对照试验、队列研究（观察）、无对照的病例系列、个案报告。诊断性研究的设计类型：系统评价、队列研究。病因研究的设计类型：系统评价、随机对照试验、队列研究、病例-对照研究。预后研究的设计类型系统评价: 系统评价、队列研究、病例-对照研究。系统评价是最高级别的证据。 10. 需要治疗的病人数（Number Needed to Treat, NNT）：指获得（或避免）1个事件需要治疗的病人数。NNT越大，效应值越小 11.循证临床实践的步骤方法:A.发现和提出临床问题；B.检索相关研究证据；C.对证据的真实性和重要性进行评价；D.应用当前最佳证据指导具体患者的临床决策;E.决策效果评估。 12.临床问题的类型：治疗问题、诊断问题、病因问题、预后问题。基于主题的学习(系统，以教材为中心，效率低下，缺乏目的性) 基于问题的学习（零散，以学习者为中心，印象深刻，针对性强）13.证据来源：（1）原始资料来源包括专著、高质量期刊上发表的论著、电子出版物等。例如医学索引在线（Medline）、Embase数据库（Embase Database）、中国生物医学文献数据库（CBM）、中国循证医学/Cochrane中心数据库（CEBM／CCD）和国立研究注册（NRR）等等。（2）经系统评价的二次研究资料包括循证医学教科

高中生物第二章酶技术单元检测北师大选修1

第二章酶技术 (时间：60分钟满分：100分) 一、选择题(本题包括15小题，每小题3分，共45分) 1.与果胶酶本质不相同的物质是( ) A.抗体 B.胰岛素 C.载体 D.性激素答案 D 2.在酶活力的测定过程中，不包括的条件是( ) A.温度保持在25 ℃ B.pH采用最适条件 C.底物的浓度采用最适条件 D.测定过程中添加激活剂答案 D 解析酶活力是指在一定条件下，1 min内能转化1 μmol底物的酶量。测定过程中温度保持在25 ℃，其他条件如pH和底物的浓度等均应采用最适条件。 3.下图表示果胶酶加入到苹果泥后在0～80 ℃的环境中，苹果泥的分解总量与温度的关系图，依图判断，在0～80 ℃环境中，酶的活性变化曲线(pH适宜)，正确的是( ) 答案 B 解析由题图可知，当温度为37 ℃左右时，分解苹果泥的速率最快(即曲线斜率最大)，此时酶的活性最高；温度达到大约50 ℃时，苹果泥分解总量不再改变，说明此时酶已经变性失活，酶的活性为零。 4.某同学为了验证果胶酶的作用，设计了如下实验

(1)取两个100 mL的洁净烧杯，编号为1号、2号。 (2)向两个烧杯中分别加入20 mL的苹果泥，向1号烧杯内加入2 mL的蒸馏水，向2号烧杯内加入2 mL的果胶酶。 (3)把这两个烧杯放在水浴中保温，并用玻璃棒搅拌。下面分析中正确的是( ) A.1号烧杯为实验组，2号烧杯果汁变澄清 B.2号烧杯为实验组，1号烧杯果汁变澄清 C.1号烧杯为对照组，2号烧杯果汁变澄清 D.2号烧杯为对照组，1号烧杯果汁变澄清答案 C 解析由于该实验是研究果胶酶的作用，所以加入果胶酶的烧杯为实验组，加入蒸馏水的烧杯为对照组；果胶酶能够把果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，使混浊的溶液变澄清。 5.关于果胶和果胶酶的叙述中错误的是( ) A.组成植物细胞壁的主要成分是果胶和纤维素，果胶主要分布在细胞胞间层和初生壁 B.果胶酶有多种，如多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶等 C.果胶酶在食品工业中有广泛的用途，在其他方面则无用处，体现了酶的专一性 D.果胶酶、纤维素酶配合使用，可分解植物细胞壁中的果胶和纤维素，促使淀粉、脂质、维生素和蛋白质的释放，以提高饲料的营养价值答案 C 解析果胶酶的化学本质是蛋白质，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等，作用是分解细胞壁中的果胶，使果汁产量增加，透明度提高，在食品工业(如制作果汁、提高葡萄酒质量等)方面作用很大。也常与纤维素酶等共同使用，有提高饲料营养价值和降低饲料黏度、促进饲料在动物消化道内的消化等作用。但酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化学反应，而不是指酶只有一种用途，因此C错误。 6.下图是人体内某个化学反应的示意图，图中代表酶的英文字母是( ) A. A B. B C. C D. D 答案 A 解析酶是起催化作用的，它在反应前后的性质保持不变，故据图可知A所代表的物质是酶。 7.下列叙述中正确的是( ) A.人体小肠中的纤维素酶和洗衣粉中的纤维素酶最适pH不同 B.胃蛋白酶与洗衣粉中碱性蛋白酶化学本质相同

循证医学考试重点总结

第01章绪论 1、循证医学EBM：遵循科学证据的医学，是指临床医生在获得患者准确临床依据的前提下，根据自己纯熟的临床经验和知识技能，分析并抓住患者主要的临床问题，应用最佳和最新的科学证据，做出科学的诊治决策，联系具体的医疗环境，并取得患者的合作和接受，以实践这种医疗决策的具体医疗过程。因此，这种决策是建立在科学证据的基础之上的，同时在患者合作下接受和执行这种诊治决策，从而尽可能的获取最好临床效果，这种临床实践成为循证医学。 2、循证医学的实践包括：患者、医生、证据、医疗环境。 3、循证医学实践的基础：高素质的临床医生、最佳的研究证据、临床流行病学基本方法和知识、患者的参与。 4、循证医学分两种类型：最佳证据提供者、最佳证据应用者。前者称之为循证医学，后者称之为循证医学实践 5、最佳证据提供者：临床流行病学家和统计学家、各专业的临床医生、卫生经济学家和社会学家、医学科学信息工作者 6、最佳证据应用者：临床医生、医疗管理者、卫生政策决策者。 7、循证医学实践的方法：a、找准患者存在且需要解决的临床问题；b、检索有关医学文献；c、严格评价文献；d、应用最佳证据指导临床决策；e、总结经验与评价能力。 8、循证医学有着强烈的临床性 9、临床实践循证医学的目的：a、加强临床医生的临床训练，提高专业能力，紧跟先进水平；b、弄清疾病的病因和发病的危险因素；c、提高疾病早期正确诊断率；d、帮助临床医生帮患者选择真是、可靠、具有临床价值并且实用的治疗措施，指导临床用药，充分利用卫生资源，提高效率减少浪费。 e、改善患者预后。F、促进卫生管理决策。G、有利于患者本身的信息检索，监督医疗，保障自身权益。第02章提出临床需要解决的问题 1、提出临床问题的重要性1忽略提出临床问题的重要性，导致临床研究和临床实践的盲目性 2.“提出一个好的问题，用可靠的方法回答这个问题”是保障临床研究质量的两个至关重要的方面 2、临床医生提出一个好问题对自己的益处 1.有利于医生集中使用有限的时间，解决与患者直接需要相关的问题 2.有利于制定高产出的证据收集策略，提高解决问题的针对性3.有利于形成一种优良的行为模式 4.有利于成为更好的、决策更快的临床医生。 3、循证医学问题的来源 1.疾病情况、处理方法、预期效果存在不确定性2、注重临床实践、保持好奇心 3承认自己的不足 4.临床问题来源于临床实践具体如下病史和体检；研究病因；临床表现；诊断问题；鉴别诊断；预后；治疗方案；疾病预防 4、问题的种类 1背景问题a问题词+动词 b一种疾病或疾病的某个方面 2.前景问题 a病人或（和）问题ｂ干预措施ｃ对比措施ｄ重要临床结局第03章研究证据的分类、来源与检索 1、证据：经过试验所得出的结论。 2、试验的特征：大样本、随机、盲法、对照 3、研究证据的分类?原始研究证据?二次研究证据：①系统评价（SR）②临床决策分析③临床证据手册④卫生技术评估⑤临床实践指南 4、研究证据的来源?原始研究证据：①医学索引在线Medline②Embase数据库③中国生物医学文献数据库CBM④中国循证医学/Cochrane中心临床研究数据库⑤NNR⑥Current controlled trials⑦Clinical trials?二次研究证据：①Cochrane图书馆②循证医学评价③评价与传播中心数据库CRDD④临床证据⑤循证医学杂志⑥ACP⑦循证护理杂志 5、循证医学文献检索的特点：①带着解决患者的特定临床问题而检索文献（PICO策略）②文献的整理与评价③系统评价法 6、PICO策略：P：为patient或population的缩写，表示他（她）或他们患的是什么病、存在什么临床或防治需要解决的问题。I：为intervention （干预措施）的缩写，表示根据病人存在的临床问题，我们拟探求使用的干预措施是什么？C：为comparison（比较）的缩写，表示拟探求使用的干预措施的对照比较措施是什么？如随机、双盲、安慰剂等。O：为outcome（结果）的缩写，表示拟探求使用的干预措施最终结局是什么？如像事件的发生率、相对/绝对危险降低率、挽救每一个病例需治的病例数等 7、Cochrane系统评价：是Cochrane协作网成员在Cochrane协作网统一工作手册指导下，在相应Cochrane评价组编辑部指导和帮助下，按照特定的病种和疗法，收集全世界所有能收集到的质量可靠的随机对照试验进行Meta-分析，从而得出简明、扼要的综合结论---即这种疗法究竟有效、无效，还是尚需进一步研究。第05章循证医学用证的个体化原则 1、最佳证据具备的特性 1.真实性分析来自什么样的研究，是否有恰当的对照组；分析研究对象的诊断标准及其纳入和排除标准是否明确；分析组间的临床基线是否可比，干预措施和方法是否科学、有效、安全；终点指标是否确切、有何偏移因素存在及其采取了什么防止和处理方法；资料收集、整理、统计分析是否合适2重要性确定“真实性好”之后要评价有无临床应用价值3应用性任何最佳证据的应用和推广，都必须结核病人的实际病况、医疗条件、医务人员的知识水平、技能水平、患者的接受程度及社会经济状况的承受能力等 2、应用最佳证据需要考虑的问题a生物学证据 b 病理生理学证据c社会-心理及经济特点d应用研究证据要权衡利弊e个体化干预的效果预测第06章循证医学中常用的统计指标与方法 1统计方法抉择的基本原则：a分析目的（统计描述、统计推断）b资料类型（数值变量、分类变量）c.设计方法d.数理统计条件 2EER:：实验组中某事件的发生率 3CER:对照组中某事件的发生率 4RD:即率差，危险差，两个发生率的差。两率差为0时，两组的某事件发生率没有差别，而两率差的可信区间不包含0（上下限均大于0或上下限均小于0），则两个率有差别，反之，两率差的可信区间包含0，无统计学意义。 5RR:相对危险度，是指暴露组的发病率与非暴露组的发病率之比，常用来表示暴露与疾病联系的强度及其在病因学上的意义大小。RR大于一，实验因素是疾病的有害因素，RR小于一，实验因素是疾病的有益因素，RR等于1，实验因素与疾病无关。其可信区间不包含1时有统计学意义，包含1时无统计学意义。 6OR：优势比在病例-对照研究中OR指病例组暴露人数与非暴露人数的比值(a/b)除以对照组暴露人数与非暴露人数的比值(c/d),即ad/bc。 7RRR:相对危险度降低率。RRR=1减RR,可反映实验组与对照组某事件发生率增减的相对量，无法衡量增减的绝对值。 8ARR：绝对危险降低率，等于CER减EER,用以反映实验组与对照组某事件发生率增减的绝对量。 9NNT:需要处理的病人数，扣除对照组效应后，对病人采用某种防治措施处理后，得到一例有利结局需要防制的病例数。NNT越小，该防治效果越好，临床意义越大。 10NNH：采用某种防治措施处理后，治疗多少病例数可出现一例副作用。 11假设检验的基本步骤：a提出检验假设又称无效假设，符号是H0；备择假设的符号是H1。b选定统计方法，由样本观察值按相应的公式计算出统计量的大小，如X2值、t值等。根据资料的类型和特点，可分别选用Z检验，T检验，秩和检验和卡方检验等c根据统计量的大小及其分布确定检验假设成立的可能性P的大小并判断结果。 12:假设检验的注意事项：a.两个前提：一是研究者需要通过样本的信息去推断总体的结论，各样本资料对其总体应具有良好的代表性。b.假设检验不能判断差别的大小。C.假设检验的结论不能绝对化。d.假设检验的方法与科研设计、资料的分布特征有关。 13.临床意义与统计学意义的关系。见课本68页最下面的表格，可以考虑写桌上。第07章系统评价的方法与评价原则 1、系统评价：系统评价是一种全新的文献综合方法，指针对某一具体临床问题（如疾病的病因、诊断、治疗、预后），系统、全面地收集全世界所有已发表或未发表的临床研究，采用临床流行病学的原则和方法严格评价文献，筛选出符合质量标准的文献，进行定性或定量合成，得出综合可靠的结论。系统评价可以是定性的，也可以是定量的，即包含 Meta-分析过程，系统评价的整个过程非常明确，使其具有独特的优点即良好的重复性。 2、文献综述：由作者根据特定的目的和需要或兴趣，围绕某一题目收集相关的医学文献，采用定性分析的方法，对论文的研究目的、方法、结果、结论和观点等进行分析和评价，结合自己的观点和临床经验进行阐述和评论，总结成文，可为某一领域或专业提供大量的新知识和新信息，以便读者在较短时间内了解某一专题的研究概况和发展方向，解决临床实践中遇到的问题。常常缺乏严谨的规范方法，易发生各种偏倚。 3、为什么要进行系统评价？1应对信息时代的挑战 2及时转化和应用研究成果3提高统计效能 4、Meta分析与系统评价的区别与联系：1联系： Meta-分析是一种统计分析方法，它将多个独立的、可以合成的临床研究综合起来进行定量分析。 Meta分析也称为系统评价。2区别：系统评价可以使定性系统评价和定量系统评价，即包含Meta分析。Meta分析数学上更为精确，易受选择偏倚的影响。高质量的Meta分析必须采用系统分析的方法，减少偏倚和误差的影响。 5、叙述性文献综述与系统评价的区别与联系在1研究的问题、2原始文献的来源、3检索方法、 4选择标准、5原始文献的评价、6结果的合成、7 结论的推断、8结果的更新，这几个方面区别于联系分别是。叙述性文献综述：1涉及的范畴常比较广泛2常不予说明，收集不全面3常不予说明4常不予说明，易产生偏倚5评价方法不统一6多采用定性的方法 7有时遵循研究证据8无定期更新系统评价：1常集中于某个具体问题2有明确的检索策略3有明确的检索策略4有明确的选择标准5 有系统、严格的评价方法6多采用定量的方法7多遵循研究证据8根据新的试验结果定期更新 6、系统评价的方法步骤：1确立题目、制定系统评价计划书2检索文献3选择文献4评价文献质量5 收集数据6分析资料和报告结果（1定性分析2定量分析a同质性检验bMeta-分析c敏感性分析）7 解释系统评价的结果8更新系统评价 7、同质性检验：指对不同原始研究之间结果的变异程度进行检验 8、系统评价原则：一、系统评价的结果是否真实1 是否为随机对照试验，随机对照试验能较好的控制各种偏倚因素。2“方法”部分是否描述清楚，收集的文献越系统全面，结论受发表偏倚影响就越小，可信度就越高。3不同研究结果是否一致。如果原始研究疗效相似或方向一致，合成结果可信度就较高。如果同质性检验有显著差异，则应解释产生差异的原因，并考虑能否合并。二、系统评价的结果是否重要1疗效如何2疗效是否精确三、系统评价的结果是否适用于我们的患者1患者与研究对象的差异2干预措施本院是否可行3干预措施对于患者利弊4对干预措施的疗效和不良反应，患者自己的价值观和选择如何 9、系统评价的应用：一、临床实践的需要，如:美国政策研究所经常应用系统评价的结果制定临床实践指南。如呼吁禁止盲目使用白蛋白。二、科研工作的需要，如：英国国家医学会提供资助的临床试验要求提供相关系统评价。三、反映学科新动态，围绕专业发展的需要，检索某个领域的文献资料，做好有关专题的系统评价，可以深入反映该领域目前的动态、存在的问题和发展的方向，促进学科的发展。四、医学教育的需要，教科书出版周期长，系统评价是快速获取有关知识的途径之一。五、卫生决策的需要，1990年魁北克的Meta分析报告指出，没有证据表明使用高渗造影剂比低渗造影剂更危险。1990-1992净节约1千2百万美元。第08章 Meta-分析在循证医学实践中的应用第一节Meta-分析的概述 Meta-分析：又称荟萃分析，是对具有相同研究题目的多个多个医学研究进行综合分析的一系列过程，包括提出研究问题、制定纳入和排除标准、检索相关研究、汇总基本信息、综合分析并报告结果等。目的在于增大样本含量，减少随机误差所致的随机误差，增大检验效能。. Meta-分析的基本步骤： 1、提出临床问题，制定研究计划 2、建立检索策略，收集所有相关的研究文献与资料。3、制定纳入与排除标准，筛选原始研究文献，并逐一进行严格研究。4、纳入研究的质量评价。5、提取纳入文献的数据信息。6、资料的统计学处理 7、敏感性分析8、形成结果报告 Meta分析的指证：目前认为Meta分析主要适用于随机化对照试验（RCT）结果的综合，尤其存在以下指证： 1、需要做出一项紧急决定，而又缺乏时间进行一项新的试验。2、目前没有能力开展大规模的临床试验3、有关药物或其他治疗，特别是副作用评价结果的研究。4、研究结果矛盾时。 Meta分析的目的是： 1、增加统计学检验效能 2、定量估计研究效应的平均水平 3、评价研究结果的不一致性 4、寻找新的假说和研究思路第二节Meta分析的统计分析过程一、效应量的统计描述效应量（ES）：是指临床上有意义或实际价值的数值或观察指标改变量。观察指标为分类变量资料：RR相对危险度、OR比值比、ARR绝对危险度降低率；数值变量资料：WMD加权均数差值、SMD 标准化差值森林图是由多个原始文献的效应量及其95%可信区间绘制而成，横坐标为效应量尺度，纵坐标为原始文献的编号，按照一定的顺序，将各个研究的效应量及其95%可信区间依次绘制到图上。可用于描述每个原始研究的效应量分布及其特征，同时展示研究间结果的差异情况。二、异质性检验（Meta分析前的必要准备）异质性检验的目的是检查各个独立研究的结果是否具有一致性（可合并性）（一）Q检验（方差倒数为权重，其检验效能低）（二）异质性来源与处理来源：研究设计、干预措施、结果测量时点与方法、统计模型及分析方法、纳入和排除标准等方面均数异质性潜在来源。对原始研究文献进行严格评价。处理：亚组分析、敏感性分析、随机模型、Meta 回归及混合模型、放弃Meta分析只做一般统计描述三、合并效应量的估计与统计推断合并效应量实际上是多个研究效应量的加权平均值。步骤：逐一计算每个研究的效应量（OR、RR、ARR 等）及其95%可信区间。根据资料类型和异质性检验的结果，选择适合统计分析模型，估计合并效应量及其统计推断四、敏感性分析主要方式：改变纳入标准、排除低质量的研究、采用不同统计方法/模型分析同一资料等。例如：在排除某个低质量研究结果后，重新估计合并效应量，并与未排除前的Meta分析结果比较，探讨该研究对合并效应量影响程度及结果稳定性。如未发生大的变化，说明敏感性低，结果较为稳健可信。反之，在解释结果时候要慎重第四节固定效应模型与随机效应模型一、固定效应模型（一）二分类变量资料的固定效应模型（二）数值变量资料的固定效应模型二、随机效应模型（一）二分类变量资料的随机效应模型（二）数值变量资料的随机效应模型合并效应量多个原始研究效应量的加权平均值；固定效应模型以每个研究内的方差的倒数作为权重随机效应模型一研究内方差与研究间方差之和的倒数作为权重，部分消除异质性的影响三、Meta回归及混合效应模型四、其他一些方法学进展固定效应模型使用条件：在异质性可被忽略时，可选用固定效应模型，此时可认为即使研究间的效应量有差别，也是由于抽样误差造成的。随机效应模型与固定效应模型相比，主要步骤完全相同，逐一计算每个研究的效应量及其95%可信区间，然后估计合并效应量及其95%可信区间。第五节Meta分析结果评价一、 Meta分析结果的评价标准 1、Meta分析提出的临床问题是否敏感：要求干预措施产生的效应在生物学上是唯一的。 2、文献检索方法是否详尽清楚:要求查全与查新结合。 3、原始文献的纳入标准是否合适 4、是否对每一个纳入研究都进行了真实性评价：要求原始研究必须真实 5、评价结果可重复性如何：要求至少2名作者分别对纳入研究进行评价。 6、结果合并是否合适：借助异质性检验与敏感性分析判断。二、评估发表性偏倚的影响（二）如何识别发表性偏倚1、绘制漏斗图：以样本含量或效应量标准误的倒数为纵坐标，以效应量或效应量对数为横坐标所绘制的散点图。类似倒漏斗。不对称分布时，存在发表偏倚。 2、计算失安全数：回答“需新增多少个无统计学意义的研究，才使合并效应量无统计学意义”。数值越大，发表偏倚越小。三Meta分析结果的外部真实性评价及证据个体化 Meta 分析的结果在推广应用时，应注意干预对象的生物学特征，以及干预场所、干预措施、依从性、辅助治疗等方面的差异。不能推荐没有Meta分析证据支持的建议。在无肯定性结论时应注意：是证据不充分而不能定论，还是有证据表明确实无效 Meta 分析的结论不断更新。第09章病因和危险因素的循证医学实践 1、病因和危险因素的研究方法有：随机对照试验、病例对照研究、队列研究、现况调查。 2、评价病因和危险因素研究结果真实性的原则。a 病因和危险因素研究是否采用了强度高的研究设计方法，b试验组与对照组的暴露因素、结局的测量方法是否一致？是否采用了盲法？c观察期是否足够长？结果是否包含了全部纳入的病例？d病因和危险因素研究因果效应的先后顺序是否合理？e 危险因素与疾病之间是否有剂量效应关系？f病因和危险因素研究的结果是否符合流行病学的规律？g病因致病的因果关系是否在不同的研究中反映出一致性？h病因致病效应的生物学依据是否充分？ 3病因学研究结果的应用。a纳入研究的对象是否与自己面临的具体病人不同b具体病人发生疾病的危险性多大c确定患者的喜好和希望解决的问题d 是否应终止接触危险因素或更改治疗措施。 4病因学研究对医疗决策的价值。a依据流行病学的宏观证据作出决策b依据临床医疗实践的观察作出决策c医疗决策应注重社会效益 5随机对照试验（RCT）：是前瞻性研究，因果关系论证强度最佳。当探讨病因时，可以选择健康无病人群，用随机法分成两组，一组接触可能的致病因子，另一组接受安慰剂，以观察其致病效应，虽然可获得最佳的因果证据，但如果违反伦理道德就不可行。现常用于评估新药和新的治疗方法 6队列研究：是从因到果的研究设计，对因果联系的论证强度较佳且可行性好。该设计是将明确的无病自然人群，以有或未接触被研究的可能致病因素自然地形成两组，观察一段时间后，将两组某病的发病率或死亡率进行比较，确定其因果关系及其危险程度，这种前瞻性观测，称为前瞻性队列研究。另种是回顾性队列研究，回顾性追溯若干年前群体中某些个体是否暴露于某个可能的致病因素，研究其与现存的某种疾病之间的关系。 7病例对照研究：是回顾性研究病因和危险因素最常用的方法。它选定患有某病的病例组和相应配对的无该病者为对照组，同时回顾调查分析某种致病因素的致病效应和程度。从中找出该因素是否与某病之间存在关联。这种研究设计的方法，多用于发病率很低，致病的自然病程长，很难作前瞻性病因学研究者。 8现况调查：又称为横断面调查,是流行病学病因和有关危险因素调查中最常用的方法。通过抽样调查来描述疾病发生的时间、地点、人群的特征，以及对同时存在的可疑危险因素进行定量研究，探求原因不明性疾病的病因线索。第10章疾病诊断证据的分析与评价 1、对诊断性试验研究评估的基本要求： ①确定金标准②确定新的诊断性试验 ③正确选择的研究对象④新诊断性试验与金标准结果做比较 2、诊断性试验常用的指标： ①敏感度SEN②特异度SPE③阳性预测值⑩阳性预测值：诊断性试验中，真阳性在“有病”患者中的比例与假阳性在“无病”例数中比例的比值。 3、ROC曲线：又称受试者工作特征曲线，以该试验的灵敏度（真阳性率）为纵轴，而以1-特异度（假阳性率）为横坐标，依照连续分组测定的数据，分别计算SEN和SPE，按照平面几何的方法，将给出各点连成曲线，即为ROC曲线。应用目的有二：其一用于正常至临界点的选择，其二用于优选性质类似的诊断性试验验前比数=验前概率/（1-验前概率）验后比数=验前比数×似然比、、验后概率=验后比数/（1+验后比数）平行试验-----可提高灵敏度 SEN=SENA+(1-SENA)×SENB SPE=SPEA×SPEB 序列试验-----可提高特异度SEN(A+B)=SENA×SENB SPE(A+B)=SPEA+(1-SPEA)×SPEB 4、诊断性试验的评价标准：真实性、重要性、实用性 5、循证医学诊断性试验的应用： ①ROC曲线的应用②似然比的临床应用：似然比是诊断性试验综合评价的理想指标，他综合了敏感度与特异度的临床意义，而且可依据实验结果的阳性或阴性，计算某病例患病的概率，以便在诊断性试验检测后，更确切的对患者做出诊断。③提高诊断性试验敏感度或特异度的方法：平行试验、序列试验第11章疾病防治的循证医学实践第一节原始治疗性证据的真实性评价 1.为了正确地应用证据于循证医学防治性实践，仅仅了解证据的等级是远远不够，需要对证据的质量，从其（真实性、重要性及实用性）进行分析与评价，方能决定证据的取舍。 2.临床随机对照实验（RCT）质量评价的关键因素：（1）.在被评价的RCT证据中，一定要注重其研究样本是来自随机抽样以及研究样本具体的随机分组方法，是否采用了隐匿措施，。（2）.被纳入的研究对象之诊断依据是否可靠，有否具体的纳入及排除标准明确这些研究对象所患的疾病代表性如何。（3）.注意试验开始时，组间的临床基线状况是否一致？可比性如何？有无显著性差异？（4）.干预措施是否明确，是否执行了盲法以及盲法类别是什么，药物的制剂、剂量、用药途径是否清楚。（5）.注意组间的研究对象除接受试验措施之外，是否存在同时接受了其他治疗措施。（6）.试验观测的中间指标和终末指标是什么。（7）.入组试验研究对象的总例数，在最终试验的证据中是否完全。（8）.分析证据的统计学方法是否正确和合理。 3.非RCT证据的两种特殊情况：（1）.如果是非随机临床同期对照试验的研究结果，其所提供的证据是无效的，B-错误水平允许的范围之外（B-错误＜0.2，power＞0.8）。那么这种证据倒是可信的。相反，如果提供的证据是阳性结果的话，倒是值得怀疑的因为研究者发生各种偏移的几率是颇大的。（2）.假如所治疗的疾病确为疑难重症，当前又公认缺乏有效的治疗药物或方法，而且预后很差，病死率高。如果检索文献发现的某种疗法即使缺乏对照治疗结果且被证明是有效的话，那么这种证据可被接受。当然也需要作进一步的重复验证。另一种情况则属于确诊的某一疾病，被某一特效药物治疗而被证明为有效者，即使为对照性的观测结果，也可被接受。第二节原始资料治疗性证据的重要性评价如果对收集的证据经过真实性评价之后，被确认真实性差而不宜采用者则应放弃，无需作临床重要性评价。但如果确认证据是真实或较为真实而被参考采用者，那么就要进一步分析和评价这种证据对临床的重要意义及价值。对于任何真实的证据，从其意义上讲概括为三种情况。一为确认为真正阴性结果，表明无临床应用价值。二为暂时难下结论，存在争议的证据，这就需要进一步研究证据。三为真正有意义的阳性结果证据，自然就有应用价值，兹分述如下：第一真正的阴性结果（证据）即通过临床研究论证，确实证明某一种措施对于某一疾病的治疗没有价值或为乏效，或为弊大于利。这样临床医生则拒绝应用。第二真正的尚有争议的结果（证据）任何临床治疗措施往往是有利又有弊的，特别是某种临床常用的药物，往往是被证明利大于弊才被采用的。第三真实有效的治疗证据对于真实有效的治疗证据也必需联系临床的具体实际和病种，病情的实际来评价它的临床价值，看看是否有临床的重要性。 1、临床治疗效果究竟有多大判断临床效果的程度，一定要明确试验组与对照组事件发生率各有多大（如治愈率，病死率～）以及组间差值，然后对这些差值的临床价值和意义做出评价。 2、治疗证据的效果之准确度如何所谓的治疗效果可信的程度，从上述效果程度的指标看，总是以事件或实际效果的绝对数据表示，显示仍有机遇因素的影响，为了提供其准确的程度以助于临床重要意义的评价和指导临床应用，常用 95%可信区间表示（95%CI）其可信区间越小，则可信度越靠近真值，反之可信度就要差一些 3、审慎地评价中间指标及实验指标的意义第三节原始治疗性证据的实用性评价 1、有效的证据是否与我们经治的患者情况一致。 2、采用治疗性证据的可行性如何。3、施以患者的治疗措施或药物，一定要权衡利弊4病人对拟采用的治疗证据的期望及价值取向第四节治疗性评价证据的质量分析 1.治疗性系统评价证据的真实性 2.治疗性系统评价证据的重要性3.系统评价的治疗证据之实用性第12章药物不良反应 1、ADR定义指合格药品在正常用法用量下出现的与用药目的无关的或者意外的有害反应，包括副作用，毒性反应，特异质反应，过敏反应，致畸，致癌，致突变反应和依赖性等。 2、ADR分型 1.A型（量效关系密切型）是由于药物的药理作用相对增强的结果，或由药物或其代谢产物的毒性作用。可以预测，通常与剂量有关;发生率高，但死亡率低。副作用、毒性作用、后遗效应、继发反应等。如降糖药引起的低血糖，抗高血压药引起的体位性低血压，抗组胺药引起的抗胆碱作用。2. B 型ADR（量效关系不密切型）是与正常药理作用完全无关的异常药物反应。难预测，常规毒理学难以发现，发生率低但死亡率高，有病人异常性和药物异常性两种，特异性反应，药物不良反应，免疫抑制，致癌性致畸性均属此型。 3、药物不良反应的循证诊断依据 1.时序性是否明确，不良事件总是应该发生在药物应用之后2.符合同种、同类已知不良反应发生的规律，观察到的药物不良反应符合同种同类动物实验或临床早就中已经肯定的反应，则药物与不良反应之间的因果关系较肯定。3.是否可排除混杂因素的影响，要注意药物不良反应是否可用痛死服用其他药物或者疾病本身的病情进展解释。4.撤药实验和去激发试验，停止使用被怀疑的药物或者减少剂量时体内药物浓度水平下降，不良反应消失或减轻。 5.激发和再激发实验再次使用被怀疑药物后这种不良反应又发生。 4、药物不良反应的病因学关联程度分级? WHO分六级：1,肯定有关2,很可能有关3，可能有关4，不可能有关5，待判定6，不能评价或不能判定我国在此基础上分5级：1，肯定有关2,很可能有关3，可能有关4，怀疑5，不可能有关 5、ADR的循证治疗原则？ 1.减少或终止药物损害：A型ADR：首先调整剂量B 型ADR：原则上立即停药 2.严密观察：药源性疾病难以预测，应密切观察病情变化，必要时针对性的处理，直至不良反应完全缓解 3.治疗：症状严重时应当进行对症治疗、必要时住院治疗或延长住院时间 6、ADR的判断和处理原则？（应用ADR的结果于临床，从哪方面考虑） 1.文献报告中的结果是否适合于我经治的病人。2, 估计不良反应对我经治的病人的影响。3,了解病人的医院和希望解决的问题。4,选择疾病治疗中更少发生不良反应的方法第13章疾病预后循证估计 1、预后----指疾病发生后，对疾病未来病程和结局的预测。 2、预后因素—任何疾病发生以后，都要经过长短不等的疾病过程逐渐发展为痊愈、残废、死亡等不同的结局，在这一过程中有许多因素将对其产生影响，发生不同的结局，这些影响疾病结果的因素均称为预后因素。 3、预后因素包括： ①人口学特征：年龄、性别②疾病本身的特点：病情、病程、合并症③社会-经济地位和家庭因素： ④医疗条件：⑤个性特征：心理因素和身体素质⑥ 依从性：⑦早期诊断、早期治疗⑧不同疾病的特殊预后因素 4、描述预后常用的指标----用简单的率表示： ①有效率（response rate) 患某病经过治疗后，证实有效病例占同期该病总病例数的百分率 ②缓解率(rimission rate)患某病经过治疗后，达到临床疾病消失期的例数占同期该病总病例数的百分率 ③复发率(recurrence rate)患某病已经缓解或痊愈后，重新复发患者占同期该病总病例数的百分率 ④病死率(case-fatality)某时期内因某病死亡的病例数占该病总病例数的百分率 ⑤5年生存率(5-year survival rate)从疾病某点开始到5年时存活病例占该病总观察病例数百分率应用这些指标，明确预后的终点，这样才能在研究预后的文献中，使用相同的指标相互比较，取得最佳证据，以期用于临床对预后的判断 5、预后研究方案：前瞻性和回顾性两大类型：（1）、前瞻性研究方案①随机对照研究②队列研究③临床对照研究④描述性研究（2）、回顾性研究方案①回顾性队列研究②病例-对照研究③描述性研究 6、影响预后证据质量的偏倚：①集中偏倚②迁移性偏倚③测量性偏倚 7、集中偏倚的控制措施：①随机化②限制③配对 ④分层⑤多因素分析 8、预后证据的质量评价分几方面： ①如何判断预后证据的真实性②预后证据的临床重要性评价③如何应用真实且有其重要价值的证据指导有关的预后处理（实用性）第14章临床经济学的循证医学实践临床经济学是研究实践中成本投入（诊疗成本）与效果产出（诊疗效果）效率的一门学科，其研究的结果可为不同层面的决策提供参考依据。临床经济学评价的意义 1、合理配置卫生保健资源 2、遴选基本诊疗技术和