细胞因子生物学活性检测
细胞因子生物学活性检测
撰稿金伯泉黄传书朱勇
细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子cDNA克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。
白细胞介素-1生物学活性检测
Con A 刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性
应用EL-4、CTLL检测IL-1生物学活性
白细胞介素-2生物学活性检测
白细胞介素-6生物学活性检测
干扰素生物学活性检测
肿瘤坏死因子-α生物学活性检测
白细胞介素1(IK-1)生物学活性测定
撰稿金伯泉黄传书
白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。
Con A 刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性
应用EL-4、CTLL检测IL-1生物学活性
ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物
学活性
撰稿金伯泉
(一) 原理
小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(３H-TdR
掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。
(二) 操作步骤
取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺
置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液
调整细胞数为1.5×10７／ml
↓
细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔
培养板中加100μl(1.5×10６细胞)
↓
加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品
100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml)
↓37℃ CO２孵箱 66h
每孔加３H-TdR 0.5μci
↓37℃ CO 孵箱 6h
多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上
↓
烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数计算:
1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位
2. 也可用刺激指数(SI)表示
实验组cpm
SI＝──────×100％
对照组cpm
(三) 试剂和器材
1. 10％ FCS RPMI1640，96孔培养板，CO 孵箱
2. 标准IL-1，ConA
3. ３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯
4. 9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪
5. β液闪计数仪
(四) 注意事项
1. 不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。
2. 不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一，一般选用6～8周龄，小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。
3. ConA促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。
应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性
撰稿黄传书
IL-1是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤的重要的内源性致热原和炎症介质。目前IL-1 检测方法有多种，主要包括：小鼠胸腺细胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T淋巴细胞系法以及EBV转化B细胞法等。
㈠原理：小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆细胞表面具有高密度IL-1
受体，在IL-1诱导下产生高水平的IL-2，通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性，从而反映检测样品中IL-1的水平。
㈡操作步骤：
1. 用EL４细胞两步法检测IL-1活性：
收集处于对数生长期的EL４细胞
↓
洗涤后，用1％FCS RPMI1640重悬细胞，并
调整细胞浓度2×10６/ml，
↓
加处96孔板中，100μl/孔
↓
加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β，100μl/孔，
同时设1％FCS RPMI 1640对照
↓
5％CO ,37℃培养18～24小时
↓
按终稀释度为1∶10～20转入另一块96孔板中
↓
用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"
2. 用EL4细胞一步法检测IL-1活性
用5％FCS RPMI 1640调整
EL4细胞浓度至2×10５/ml，CTTL-2浓度至4×10５/ml
↓
加入96孔板中，两种细胞各加50μl/孔
↓
加入不同稀释度的IL-1或待测样品，同
时设EL４和CTLL-2细胞对照
↓
置5％CO２,37℃培养24～28小时后加入
３H-TdR,0.5μci/50μl/孔,继续培养6～8小时
↓
收集样品，β计数
㈢试剂和器材
1. EL４细胞
2. CTLL-2细胞
3. 标准rIL-1。
4. ３H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。
5. 玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。
6. β计数仪
7. 96孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。
8. FCS,RPMI 1640,CO２培养箱等。
㈣注意事项：
1. 在一步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度不宜超过1×10４/孔，血清终浓度应＜5％。
2. 在二步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度在2×10５/孔时，犉d转移上清稀释度不宜低于1∶8,其诱导时间应12～24小时间为佳。诱导血清浓度应
≤1％。
3. 在检测经诱导的上清中IL-1时，应避免使用A23187，TPA和ConA等较强的能诱导EL４细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。
白细胞介素2(IL-2)的生物学活性测定
撰稿金伯泉
(一) 原理
IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，故称T细胞生长因子（ T Cell Growth factor, TCGF ）。IL-2产生的水平反映T细胞的功能，牪;仅是免疫调节重要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL是C57BL ／6来源的。犘!鼠杀伤性T淋巴细胞细胞系，由Gills 1977年建立，只有在IL-2存在的培养基中才能生长。因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。除CTLL外，丝裂原活化的T淋巴母细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。
(二) 方法
可根据实验室条件，选用３H-TdR掺入法和MTT法
1. ３H-TdR掺入法
IL-2依赖的CTLL用10％FCS RPMI1640洗涤
2次，每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2
↓
调整活细胞数1×10５／ml
↓
96孔平底培养板中每孔加100μl
CTLL悬液(1×10４／孔)
↓
加入不同稀释度标准IL-2和待测样品
↓
37℃CO 孵箱，培养18～24h
↓
每孔加３H-TdR 0.5μci／50μl
↓ 4-6h
用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上
↓
干燥后，移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，
于液闪仪中测β射线的cpm值
↓
计算(举例)
将标准IL-2不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的cpm值作图，犠]轴采用概率座标(probit)，横座标为Log2稀释倍数。从50％的最高cpm值画一横线，犛k标准和待检斜线的交点，即可计算出待检样品IL-2的活性单位。
如标准品50％最大cpm值时为1u／ml，则待测标本1∶4时为1u／ml,原液则为4μ/ml
2. MTT法
MTT(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide , 四甲基偶氮唑盐)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞
存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲(Formazan)，将结晶的甲溶解释放，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下，MTT法的敏感性可接近３H-TdR同位素掺入法。
IL-2依赖的CTLL用10％FCS RPMI1640洗涤2次，
每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2
↓
调整活细胞数1～2×10５／ml
↓
96孔平底培养板中每孔加100μl
CTLL悬液(1～2×10４／孔)
↓
加入不同稀释度标准IL-2和待检样品，100μl／孔，
每份设3个重复孔
↓
CO 孵箱培养18～24h
↓
每孔加10μl MTT(5mg／ml溶于PBS)
↓4h，37℃
轻轻吸出150μl上清，加入150μl二甲亚砜(DMSO)
或酸性异丙醇(异丙醇溶于0.04N HCl)
↓
溶解10min，测OD值(570nM)
(三) 试剂和器材
1. IL-2依赖的CTLL
2. 10％FCS RPMI1640
3. ３H-TdR
4. 标准IL-2
5. MTT, 酸性异丙醇，二甲亚砜(DMSO)
6. PPO，POPOP，二甲苯
7. 9999型玻璃纤维滤纸
8. 96孔平底培养板
9. 细胞收集仪
10. CO 孵箱
11. β液闪计数仪
(四)注意事项
1. CTLL细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增殖。
2. 避免同位素污染。
3. 加标准IL-2或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。
4. 加入３H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。
5. CTLL细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。
白细胞介素6(IL-6)生物学活性检测
撰稿朱勇
白细胞介素6(IL-6)是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子。HTLV-1感染的T淋巴母细胞系、单核细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞均可产生IL-6。某些急性炎症、自身免疫性疾病、淋巴细胞恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤)等与病人体内IL-6水平异常增高有关。
㈠原理：IL-6在体外能促进B细胞杂交瘤的生长，故又称为杂交瘤生长因子(HGF)。小鼠B细胞杂交瘤7TD1是一株对IL-6依赖的细胞系，由Van Snick 1986年建立，只有在IL-6存在的培养基中才能生长，可以作为指示细胞来测定待检样品中IL-6水平。这类IL-6依赖的小鼠B细胞杂交瘤细胞系还有MH60·BSF2、B9等。
㈡方法：主要为３H-TdR掺入法
IL-6依赖的7TD1细胞用无FCS的RPMI1640洗涤2次
每次1000rpm，5min，除去原培养液中的IL-6
↓
用10％FCS-RPMI1640调整活细胞数2×10４/ml
↓
96孔平底培养板中每孔加100μl 7TD1悬液(2×10３/孔)
↓
加入不同稀释度标准IL-6和待检样品(100μl/孔)
↓
37℃，5％CO２孵箱培养48～72h
↓
每孔加３H-TdR 0.5μCi/50μl
↓10h
用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上
↓
干燥后移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。
计算：
1. 根据cpm值，将能使7TD1细胞３H-TdR掺入cpm值达到最大值50％的
IL-6的活性定为1u/ml。
2. 以刺激指数(SI)表示。
㈢试剂和器材
1. IL-6依赖的7TD1细胞系
2. 10％FCS-RPMI1640及无FCS的RPMI1640
3. ３H-TdR
4. 标准IL-6
5. PPO,POPOP,二甲苯。
6. 9999型玻璃纤维滤纸。
7. 96孔平底培养板
8. 多头细胞收集仪
9. CO２孵箱
10. β液闪计数仪
㈣注意事项：
1. 7TD1细胞洗涤要充分、轻柔，每次弃洗涤上清力求彻底。
2. 避免同位素污染。
3. 加样品时，应从低浓度到高浓度顺序加。
4. 加入３H-TdR最适时机是阴性对照95％以上死亡。
5. 为了增加检测方法的敏感性，可采用新复苏7TD1细胞，或用pH4.0枸椽酸缓冲液处理培养状态的7TD1细胞。
干扰素(IFN)生物学活性检测
撰稿金伯泉
干扰素(IFN)根据其产生细胞不同和理化性质、犐z物学特性的差异可分为α干扰素(IFN-α)、β干扰素(IFN-β)和γ-干扰素(IFN-γ)。它们在机体免疫调节、抗病毒感染中具有重要作用。检测IFN的方法主要分为定量测定(常用ELISA)和生物学活性的检测，后者较为常用。
(一)原理
干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
(二) 操作步骤
96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN，
每个稀释度设3孔，每孔50μl，病毒对照不加IFN
↓
每孔加入100μl 1.5～2×10５／ ml Wish
或Hep-2细胞悬液，37℃、CO 孵箱培养6～12h，
使细胞贴壁为单层
↓
每孔加入50μl含100个TCID50 VSV,
细胞对照不加病毒液
↓
根据细胞病变状态，终止培养前3～4h
加入5mg／ml MTT, 15μL／孔
↓
加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸
弃去悬浮病变细胞和死细胞
↓
200μl／孔二甲亚砜(DMSO)，作用10min
↓
测OD(570nm),表示活细胞中含甲的量，
也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法
测定IFN对活细胞的保护水平
计算:
以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。
(三) 试剂和器材
1. VSV
2. WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。
3. MTT[3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐]，二甲亚砜(DMSO)，
刚果红，结晶紫等。
4. 10％FCS RPMI1640, 培养板、培养瓶、CO 孵箱、超净台、酶联检测仪。
(四) 注意事项
1. 实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。
2. 本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性
测定
撰稿黄传书
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。
(一) 原理:
TNF-α受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据TNF-α与相应靶细胞结合后引起不同的生物学效应，建立了多种检测TNF-α生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的TNF-α受体与TNF-α结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤能力，来反映TNF-α的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用3H-TdR标记，则被杀伤后３H-TdR释放至细胞外，牽I通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR的量来反映TNF-α的杀伤活性。
(二) 操作步骤:
0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的L929细胞
↓
用RPMI1640洗涤细胞后，调整细胞浓度至2×10６／ml
↓
加入３H-TdR，20μci／ml
↓
置37℃，5％CO 培养箱中2～3h，摇动1次／30min
↓
用RPMI1640洗涤2次，800rpm×5min／次
↓
调整细胞浓度至2～3×10５／ml后，加入96孔
培养板中，100μl／孔
↓
加入不同稀释度的待测样本(设三个重复孔)
↓
加入放线菌素D，使放线菌素D最终浓度至1μg／ml
用时设放线菌素、完全培基阴性对照和rTNF-α标准
品阳性对照
↓37℃, 5％CO 培养中24h
加入3％胰蛋白酶和0.25％DNA酶各10μl／孔
↓37℃，30min
用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于
"9999"型玻璃纤维滤纸上
↓
烤干后，进行β计数
结果判定:
1. TNF-α作用24h后，在倒置显微镜下判定50％L929细胞杀伤的稀释度即为１个TNF-α活性单位。
2. 根据测得的cpm值按下列公式计数活性单位:
TNF-α活性单位(U／ml)
放线菌素D对照组cpm-实验组cpm
＝──────────────×标准品活性单位×待测样品稀释倍数
放线菌素D对照组cpm-标准品cpm
(三) 试剂和器材:
1. 鼠成纤维细胞(L929)
2. rTNF-α和待测样品
3. 放线菌素、DNA酶、胰蛋白酶
4. 10％FCS RPMI1640，RPMI1640
5. ３H-TdR，PPO，POPOP、二甲苯，玻璃纤维滤纸
6. 96孔培养板、无菌吸管、滴管、试管、加样器和加样器头
7. CO 培养箱、倒置显微镜、超净台等
(四) 注意事项:
1. 用于标记３H-TdR的L929细胞要处于对数生长期，否则３H-TdR掺入率低，影响实验结果。
2. 标记后的L929细胞应充分洗涤，以洗掉游离的３H-TdR，牱q则会影响完全培基对照组cpm值。
3. 胰蛋白酶和DNA酶浓度和消化时间要严格控制，犆?批酶均要摸索最适浓度和时间。否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素D，但浓度不宜过大，一般最终浓度为0.5～1μg／ml。
5. 在测定PHA等丝裂原诱导的PBMC培养上清时，要注意排除TNF-β(淋巴毒素)的影响。因为TNF-β细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与TNF-α相似。
细胞因子详解
捋捋让人迷惑的细胞因子 细胞因子是一类调节蛋白或者糖蛋白，他们的分类现在还不是完全清楚。他们通过结合细胞表面的特定受体，激发细胞内信号通路起作用。 白细胞组成了免疫和炎症系统，大多数细胞因子作用于白细胞或者由白细胞表达，他们在免疫和炎症反应中起到重要的调节作用。实际上，一些免疫抑制和抗炎作用的药物就是通过调节这些细胞因子的表达起作用的。 细胞因子由特定的细胞表达并分泌到胞外，结合细胞表面的细胞因子受体后激活细胞内信号 传导通路 细胞因子分类 细胞因子最早在20世纪70年代中期被提出，它当时被认为是一种多肽因子，可以调控细胞分化和免疫系统。干扰素（IFNs）和白介素（ILs）是主要的多肽家族，在当时细胞因子主要指这两类家族。 起初细胞因子的分类主要是根据分泌该因子的细胞类型或者细胞因子初次被发现时的生物活性。然而这些分类方法现在看来都不够准确，无法满足后期的分类需求。最近，根据细胞
因子一级，二级和三级结构的分析，可以将大多数的细胞因子分为6大家族。因此，根据分类方式的不同，某些细胞因子会有多个名称。 表1：细胞因子根据结构分类结果 细胞因子家族成员 ‘β-Trefoil’ cytokines Fibroblast growth factors Interleukin-1 Chemokines Interleukin-8 Macrophage inflammatory proteins ‘Cysteine knot’ cytokines Nerve growth factor Transforming growth factors Platelet-derived growth factor EGF family Epidermal growth factor Transforming growth factor-αHaematopoietins Interleukins 2–7, -9, -13 Granulocyte colony stimulating factor Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Leukaemia inhibitory factor Erythropoietin Ciliaryneurotrophic factor TNF family Tumour necrosis factor-α and –β
围术期炎症细胞因子的监测
围术期炎症细胞因子的监测 围手术期是围绕手术的一个全过程，从病人决定接受手术治疗开始，到手术治疗直至 基本康复，包含手术前、手术中及手术后的一段时间，具体是指从确定手术治疗时起，直 到与这次手术有关的治疗基本结束为止，时间约在术前5- 7天至术后7 - 12天。 炎症反应一方面通过致炎因子直接损伤血管内皮，另一方面主要是通过一系列炎症介 质来实现；多数炎症介质通过与靶细胞结合发挥活性，炎症介质作用于细胞后可进一步引起 靶细胞释放次级炎症介质从而放大或抵消初级炎症介质的作用。不管机体遭受何种刺激， 宿主对炎症反应的总体特征非常相似，然而不同的损伤涉及不同类型的细胞，导致不同炎 症介质的产生和释放从而引起系统性和局部性损伤。通常术中的炎症反应与细胞因子的释放有关，细胞因子的作用又进一步加强了手术以及术中缺血再灌注损伤，如此恶性循环终将导致组织损伤而增加手术后临床相关并发症，影响患者的预后。 目前，手术方式以及麻醉方法、药物对恶性肿瘤术后免疫功能的影响逐渐受到重视。细 胞因子是机体免疫及炎症反应中细胞之间交流的信息分子，它们通过效应细胞表面相应的 受体对细胞生长、成熟和修复产生调控作用。创伤、应激、感染等是影响围术期病死率的 重要因素，与机体免疫状态密切相关。本文旨在总结各种炎症因子的特点、围术期使用不同药物和麻醉方式对炎症细胞因子的影响，提高患者围术期安全，从而改善患者的预后。 1. 炎症细胞因子 多达20%的肿瘤源自于慢性炎症，大部分的实体瘤都有炎性渗出物。免疫细胞对肿瘤 的发生、生长和进展有着广泛的影响，并且很多这些效应都是由促炎症细胞因子介导。在所有细胞因子中，TNF和IL-6具有促进肿瘤发生的效应，这一点是可以确定的。TNF和IL-6 作为肿瘤相关炎症和肿瘤形成的主要调节因子，使得它们在癌症的辅助治疗中成为很受欢迎 的研究目标。因此在围术期对患者进行炎症细胞因子的检测具有重要的临床意义。
细胞因子的ELISA方法检测
实验报告
1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。 2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。 3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。 4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。 5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2. 6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。 7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。 8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。 9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。 11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃动酶标板混匀。将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。 13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。 14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。 15.用酶标仪在450nm处测OD值。结果如下： 16. 分析结果： 将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。
我国大规模细胞培养生物反应器综述
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点： l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
细胞因子6项临床意义
6 项细胞因子检测试剂盒 检测靶标 促炎因子： IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、 抑炎因子：IL-4、IL-10、 本项目涵盖由Th1、TH2、Th17、单核/巨噬细胞、树突细胞等多种细胞分泌的细胞因子，可更全面的反映疾病状态下机体免疫系统的改变。 重症疾病 细胞因子水平是早期预警全身炎症反应综合证（SIRS）的灵敏指标，SIRS 发生时IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α等细胞因子大幅升高，是反映SIRS 的关键细胞因子。对于临床重症患者，如脓毒症、不明原因发热、急性胰腺炎、重症肺炎、围手术期等患者，若发生SIRS 不能及时治疗，则易引发ARDS 和MODS，死亡率高达40-60%，因此，越完善的因子种类更有利于反映患者的细胞因子风暴，进而警醒临床医生及时干预。 IL-4 是机体Th2 细胞特异性分泌的细胞因子，IFN-γ是机体Th1 细胞特异性分泌的细胞因子，临床中多用IFN-γ/IL-4 来反映机体Th1/Th2 漂移水平，Th1/Th2 漂移是评估肿瘤疾病病情的重要指标； 自身免疫性疾病 IL-17 几乎参与所有自身免疫疾病的炎症反应，是自身免疫性疾病炎症损伤 评估的主要指标 感染/炎症相关疾病 IL-6、IFN-γ、TNF-α是感染患者主要升高的促炎因子，IL-4、IL-10 是机体最主要的抗炎因子，检测促炎/抗炎因子变化情况可评估感染病情进展及预后疗效。 细胞因子谱鉴别脓毒症和噬血细胞综合征（HLH） 脓毒症：IL-6 显著升高，IL-10 升高较明显 噬血细胞综合征：IFN-γ和 IL-10 显著升高
革兰氏阴阳性菌细胞因子谱 G-BIRCP：我们将 IL-6、 IL-10 同时高度增高＞10 倍（ X＋S），定义为革兰氏阴性菌感染相关细胞因子谱（ G-BIRCP）G+BIRCP：将 IL-6 为轻度增高＞2 倍甚至>10 倍（ X＋S），但 IL-10 正常或增高值＜10 倍（ X+S）者，定义为革兰氏阳性菌感染相关细 胞因子谱（ G＋BIRCP） 噬血细胞综合征（HLH）细胞因子谱 IFN-γ＞100pg/mL, ，IL-10＞60pg/mL ,且 IFN-γ水平高于 IL-10 水平。该标准对于 HLH 诊断的敏感度和特异性分别达到 88.0%和 98.7%，且阳性预测值和阴性预测值达到了 93.6%和97.5%。 细胞因子在不同类型疾病中的结果解读 1、常见细菌感染/病毒感染相关细胞因子 2、常见自身免疫性疾病相关细胞因子
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。 活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被
细胞因子及分类
细胞因子的基本概念与种类 2008-11-19 13:38 【大中小】 细胞因子（CK）是由活化免疫细胞和非免疫细胞（如某些基质细胞）合成分泌的能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应的小分子多肽或糖蛋白，是不同于免疫球蛋白和补体的又一类免疫分子。 根据来源最初将活化淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子（LK），将单核-吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子（MK）。目前根据功能，可将细胞因子粗略分为以下6类： 1.白细胞介素 白细胞介素（IL）简称白介素，最初被定义为由白细胞产生，在白细胞间发挥作用的细胞因子。虽然后来发现它们的产生细胞和作用细胞并非局限于白细胞，但这一名称仍被沿用。 目前已报道的白细胞介素有18种，摘要列表如下： 2.干扰素（IFN） 干扰素是最先发现的细胞因子，因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称为干扰素。根据来源和理化性质，可将干扰素分为α、β和γ三种类型。IFN-α/β主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，称为Ⅰ型干扰素。IFN-γ主要由活化T细胞和NK细胞产 生，称为Ⅱ型干扰素。 丙型干扰素生物学性能比较详见下表： 3.肿瘤坏死因子（TNF） 肿瘤坏死因子是一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子。1975年Garwell等将卡介苗注射给荷瘤小鼠，两周后再注射脂多糖，结果在小鼠血清中发现一种能使肿瘤发生出血坏死的物质，称为肿瘤坏死因子。肿瘤坏死因子分为TNF-αTNF-β两种，前者主要由脂多糖/卡介苗活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶病质素；后者主要由抗原/有丝分裂原激活的T细胞产生，又称淋巴毒素。TNF-α/β为同源三聚体分子，主要生物学作用如下： （1）对肿瘤细胞和病毒感染细胞有生长抑制和细胞毒作用； （2）激活巨噬细胞、NK细胞，增强吞噬杀伤功能，间接发挥抗感染、抗肿瘤作用； （3）增强T、B细胞对抗原和有丝分裂原的增生反应，促进MHC-Ⅰ类分子表达，增强 Tc细胞杀伤活性； （4）诱导血管内皮细胞表达粘附分子和分泌IL-1、IL-6、IL-8、CSF等细胞因子促进炎 症反应发生； （5）直接作用或刺激巨噬细胞释放IL-1间接作用下丘脑体温调节中枢引起发热； （6）引起代谢紊乱，重者出现恶病质。 4.集落刺激因子（CSF）
乳腺癌相关细胞因子
众所周知细胞因子是由免疫原或其他因子刺激细胞所产生的具有信息传递功能的蛋白质或多肽。它既是机体免疫系统应答的效应成分，又是免疫细胞间进行信息传递的介质。大多数细胞因子对乳腺癌细胞具有抑制生长、促进凋亡的负面作用，同时具有促进生长繁殖、为侵袭转移提供条件的作用。这与细胞因子的浓度，癌细胞的恶性程度，癌细胞生长的微环境等因素有关，这些细胞因子的相互作用及其临床意义值得关注。 在部分地区，乳腺癌的发病率已居于妇女恶性肿瘤发病率首位。细胞因子（CK）是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导免疫效应细胞和相关细胞合成、分泌的，具有生物活性的一类蛋白或多肽。近年来研究表明乳腺癌与细胞因子密切相关。 1 细胞因子对肿瘤细胞的作用 1.1 细胞因子对肿瘤细胞生长的促进作用表现在以下几方面 ①介导乳腺癌细胞逃避免疫监视：研究发现肿瘤细胞招募的调节性T细胞可能在逃避免疫监视方面起着主导作用，从肿瘤中去除Treg细胞后，宿主免疫系统能有效地排斥早晚期肿瘤[1]。 ②促进血管的生成，为肿瘤生长提供营养。 ③促进肿瘤细胞的侵袭与转移。TNF和IL-1促进内皮细胞表达粘附分子，而肿瘤表达的粘附分子受体能使其实现转移。 1.2 细胞因子的抗肿瘤作用 ①对肿瘤细胞的直接杀伤，如TNF-α； ②促进宿主的抗肿瘤免疫； ③影响肿瘤血供，减少营养来源； ④刺激造血形成，解除放疗、化疗对免疫的抑制。 2 乳腺癌相关的细胞因子
2.1 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的特异性最高的刺激血管生成的因子。人VEGF基因位于6p21.3，长度大约为14kb。VEGF基因的表达与缺氧、细胞分化、雌激素和细胞因子有关。在乳腺肿瘤的生长过程中，肿瘤细胞产生蛋白水解酶分解原有的血管基底膜，血管内皮细胞在肿瘤细胞产生的VEGF诱导下，形成毛细血管芽向肿瘤方向运动，最后形成毛细血管[2]。但这些新生的毛细血管基底膜不完整，管壁通透性高，利于肿瘤的血行转移。免疫组织化学分析，结果表示VEGF在乳腺癌肿瘤样本中的表达率为39.8%，但是没有在临近的正常组织中表达。值得注意的是，VEGF阳性患者的5年生存率明显低于VEGF阴性患者。 2.2 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子（TNF）有a、b两型，都具有参与免疫应答、引起恶病变的作用。但TNF-α对肿瘤的作用，存在不同的观点。有学者认为TNF-α起到直接和间接杀伤或抑制肿瘤的作用，其作用机制为TNF-α和癌细胞上的TNF-α受体结合，内移入细胞裂解其DNA。但也有一些学者认为TNF-α对肿瘤有促进作用。其促进作用可能通过以下几种途径： ①促进肿瘤细胞存活，肿瘤细胞产生的TNF通过诱导依赖于NF-κB的抗凋亡分子的表达促进肿瘤细胞存活。 ②促进肿瘤血管的新生：局部大剂量的TNF-α可以破坏肿瘤血管，但小剂量持续的TNF-α可以促进血管生成，有利于肿瘤的生长和扩散。 ③抑制T细胞和巨噬细胞的细胞毒作用而损坏免疫监视。 2.3 转移生长因子-β 转移生长因子-β（TGF-β）是一种丝裂原活化蛋白激酶，将细胞外信号传至细胞内，参与细胞的生长、分化、增殖的调节及恶性转化，与乳腺癌的发生、发展有关。TGF-β对不同时期
细胞因子检测方法综述
细胞因子检测方法综述 细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称[1]。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。 但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素[2]。 目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类 一.生物学检测法 生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测[2]。生物活性检测法又可分为以下几类： 1．细胞增殖法 许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。 4．细胞病变抑制法 病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。 二、免疫学检测法 细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试
细胞培养用生物反应器
细胞培养用生物反应器 细胞培养用生物反应器 2010年12月22日 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L规模，100L 的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学
细胞因子的作用特点
细胞因子的作用特点 目前发现并正式命名的细胞因子有数十种，每种细胞均有其独特的、起主要作用的生物学活性。尽管种类繁多、产生细胞和作用细胞多样、生物学活性广泛、发挥作用的机制不同，但众多的细胞因子具有以下共同的特性： 1．天然细胞因子是由细胞产生的正常的静息或休止（resting）状态的细胞必须经过激活后才能合成和分泌细胞因子。通常是由抗原、丝裂原或其它刺激物激活免疫细胞和相关细胞，6～8小时后细胞培养上清中即可检测出细胞因子，于24～72小时期间细胞因子水平最高。但是有些细胞株不需外源刺激就可以自发地分泌某些细胞因子。 2．细胞因子的产生和作用具有多向性(pleiotropism)即单一刺激如抗原、丝裂原、病毒感染等可使同一种细胞分泌多种细胞因子，而一种细胞因子由多种不同类型的细胞产生可作用于多种不同类型的靶细胞。 3．细胞因子的合成和分泌过程是一种自我调控的过程通常情况下，细胞因子极少储存，即不以前体形式贮存在细胞内，而是经过适当刺激后迅速合成，一旦合面后便分泌至细胞外以发挥生物学作用，刺激消失后合成亦较快地停止并被迅速降解。 4．为低分子量的分泌型蛋白质常被糖基化。分子量大小不等，大多数为15～30kD，小者仅8～10kD，一般不超过80kD。 5．细胞因子需与靶细胞上的高亲和力受体特异结合后才发挥生物学效应。 6．生物学效应极强细胞因子在pM(10-12M)水平就能发挥显著的生物学效应。这与细胞因子与靶细胞表面特异性受体之间亲和力极高有关，其解离常数在10-12～10-10M之间。 7．单一细胞因子可具有多种生物学活性，但多种细胞因子也常具有某些相同或相似的生物学活性。 8．主要参与免疫反应和炎症反应影响反应的强度和持续时间的长短。涉及到感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫等诸多方面。 9．以非特异性方式发挥生物学作用且不受MHC限制。
细胞因子检测
细胞因子检测 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。 1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。 2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)?的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。 3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。通过检测细胞细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。 . .
一、IL-1的检测(生物活性测定) 产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。IL-1可分为IL-1α(?也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。两者的分子量和生物活性相似,?只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。IL-1?的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代率为指标来表示。本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。 （一）IL-1的诱生 体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用 P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。 1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。 2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液(5?％?NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(含腹腔细胞),反复抽吸几次。 . .
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。 该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，
动物细胞培养生物反应器的操作模式讲课讲稿
动物细胞培养生物反应器的操作模式
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。
该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；(2)直观的反应细胞生长代谢的过程。由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反应细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；(3)可直接放大。由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。 分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期，见图1。分批培养的周期时间多在3~5天，细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（48~72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。 图1 分批式培养动物细胞生长曲线
细胞因子概述
1促炎细胞因子 1.1 白介素-1(interleukin-1，IL-1) IL-1是一种能激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞 因子，主要由单核/巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌. IL-1包括两种由不同基因编码产生的分子质量均为17 ku左右的多肽分子IL-1α(p15.0)和IL-1β(p17.0)，前者为分泌型，而后者则多与细胞结合. IL-1β能通过自分泌或旁分泌刺激其他CK和炎症递质的产生，诱发抗原提呈细胞表面免疫分子的表达，为T淋巴细胞的活化提供第二信号，促进B细胞的增生、分化，介导免疫球蛋白的分泌，由此激活补体，增强细胞免疫和体液免疫介导的组织损伤过程.此外，IL-1β还能促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，从而引起一系列肠道炎症反应和组织破坏，其细胞因子mRNA的表达与UC 的炎症程度成正相关，可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标[1]. 1.2 白介素-6(IL-6) IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，其生物学效 应类似于IL-1β. IL-6可以通过STAT-3途径激活NK-κB而诱导细胞间黏附分子(ICAM-1)的极化表达，后者是在炎性肠病患者中性粒细胞-上皮细胞间相互作用中起重要作用的一种黏附颗粒.因而，在慢性肠道炎症的发病机制中起至关重要的作用[2]. IL-6在急性炎症反应中的作用主要表现为对多种细胞的促炎作用和诱导肝组织产生急性反应蛋白，故活动期CD患者的血清IL-6水平比健康成人显著升高. 1.3 白介素-8(IL-8) IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，由单核细胞、上 皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF和外源性因子细菌多糖(LPS)的刺激下产生，主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞，促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用，对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用.目前认为TNF、IL-1、IL-6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以IL-8为代表的趋化因子所介导的.UC患者IL-8水平显著升高，且与病灶的大体炎症程度成正相关，尤其是有大量中性粒细胞浸润的隐窝脓肿的溃疡性结肠炎患者，其mRNA检测可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标. 1.4 白介素-12(IL-12) IL-12是由一分子质量为40 ku的p40亚基及一分子质量为35 ku 的p35亚基组成的分子质量为70 ku的杂二聚体(p70). p35由T、B、NK细胞及单核细胞等产生，p40主要由活化的单核细胞及B细胞产生. IL-12是最强的NK细胞激活因子，能促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞，刺激NK和T细胞产生多种细胞因子，如IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-3、IL-8等，再通过这些递质发挥作用.已报道IL-12在IBD患者尤其是CD患者的血清有明显升高. 1.5 白介素-15(IL-15) IL-15与IL-2相似，也是由不同类型的细胞产生.他以IL-2rβ和γ链的 成分作为其信号传导，可结合T细胞、B细胞、NK细胞以及上皮细胞的相应受体，促进这些细胞的活化、增生，抑制其凋亡以及促进前炎性细胞因子的合成，如促进T细胞分泌TNF-α、IFN-γ.中重度活动的UC患者表达IL-15的外周血单核细胞百分比增加，可能是因为体内细胞激活而使血清IL-15释放增加.活动性IBD治疗2 wk内表达IL-15的细胞数下降. 1.6 白介素-16(IL-16) IL-16是趋化因子，可由CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、 上皮细胞等多种细胞受刺激而分泌，主要通过CD4途径起作用，但可不依赖CD4作用于靶细胞. IL-16可刺激单核细胞产生IL-6，TNF-α，IL-15等，其具体作用机制还有待进一步的研究. 1.7 白介素-17(IL-17)白介素-17是一相对分子质量为Mr(20-30)×103的糖蛋白，主要由 基质细胞产生. IL-17是T细胞诱导和促进炎症发生过程中的一种重要的可溶性因子.他可促进中性粒细胞的发育成熟，并且刺激上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等产生IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎症递质，增加纤维母细胞表面ICAM-1的表达.另外，IL-17还可促进补体C3等急性期反应蛋白的产生，在炎症发生过程中起重要的调控作用.UC肠道病变部位的肠黏膜固有层单个核细胞(1amina
细胞因子的分子生物学检测法
细胞因子的分子生物学检测法 细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。特定细胞因子mRNA表达水平的检测有助于判断细胞表达该细胞因子的水平；而细胞因子DNA的检测可以判断该细胞因子基因存在与否及其变异情况。常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检测。 一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量 本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。由于其操作比Northern印迹简单、迅速、所需样品量少，且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。 下面以检测培养细胞的IL-2 mRNA含量的检测，说明斑点杂交法的操作过程。只要改变相应的DNA探针，此方法也适用与其他细胞因子mRNA含量的检测；或者改变RNA的提取方法，也适用于其他类型细胞的检测。 二、原位杂交法测定TNF的mRNA
RNA-DNA原位杂交的原理与分子杂交其它方法的原理相同。但是其它方法都是将RNA提取出来后进行分子杂交，而原位杂交则是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。将细胞以适当方法固定后，除去脂类并适当消化细胞内的蛋白质，增大细胞对大分子物质的通透性，使DNA探针便于出入细胞。与免疫组化相结合，原位杂交可以将显微镜下的组织形态学资料与DNA，mRNA，蛋白质水平的基因活动联系起来。进行分子杂交之后，将玻片上细胞置与显微镜下观察，可确定不同细胞内的基因表达定位情况。 三、反转录PCR(RT-PCR)定量检测细胞因子的mRNA 细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR?是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。然后以cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩增，使微量细胞因子的RNA经放大后检出，常用的细胞因子引物见表 8-1。RT-PCR能检出单个细胞中少于10个拷贝的特异?RNA，如同时放大内参照物（如表8-1中的b-Actin），即可对RT-PCR检出的细胞因子mRNA进行定量。 细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法
细胞因子检测
细胞因子检测 细胞因子就是由免疫细胞与某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌得一类生物活性物质分泌得蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞得增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用、某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病得发病及病理过程。 1、免疫学检测法其基本原理就是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、ELISA法、ＲIＡ法与免疫印迹法等均已用于细胞因子得检测。 2。、生物学测定法其原理就是根据细胞因子对特定得依赖性细胞株(即靶细胞)?得促增殖作用,以增殖细胞中得DNA得合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子得活性单位,如对IＬ-1、ＩL-2等细胞因子活性得检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞得杀伤效应或对病毒得抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素得生物活性测定。 3、分子生物学测定法目前采用得技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交与ＰCＲ等。通过检测细胞内细胞因子得基因组成或mRNA量,推算出细胞因子得合成量、 一、IL-1得检测(生物活性测定)
产生IL—1得细胞种类很多,其中最主要得为单核－巨噬细胞、ＩL—1可分为IL —１α(?也称酸性IL—１,pI=5。0)与IL－1β(中性ＩL－1,pI=7。0)、两者得分子量与生物活性相似,?只能用抗体检测方法才能区别,常用得生物学测定法对两者都适用。ＩＬ-1?得生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10Ｇ4、1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。ＩL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdＲ或125I—ＵdR得ＤＮA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。本试验介绍Ｌ929细胞增殖MTT比色法、 (一)IＬ-1得诱生 体外试验可用ＬPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P3８ 8D1(鼠),TＨP-1(人)细胞株制备ＩL－1、本试验以小鼠巨噬细胞制备IL—１。 1、取6~１0周龄BALB/c或Ｃ5７ＢL/６小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒、 2、用带9号针头得5ml注射器腹腔注入5ml冷得含5％小牛血清得Hａｎｋs 液(５?％?NＢS—ＨBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。 3、1500ｒ/min离心8mｉn,洗细胞2次、