PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应

一、实验原理

PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。

PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。

变性

退火

延伸

图反应历程

二、实验材料

1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液

4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂

三、操作步骤

1．细菌染色体DNA的提取（见上一组）

3·反应程序：

将RAPD反应试剂加入EP管中

轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子

打开PCR反应仪输入以下反应数据

●94 摄氏度预变性5min

●94摄氏度变性40s

●40摄氏度退火40s

●72摄氏度延伸1min

将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min

仪器为Model MyGene 25 Plus

三、注意事项

1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性

及全部放入反应体系中。

2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂

时都要换新的灭菌Tip尖。

3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。

4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。

5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚

体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告

综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M

RT-PCR的实验原理与操作步骤复习课程

R T-P C R的实验原理与 操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研https://www.sodocs.net/doc/0919317956.html, 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒

qPCR实验操作流程

Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不

生物实验4 实时定量PCR 实验报告

实验四定量PCR扩增 姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞 一、实验目的 复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程 二、实验原理 实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 三、实验仪器及材料 real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品 四、实验步骤 1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。 2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。 3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、10 4、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。 4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。将加好样的8联管振荡。 5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。 6、扩增后利用软件分析C T值及未知样的定量结果。

RT-PCR实验方法总结大全.

RT-PCR实验方法总结大全 RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。 要求: 1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。 2. RT按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.sodocs.net/doc/0919317956.html,问题: 在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教! 解答: 1.RT-PCR有两种做法:

条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无 RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。 有关内参: RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just

QPCR原理及应用

QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR

DNA提取及PCR扩增实验报告.doc

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳1131428 环境科学 一、实验目的 1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热T aq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 三、实验材料 仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。 四、实验步骤 1. PCR扩增 本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 1.1 根据计算，首先取1.5ml离心管按照 2.5ul 10×Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下： 预变性：94℃3min 循环：94℃变性30s 55℃退火30s 72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min

PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程

二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

RT-PCR实验报告课件

逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr （reverse transcription pcr ）和实时pcr （real time pcr ）共同的缩写。逆转录pcr ，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反应(pcr) 的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna 链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr 进行dna 扩增。 由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录”，由依赖rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，dna 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna 的dna 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr 。原先的rna 模板被rna 酶h 降解，留下互补dna。 rt-pcr 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna 。rt-pcr 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna 的含量。（检测基因表达的方法，参见northern blot 法。） rt-pcr 有时候也会指代实时pcr(real-time pcr) 。为了与逆转录pcr 相区别，通常被写作“定量pcr ”(quantitative pcr) 或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr) 。 实时pcr 实时pcr(real-time pcr) ，属于定量pcr （q-pcr ）的一种，以一定时间内dna 的增幅量为基础进行dna 的定量分析。real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。 一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序 列相结合的一种萤光探针（probe ）。real time pcr 与reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr （quantitative rt-pcr ）” rt-pcr 技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna 引物 amv （m-mlv）：逆转录酶 dntp ：脱氧核苷酸 rnase ：rna 酶抑制剂 pcr buffer ：rt-pcr 缓冲液 mgcl2 ：2 价镁离子 pcr 各步骤的目的 （一）预变性： 破坏dna 中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna 充分变性，减少dna 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna 模板，最好不要吝 啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq 酶的反应中，还可激活taq 酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。 （二）变性-- 退火-- 延伸循环： ①模板dna 的变性：模板dna 经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna 双链或经pcr 扩增形成的双链dna 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板dna 与引物的退火( 复性) ：模板dna 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna 单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：dna 模板-- 引物结合物在taqdna 聚合酶的作用下，以dntp 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链。 （三）pcr 仪扩增循环后72 度延伸10 分钟 用pcr 仪扩增时,( 变性. 退火, 延伸) 循环完成后, 继续72 度延伸了10 分钟的原因：

实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

(待分)rtpcr原理和实验步骤

原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：

PCR实验报告

PCR实验报告 7月19日高遄 实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： ●PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。 ●基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。 （1）双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 （2）DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。（3）在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板 DNA。 （4）由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。 （5）整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 ●试剂作用： （1）引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物 （2）Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。 （3）Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 （4）Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 （5）dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。 （6）石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。 ●试剂配置体积： （1）热启动：94℃，5~10min （2）变性：94℃，45~60s。 （3）退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。 （4）延伸：72℃，1~1.5min。 （5）步骤（2）~（4）热循环25~30个周期 （6）保温：延伸72℃，10min ●产物检测：凝胶电泳。

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。 2. 震荡30s。 3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000×g，4℃离心，15min。 5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。 7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4℃离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。 二、逆转录合成cDNA第一链 反应体系如下

混匀快速离心一次反应条件如下 -20℃ 冰箱冻存三、PCR反应 混匀快速离心一次反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存 取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。 RT-PCR实验方法总结1,2 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.sodocs.net/doc/0919317956.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR 的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应

RT-PCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有

定量PCR的实验步骤。

定量PCR的实验步骤 一、标准曲线的标准DNA样品准备 1.将目的片段进行克隆，对克隆得到的阳性菌落进行质粒DNA的提取和纯化（试剂盒），纯化后的质粒DNA纯度用DO260/DO280的比值来鉴定，纯的DNA比值应该在1.8-1.9之间，如果比值大于1.9的时候表示有RNA污染，小于1.6的时候表示有蛋白质的污染（DO260的1OD值相当于50ng/ul的双链DNA 或33ng/ul的单链DNA或40ng/ul的RNA）； 2.采用紫外分光光度法（DO260 nm）测定质粒DNA的吸光度DO260值为A，（B=1DO260=50 ng/ul），由于载体质粒序列和插入的目标片段的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出单个质粒DNA （阳性质粒）的分子量C (ng/mol)，进而计算标准品的拷贝数D(copy/uL)： 拷贝数D=A×B C ×6.02×1023(copy/ul) 3.将2步骤中计算出来的已知拷贝数的质粒DNA以10倍为梯度进行稀释，稀释7个系列（各个梯度的浓度一般为101～107），作为标准曲线的DNA模板； 二、未知样品的定量标定 模板质粒DNA每个梯度设置3个平行样。未知样品设置2个平行样，同时设置一个没有质粒DNA的阴性对照。（定量实验，误差是不可避免的，设立平行样，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小，以满足小样本统计的要求；确保数据的有效性，排除假阳性的干扰，必须设置阴性对照，阳性对照有标准样品就做，没有标准样品就可以省略不做）； 2.按照下面的程序进行荧光定量PCR反应： 95℃ 3 min 95℃10 s 58℃20 s 40个循环 72℃20 s

实验二PCR扩增(聚合酶链式反应)

实验二 PCR扩增（聚合酶链式反应） 一、实验目的 1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法； 2.掌握聚合酶链式反应操作过程。 二、实验原理（聚合酶链式反应） PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。 反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1-2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40-60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2-4min，一次PCR经过30-40次循环，约2-3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验步骤

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.sodocs.net/doc/0919317956.html, 问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另

一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无