11月13日
引物合成的详解
4.需要什么级别的引物?
答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求
一般PCR扩增<45 base OPC
一般PCR扩增>45 base PAGE
诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE
DNA测序20base左右OPC
亚克隆,点突变等根据实验要求定OPC, PAGE,HPLC
根据实验要求定PAGE
基因构建(全基因合成)
反义核酸根据实验要求定PAGE
PAGE, HPLC
修饰引物根据实验要求定
8.如何计算引物的浓度?
答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成
10-50pmol/ul。一般情况下,建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积(微升)按下列方式计算:V (微升)= OD数*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。
注意:1 OD260= 33 ug/ml.
9.如何计算引物的Tm值?
答:引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中,Size = 引物长度。
11.如何溶解引物?
答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。
12.如何保存引物?
答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
13.合成的引物5’端是否有磷酸化
答:合成的引物5’为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化,或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化,需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连
接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。
16.长链引物为什么出错的几率非常高?
答:引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?
答:下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5’端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。
有用的荧光染料参数
colors
Name
吸收波长发射波长
6-FAM (6-carboxy-fluorescein)494nm518nm Green
TET (5-tetrachloro-fluorescein)521nm 538nm Orange
HEX (5-hexachloro-fluorescein)535nm 553nm Pink
TAMRA(tetramethyl-6-carboxyrhodamine)560nm582nm Rose
ROX (6-carboxy-x-rhodamine)587nm607nm Red
Cy3 (Indodicarbocyanine)552nm570nm Red
Cy5(Indodicarbocyanine)643nm667nm Violet
20.Primer设计的基本原则是什么?
答:引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。
◆如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?
答:引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?引物化学合成,哪里有机会污染到蛋白质?需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同
聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66
22.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?
答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。
23.引物不纯会有什么后果?
答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
24.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?
答:如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准
确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
25.PCR扩增不出就引物有问题吗?
答:基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见(1) RT-PCR。请注意,很多基因通过常规RT –PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。(2)从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH。
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保护碱基列表
AccI G GTCGAC C
CG GTCGAC CG
CCG GTCGAC CGG
8
10
12
AflIII C ACATGT G
CC ACATGT GG
CCC ACATGT GGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
AscI GGCGCGCC
A GGCGCGCC T
TT GGCGCGCC AA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
AvaI C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
8
10
12
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamHI C GGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC GCG
8
10
12
10
>90
>90
25
>90
>90
BglII C AGATCT G
GA AGATCT TC
GGA AGATCT TCC
8
10
12
75
25
>90
>90
BssHII G GCGCGC C
AG GCGCGC CT
TTG GCGCGC CAA
8
10
12
50
>90
BstEII G GGT(A/T)ACC C 9 0 10
BstXI AACTGCAGAA CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 22
24
27
25
25
50
>90
ClaI C ATCGAT G
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
8
8
10
12
>90
50
>90
50
EcoRI G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HaeIII GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HindIII C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
8
10
12
10
75
KpnI G GGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
MluI G ACGCGT C
CG ACGCGT CG
8
10
25
50
NcoI C CCATGG G
CATG CCATGG CATG
8
14
50
75
NdeI C CATATG G
CC CATATG GG
CGC CATATG GCG
GGGTTT CATATG AAACCC
GGAATTC CATATG GAATTCC
GGGAATTC CATATG GAATTCCC
8
10
12
18
20
22
75
75
>90
>90
NheI G GCTAGC C
CG GCTAGC CG
CTA GCTAGC TAG
8
10
12
10
10
25
50
NotI TT GCGGCCGC AA
ATTT GCGGCCGC TTTA
AAATAT GCGGCCGC TATAAA
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 12
16
20
24
28
10
10
25
25
10
10
90
>90
NsiI TGC ATGCAT GCA
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 12
22
10
>90
>90
>90
PacI TTAATTAA
G TTAATTAA C
CC TTAATTAA GG
8
10
12
25
>90
PmeI GTTTAAAC
G GTTTAAAC C
GG GTTTAAAC CC
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG
8
10
12
24
75
25
50
>90
PstI G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT
8
14
22
24
26
10
>90
>90
10
>90
>90
PvuI C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA
8
10
12
10
25
10
SacI C GAGCTC G 8 10 10
SacII G CCGCGG C
TCC CCGCGG GGA
8
12
50
>90
SalI GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28
30
32
10
10
50
75
ScaI G AGTACT C
AAA AGTACT TTT
8
12
10
75
25
75
SmaI CCCGGG
C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
6
8
10
10
10
10
50
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90
SpeI G ACTAGT C
GG ACTAGT CC
CGG ACTAGT CCG
CTAG ACTAGT CTAG
8
10
12
14
10
10
>90
>90
50
50
SphI G GCATGC C
CAT GCATGC ATG
ACAT GCATGC ATGT
8
12
14
10
25
50
StuI A AGGCCT T
GA AGGCCT TC
AAA AGGCCT TTT
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
XbaI C TCTAGA G
GC TCTAGA GC
TGC TCTAGA GCA
CTAG TCTAGA CTAG
8
10
12
14
>90
75
75
>90
>90
>90
XhoI C CTCGAG G
CC CTCGAG GG
CCG CTCGAG CGG
8
10
12
10
10
25
75
XmaI C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
CCC CCCGGG GGG
TCCC CCCGGG GGGA
8
10
12
14
25
50
>90
75
>90
>90
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 酶切反应 来源:easylabs 发布时间:2009-11-08 查看次数:12704 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如AccI,A flIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,Eco RI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,NsiI,Pa cI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,SpeI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI, 为什么要添加保护碱基? 在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。 其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基? 添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 单实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260 位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C 条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), , 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。 10 mM MgCl 2 20%的PAGE(7M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切
11月13日 引物合成的详解 4.需要什么级别的引物? 答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增<45 base OPC 一般PCR扩增>45 base PAGE 诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE DNA测序20base左右OPC 亚克隆,点突变等根据实验要求定OPC, PAGE,HPLC 根据实验要求定PAGE 基因构建(全基因合成) 反义核酸根据实验要求定PAGE PAGE, HPLC 修饰引物根据实验要求定 8.如何计算引物的浓度? 答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul。一般情况下,建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积(微升)按下列方式计算:V (微升)= OD数*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。 注意:1 OD260= 33 ug/ml. 9.如何计算引物的Tm值? 答:引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Size = 引物长度。 11.如何溶解引物? 答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。 12.如何保存引物? 答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 13.合成的引物5’端是否有磷酸化 答:合成的引物5’为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化,或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化,需要另外收费。 14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题? 连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连
酶切位点保护碱基表6
PCR引物设计原则 信息来源:本站原创更新时间:2004-12-21 0:44:00 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则 P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特
异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则: ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR 的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表
ApaI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5'GGGCC^C 3' BamHI(类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^GATCC 3' BglII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^GATCT 3' EcoRI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^AATTC 3' HindIII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^AGCTT 3' KpnI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GGTAC^C 3' NcoI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' C^CATGG 3' NdeI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' CA^TATG 3' NheI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^CTAGC 3' NotI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GC^GGCCGC 3' SacI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GAGCT^C 3' SalI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^TCGAC 3' SphI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GCATG^C 3'
各种酶切位点的保护碱基 酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题 参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA,切不开 1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。 2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。 3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。 4)公司出售的限制酶都是液体状态,都是根据最佳反应体系配制了浓度,不可以再用buffer稀释,因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。 不同公司的酶和buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。 5)酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶,或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中,重新制备DNA,也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增,再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响,通常选用GM33做宿主菌转化。 6)底物不纯,含有限制酶阻害物质,影响酶切作用,需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等,都会影响酶切效果。
各种酶切位点的保护碱基酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题 参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积
累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA,切不开 1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。 2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。 3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。 4)公司出售的限制酶都是液体状态,都是根据最佳反应体系配制了浓度,不可以再用buffer稀释,因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。 不同公司的酶和buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。 5)酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶,
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】
各种酶切位点的保护碱基酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题 参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA,切不开 1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。 2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。
寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragme nts (oligo nu cleotides)) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列 含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用r[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1卩已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反 应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCI, 5 mM DTT 及适量的NaCI或KCI (视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 DNA合成,新链的延伸方向是573因此,需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外,还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去,否则 会掉下来.引物的结构就是(573):保护碱基+酶切位点+原来的引物序列 首先要看目的基因中是否含有该酶切位点,只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次,如果需要做表达,需要考虑起始密码子,防止移码突变
DNA合成,新链的延伸方向是5T3因此,需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外,还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform 让它可以结合上去,否则 会掉下来.引物的结构就是(573):保护碱基+酶切位点+原来的引物序列?
引物设计原则及酶切位点选择和设计 [整理]:最初的时候,由于害怕设计酶切位点最后且不开,所以经常采用最通用的方法,用T载体克隆解决问题,但后来发现她也有问题,就是浓度提不上去,你需要体大量的载体来酶切,所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接,当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点,酶切位点是与你的质粒的特点相关的,可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点,进行设计。 (一)设计引物前应做的准备工作: 准备载体图谱,大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析,确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录,便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 (二)设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的,,所连接片断上没有这两个位点,且距离不能太近,往往导致两个酶都切不好。因此,紧挨在一起,只能切一个,除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说,最好隔四个。还有一种情况是:不能有碱基的交叉,比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同buffer的酶。 最好使用较常用的酶(如hind3,bamh1,ecor1等),最好使用自己实验室有的酶,这样可以省钱。 Tm的计算,关于Tm的问题,很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm叫溶解温度(melting temperature, Tm),即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解,这个温度是由互补的DNA区域决定的,而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此,对于引物的Tm,只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时,只计算互补的区域(除非你的酶切位点也与模板互补)。不少战友设计的引物都Tm过低,是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了,最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。所以,设计引物的时候,先不管5'端的修饰序列,把互补区的Tm控制在55度以上(我喜欢控制在58以上,具体根据PCR的具体情况,对于困难的PCR,需要适当提高Tm),再加上酶切位点和保护碱基,这样的引物通常都是可用的,即使有小的问题,也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ,不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物,总长分别为29、33个碱基,去掉酶切位点和保护碱基,分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度,实际用的只有50度,用55度扩的结果也差不多。 其它关于Tm值的计算,有用PP5.0进行评价的,需要考虑的参数包括:base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度,退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去,如上所言,PCR几个循环后,引物外侧的序列已经参入了扩增片断中,所以你可以在预变性后多加几步,温度比你Tm值低些(这样可能会增加非特异性),Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。
内切酶碱基数目和酶 切活性(%) 1 2 3 4 5 AarI 20-50 50-100 AasI 50-100 AatII 0 0-20 20-50 50-100 Acc65I 0-20 50-100 AdeI 50-100 AjiI 50-100 AluI 0-20 20-50 50-100 Alw21I 50-100 Alw26I 50-100 Alw44I 0 20-50 50-100 ApaI 50-100 BamHI 50-100 BauI 0-20 20-50 50-100 BcnI 20-50 50-100 BclI 0 50-100 BcuI 50-100 BfiI 50-100 BfmI 50-100 BfuI 50-100
BglI 20-50 50-100 BglII 0 50-100 Bme1390I 20-50 50-100 BoxI 0 50-100 BpiI 50-100 Bpu10I 20-50 50-100 Bpu1102I 50-100 BseDI 0 50-100 BseGI 50-100 BseJI 0 50-100 BseLI 0 50-100 BseMI 0-20 50-100 BseMII 50-100 BseNI 0 50-100 BseSI 50-100 BseXI 20-50 50-100 Bsh1236I 50-100 Bsh1285I 0-20 50-100 BshNI 50-100 BshTI 20-50 50-100 Bsp68I 0 50-100
Bsp119I 50-100 Bsp120I 20-50 50-100 Bsp143I 50-100 Bsp1407I 20-50 50-100 BspLI 50-100 BspPI 0 50-100 BspTI 0 0-20 50-100 Bst1107I 0-20 50-100 BstXI 0 50-100 Bsu15I 50-100 BsuRI 0-20 20-50 50-100 BveI 0-20 50-100 CaiI 0 0-20 50-100 CfrI 0 50-100 Cfr9I 20-50 50-100 Cfr10I 20-50 50-100 Cfr13I 50-100 Cfr42I 50-100 CpoI 50-100 CseI 50-100 Csp6I 50-100
关于保护碱基 1.首先要明确什么是保护碱基 限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA 作用是有很大影响的,被称为保护碱基。 2.添加保护碱基的目的 在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。但实验证明,大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基,才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR引物时,为保护5` 端外加的内切酶识别位点,人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高酶切时的活性,使酶切完全。 其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 3.添加保护碱基的原则 添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。 一般情况下,普通的内切酶只加入两个保护碱基,其内切反应就可以正常进行;而有一类,仅仅只加入两个保护碱基,其内切反应就不能正常进行,这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类,需要加入至少6个保护碱基,常用的HindIII也要三个。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠
PCR引物设计原则 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则: ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。不能选择A,最好选择T ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA 序列。如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。 在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP 各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。