外成骨诱导培养与成骨细胞活性鉴定
补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响
见表1。 3 讨论 子宫肌瘤育龄期妇女患病率高达20%～25%。我科根据子宫肌瘤“肝郁”、“脾虚”、“血瘀”的病机特点,以疏肝健脾、益气养血、化瘀散结组方制成子胞康胶囊,分别于月经前和月经后服用,不仅能够显著缩小或消除子宫肌瘤瘤体,且能明显降低患者血清雌、孕激素水平[3]。子宫肌瘤的发生主要与长期、大量的雌、孕激素刺激有关[4],本文结果显示:雌激素能使大鼠子宫肌层增厚,肌纤维肥大,结构紊乱;而子胞康胶囊鼠子宫肌层细长,排列规则,肌层厚度亦显著低于模型组,表明其可拮抗雌激素的作用,使子宫肌层的改变全部或部分恢复正常。同时,子胞康胶囊还能明显降低大鼠血清E2、P浓度,以上结果提示,调节雌、孕激素水平为子胞康胶囊治疗子宫肌瘤的作用机理之一。另外,从组织学观察中可见,模型组部分大鼠子宫积水、淤血,子宫内膜及卵巢有较明显的化脓性感染,并有大小不一的脓肿形成。而子胞康胶囊大剂量组完全无此现象,小剂量组偶尔可见脓肿形成,提示子胞康胶囊可能同时具有抗炎、抗菌及改善微循环作用,具体情况有待我们进一步研究。 参考文献 1 香卫红.消瘤丸对雌性激素负荷大鼠子宫肌层影响的实验研究.中医杂志,1998;39(6)∶346 2 盛一方.40例子宫肌瘤外周血和卵巢血的五项激素变化.上海医科大学学报,1995;22(1)∶69～71 3 王永林,苏旭春.雌激素高峰期以中医药治疗子宫肌瘤40例临床观察.湖南中医药导报,2000;6(3)∶23～24 4 孙梅.子宫肌瘤的病因学研究进展.国外医学妇产科分册,1997;24 (3)∶160～163 补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响Ξ 李冬华,朱飞鹏1 (首都医科大学中医药学院,北京 100013;1国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京 100038) 摘 要 目的:观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法:体外培养成骨细胞,观察补肾中药含药血清对成骨细胞增殖率和AL P活性的影响。结果:补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和AL P活性有增强作用。结论:补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。 关键词 成骨细胞;增殖和功能;补肾中药 由肾主骨理论指导下的补肾法在骨代谢疾病的治疗中占有重要地位。现代医学的发展使得我们得以从细胞、分子水平揭示肾在骨代谢中的重要地位。本文通过体外培养成骨细胞,观察补肾中药活性成分对成骨细胞增殖和功能的影响,为补肾中药治疗骨代谢疾病提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 试验药物 补肾中药由菟丝子、何首乌等提取的活性部位组成,由复旦大学药学院提供。 1.2 试剂和仪器 M EM培养基干粉(美国GIBCO 公司产);新生小牛血清(NCS,美国GIBCO公司产);胶原酶Ⅱ(CollagenaseⅡ,Sigma公司产);胰蛋白酶(华美生物公司)。二氧化碳培养箱(德国产),倒置相差显微镜(日本Olympus公司产);光学显微镜(日本Nikon 公司产);酶标仪(美国Bio2Tek公司产)。 1.3 方法1.3.1 大鼠成骨细胞分离培养 出生24h内小鼠10只雌雄兼用,自来水冲洗后放入75%酒精内5min,无菌剪开头部皮肤,手术刀切下颅盖骨,清除骨表面的结缔组织,PBS反复冲洗至骨组织发白,用剪刀将骨组织剪碎至1mm×1mm大小的骨片,0.25%胰蛋白酶5ml 37℃预消化20min,弃消化液,0.1%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm×10min,弃上清,加入适量培养液;将骨片再次用0.1%Ⅱ型胶原酶5ml37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm ×10min,弃上清,加入培养液适量;混匀二次消化的细胞,接种于25cm2培养瓶(3×105/瓶),在5%CO2、95%空气、37℃条件下培养24h后换液一次,以后每3天换液一次,细胞汇合后,0.25%胰蛋白酶消化,3×105/瓶分瓶接种于25cm2培养瓶(第一代细胞),继续培养,汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。 1.3.2 补肾中药含药血清制备 3月龄雄性SD大鼠30只分为3组:中药组、空白组和CMC对照组。中药 23中药药理与临床2005;21(2)Ξ北京市优秀人才培养专项经费资助
小胶质细胞培养及鉴定
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
成骨细胞培养
成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， 25 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。 成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。 阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 ? 茜素红染液 操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用 1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。 2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
软骨细胞培养
软骨细胞培养 (1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。 (2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。 (3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。 (4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。 (5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37℃、5%CO2。 (6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。 (7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。 药物制备 龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成 10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。另外取1ml PBS缓冲液加到9ml含10%胎牛血清的DMEM培养液中，配成10ml 10%PBS的含胎牛血清的DMEM培养液作为空白对照组，放4℃冰箱备用。
成骨细胞培养
成骨诱导液： 地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， Vc尽量分装保存，减少与空气接触， 三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。 成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。 阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 ? 茜素红染液 操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用 1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。 2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
人成骨细胞原代培养
人成骨细胞原代培养 1.人成骨细胞的分离和培养： 在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为 1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2～3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。 2.酶消化法： 加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。 3.组织块法： 将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。传代后剩下的骨片，再加入DMEM完全培养液，37 ℃，体积分数5%CO2孵箱中孵育。如此反复两三次。
浅谈体外培养成骨细胞
浅谈体外培养成骨细胞 张杰 （陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000） 【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。 【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素； 成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。 1 成骨细胞的来源 国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。近年来对脐血干细胞的研究越来越多。并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。此外Wan等渴。报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。 2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
细胞培养与细胞生死状态的鉴别
姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳 科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红 【实验步骤】
成骨细胞培养问题
鄙人做成骨细胞培养检测相关指标，走了许多弯路，今将自己的总结的经验贴出，望后续战友做成骨细胞培养时少走弯路，加快实验进程，不要把过多的时间耗费在培养上！ 1.成骨细胞的取材： 选取新生SD大鼠的乳鼠（有参考书上新生24h的，鄙人试过72h的乳鼠，消化下来的成骨细胞活力也是很不错的），具体取材方法不详述。 2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液，用PBS悬浮细胞，如果发现还有很多的骨片，将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化，第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀（如果担心胶原酶2会影响细胞的生长，可以将两次的悬液离心，去掉上清液后，用培养基重悬） 3.培养基问题： 当时选取培养基问题确实弄苦了自己，因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM，所以也用这个，但是消化下来的细胞很难成活，后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基，消化下来的细胞完全可以成活下来。但是问题接踵而至，到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%，此时只要一换液，第二天绝对培养基混浊，没有一瓶细胞活过7天的（比如今的公司倒闭的都快），怀疑是污染问题（因为正值夏季雨天），折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用，死亡现象依然在上演。 后来联系到丁香园的一个战友，他那里用的是低糖的DMEM培养基，没有出现我的问题，
成骨细胞骨形成机制
浅谈骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物 质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：(1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，cfu-f)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)
前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有bmp-2，bmp-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌?型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的 调控，后者包括细胞在有丝分裂原作用下复制dna和细胞分裂的调节机制，典型的
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
软骨细胞培养
实验方法 各种溶液的配制 1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9 （1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g （2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。 （3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。 （4）将酚红液（３）加入（２）中。 （5）补加水至1000ml，混匀。 （6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。 2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml （1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。 （3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。 （4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。 （5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。 3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml （1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。 （2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。 （3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 （4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。 4、配制闪烁液 （1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。 （2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。 取材与培养 （1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。 （2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。 （3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。 （4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。 （5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。（6）过120目纱目，去除上清液。 （7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上
生物学通报２００７年第４２卷第９期细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上 刘梅芳徐国恒‘（北京大学医学都生理系北京１０００８３） 北京市第２２中学的生物学教师陈珊问：动物细胞培养时为什么会出现贴壁现象？ 答：第１。绝大部分细胞在机体内的环境下是与其他细胞或者细胞外基质结合的，不是孤立存在的。第２，细胞与细胞或者细胞外基质结合的物质基础以及在体外培养中贴壁的物质基础是什么。 在体内，大部分细胞不是孤立存在的（血液中的细胞除外）。一般一种细胞具有一种特定的功能．不同种细胞有机组合在一起就构成能够完成较为完整的一项功能的器官。细胞之问，细胞与细胞外基质之间结合在一起，这使得每一部分组织或者器官具有一定的外形及特定的功能。血液在体内是起运输作用的，不停地流动，要通过只有几个“ｍ的毛细血管，所以血液中的细胞是单个存在的。否则就会发生血管阻塞。但是它们受到刺激．其表面与黏附有关的蛋白会被激活然后与其他细胞或细胞外基质结合．如血小板接触到破损内皮下的胶原被激活而黏附在局部，从而发挥止血的功能；如巨噬细胞可以将衰老的红细胞、血液中凋亡的中性粒细胞结合并将其吞噬，这些都应该是属于细胞之间的结合。另外有些研究表明细胞必须与其他的细胞发生联系才能够生存．如果没有其他细胞或者细胞外基质与之结合．此细胞就会发生凋亡，称为失巢凋亡。 细胞在体外培养的条件下的贴壁，首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。贴壁的过程可能是这样的。细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面），然后细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。 细胞贴壁的过程使形态发生很大变化．细胞变形运动是细胞内骨架本身和细胞外基质共同作用的结果。细胞为什么要贴壁，可以想象一下．密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉在底面上，那么细胞要生存必定改善这个环境。分泌细胞外基质，然后很自然就贴附在底面上了，而悬浮细胞．如淋巴细胞由于重力原因沉在培养瓶的底面，但是并不贴附，这可能与细胞表面的黏附分子少，以及分泌的细胞外基质过少有关．有人研究用细胞外基质处理培养器皿的底面．即增加细胞外基质，可以使悬浮的淋巴细胞贴壁。另外悬浮生长的细胞系ＴＨＰ一１受到某些药物刺激之后也可以贴壁．这可能与细胞本身分泌的细胞外基质以及细胞表面的黏附分子表达增多有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上。所以不可能贴在底面上．但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。 （Ｅ—ＩＩｌａｉｌ：ｘｕｇ＠ｂｊｗＬＩ．ｅｄｕ．ｃｎ） （ＢＨ） 欢迎订阅２００８年《生物学教学》杂志 《生物学教学）杂志是由华东师范大学主办，向国内外正式发行的全国教育类核心期刊。国内统一刊号：ｃＮ３１一Ｉ００９，ｃ４．国际标准刊号：１００４—７５４９。读者对象以中学生物学教师为主，兼顾高校和其他生物学工作者。主要栏目有：生物科学综述、国家课程标准与实验教材、现代教育论坛、教育教学研究、课堂教学设计与实践、信息技术、国外教育动态、考试与命题、实验教学、科技活动、教学参考、生物学科技信息、科学技术与社会、读者之窗等。另外，封面、封底刊登生物照片。 《生物学教学》杂志为８０页，月刊，国际标准１６Ｋ，２００８年定价：７．００元，全年８４元。国内订购：全国各地邮局，代号４—４５０。国外订购：中国国际图书贸易公司（北京３９９信箱，邮编：１０００４４），代号：Ｍ５１０５。如果错过了邮局订购时间，可以与杂志社联系邮购。杂志社地址：华东师范大学《生物学教学》杂志社，邮编：２０００６２．电话０２ｌ一６２２３２２２５。电子信箱：ｓｗｘｉｗ＠ｂｉｏ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。