矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析
应用与环境生物学报2007,13(2):176~179
Chi n J App lEnvi ron B i o l=ISSN1006-687X2007-04-25矮牵牛花香基因BS MT3的c DNA克隆与表达特征分析喻麟淳泽
1张海英杨涛王立洪刘世贵龙章富*
(四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064)
(1中国科学院成都生物研究所成都610041)
摘要以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BS M T cDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBS M T1(G enB ank N o.AA0501)和phBS MT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在G en-Bank登录号为DQ494491,命名为phBS MT3.构建的BS M T3cDNA的原核表达质粒p GBS M T转化BL21(DE3)E.co li,获得的重组菌株经0.01m o l/L IPTG诱导后得到正确表达的G S T-BS M T融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BS M T在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24
关键词矮牵牛;BS M T;c DNA;克隆;表达
CLC Q78:Q946.8
c DNA C loni ng an
d Expression Characteristi cs of
Floral Scent Gene BS M T3of Pet uni a hybri da
YU Lin,C HUN Ze1,Z HANG H a i y i n g,YANG Tao,WANG L i h ong,L I U Shigu i&LONG Zhang fu* (K e y Labora tory of B io-R esource and E co-environm e n t,M i n istry of Edu c a tion,Colle g e o f L i fe S cie n ces,S ic huan Universit y,C hengdu610064,Ch i na)
(1Chengdu Instit u te of B iology,Ch i ne se A c ad e my of Sc i ences,Ch engdu610041,Ch i na)
Abstract A ne w cDNA(G enBank DQ494491)was cloned from P etunia hybr i da by RT-PCR usi ng the tota lRNA o f its peta ls as te m plate.T he sequence w as1100bp i n leng t h and encoded a m ature peptide w ith357a m i no acids.T his c DNA nam ed as phBS M T3s hared97.76%and98.6%homo log i es to phBS M T1(AAO4501)and phBS M T2(AAO45013)reported for P.hy-brida.T he recomb i nant expressi on stra i n,p G BS M T/BL21,w as constructed by s ub-cloni ng the cDNA unde r the pro m oter of vector p GEX4T-1and the identifi ed reco m b i nant plas m id p G BS M T was transfor m ed i n t o BL21(DE3)E.coli.T his stra i n w as expressed by the induction of0.01m ol/L IPTG,and the f usi on expression product GST-BS M T w as purified and used as t he an-ti gen to i m mun ize rabbits i n order t o prepare target po l yc l onal anti body.T he results of i m muno-h i stochem ical analyses show ed that the BS MT3gene w as expressed large l y i n the pe tals and tubes of P.hy bri da when compared w ith other tissues,such as l eaves,ste m s and ca l yces.F i g5,R e f24
K eyword s P etun i a hybr i da;BS M T3;cDNA;c l on i ng;expressi on
CLC Q78:Q946.8
天然或人工合成的花香成分已广泛用于食品、化妆品、饲料,但花香成分与酶的催化作用联系起来的研究目前较少[1].花香挥发物首次与酶一并分析研究的植物是山子草属植物仙女扇(C lark i a bre w eri)[2,3].安息香酸甲酯和水杨酸甲酯是花香的常见成分[4],如矮牵牛花(Petunia hybr i da)释放安息香酸甲酯[1],烟草释放水杨酸甲酯和安息香酸甲酯[5].据本文作者从G enBank搜索,与花香形成有关的甲基转移酶已登记的植物种类达40余种,涉及的酶类主要有苯甲醇乙酰基转移酶(acety-l Co A:benzy lalcoho l ace t y ltransfe rase,BEAT)[6,7]、水杨酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m ethioni ne:sali cy lic aci d m ethy ltrans-ferase,S AMT)[7~9]、安息香酸羧甲基转移酶(benzo ic ac i d ca r-boxy l me t hy ltransferase,B AM T)[10,11]、苯甲醇苯乙酰基转移酶(benzy l alcoho l benzoy l transferase,BEBT)[12]、安息香酸水杨
收稿日期:2006-10-10接受日期:2006-12-31
*通讯作者C orres pond i ng author(E-m ai:l L zf0028@163.co m)酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m eth i oni ne:benzo i c acid/sa licy-l ic ac i d carboxy l m ethy ltransferase,BS M T)[13]、芳樟醇合酶(S-li naloo l syn t hase,L IS)[14].矮牵牛常作为研究花青素、类黄酮的生物合成、花的发育和花香物质的模式植物,其花香主要成分)))安息香酸甲酯的生物合成由BS M T以S-adenosy-L-m e-thion i ne(S AM)实现转甲基使羧基变为羧甲基[5,15].N egre等(2003)报道了矮牵牛BS M T1和BS MT2两个cDNA序列,其研究还发现BS M T的基因表达受植物激素乙烯的抑制[13].本文则报道新的矮牵牛花BS M T cDNA序列、原核表达、抗体制备及其表达定位的研究结果.
1材料与方法
1.1试验材料及主要试剂
矮牵牛(P et unia hybrida,2n=14)栽培于四川大学室内. O ne S tep RNA PCR K it、p M D18-T连接试剂盒、DEPC、各种限
制性内切酶均购自T aK aR a公司;总RNA提取试剂盒购自上海
华舜生物公司;DNA片段回收试剂盒购自M B I公司;原核表达载体p GEX4T-1购自Phar m ac i a公司,大肠杆菌DH5A、BL21 (DE3)由本室保存.异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自P romega公司;丙烯酰胺、N,N c亚甲双丙烯酰胺购自Borhr i ng er M annhe i m公司;N,N,N c,N c-四甲基乙二胺(TE M ED)、工具酶、T4DNA连接酶等购自T a K a R a公司.Bu l k G ST purifica ti on m odules购自Am ersha m Phar m acia B i otech公司.辣根过氧化物酶联羊抗兔Ig G血清购自华美生物工程公司.
1.2方法
1.2.1矮牵牛花香基因BS M T的RT-PCR矮牵牛花瓣总RNA的抽提参照总RNA提取试剂盒的使用说明书进行.参照报道[13]的序列进行引物设计.上游引物P1(5c-CGATCT-GAATTCATGGAAGTTGTTG-3c)和下游引物P2(5c-cgcg tcgaccg ttcttaatcctcctcag-3c),按T a K a R a公司的O ne Step RNA PCR K it使用说明书.在200L L DEPC处理的薄壁PCR EP管中加入10@O ne Step RNA PCR Buffer5L L,25mmo l/L M gC l
2
10L L,10mm o l/L d NTP5L L,RN ase Inh i bito r(40u-n its/L L)1L L,AM V RT ase X L1L L,AM V-O pti m ized T aq1 L L,BS M T上游引物P1和下游引物P2各1L L(15mm o l/L),
矮牵牛花总RNA2L L,RN ase F ree d H
2
O23L L.扩增条件如下:50e30m i n,94e2m i n,然后94e1m i n、60e30s、72 e1m i n15s共35个循环,然后72e延伸10m in.切下RT-PCR产物特异带,按M B I DNA Ex tracti on K it方法回收c DNA,并与p M D18-T载体连接、转化DH5A E.coli,重组质粒的筛选参照Sathe等(1991)的方法[16]进行.显阳性的重组子(pB-S M T)送上海基康生物工程公司测序.测序结果采用DNAm an、
B l ast等进行分析.
1.2.2原核表达质粒的构建与表达E co RⅠ+SalⅠ双酶切pBS M T质粒和p G EX4T-1,分别胶回收目标片断,在T4DNA 连接酶、16e下连接过夜,转化DH5A E.coli,经菌落PCR和质粒酶切鉴定后,得到原核表达阳性菌株p G BS M T.将筛选出的p GBS MT质粒转化到BL21(DE3),将含重组质粒菌落pGB-S M T/BL21(DE3)接种于2mL LA(含100g/L氨苄青霉素的LB)培养过夜.取100L L转接到5mL新鲜LA培养液,37e 200r/m in培养4h后,取2mL培养液到无菌试管并添加终浓度为1mm ol/L的I PTG进行诱导表达,余液3mL作为未诱导对照;37e200r/m i n继续培养3h后,12000r/m i n30s离心收集菌体.原核表达蛋白样品于10%SD S-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R250染色.
1.2.3G ST-BS M T融合蛋白回收按原核诱导表达方法制备样品,经包涵体纯化、变性与复性,复性蛋白液采用Phar m a-cia公司Bu l k G S T P urifica ti on M odule回收融合蛋白,SD S-PAGE电泳检测回收蛋白纯度.
1.2.4兔高免血清制备按2mg/kg家兔剂量皮下多点注射免疫日本大耳白兔,15d后减半剂量加强免疫两次,耳静脉取血EL ISA法测定兔高免血清效价,效价合格后在免疫家兔颈动脉取血分离血清,-20e保存.
1.2.5不同组织的免疫组织化学采用制备的家兔BS MT 多抗作为一抗,对矮牵牛的组织切片进行免疫组化分析,方法参照P i m enta等(1998)[17].
2结果与分析
2.1矮牵牛花香基因BS MT的克隆与序列分析
以矮牵牛花瓣的总RNA为模板,克隆得到其花香基因BS M T c DNA,其编码框(ORF)全长1074,编码357氨基酸残基(图1).与已知的植物花香基因c DNA序列相比较,结果(图2)发现与矮牵牛BS M T登记序列(AAO45012、AAO45013)[13]分别有8aa和5aa的氨基酸残基的差异,同源性分别为97.76%和98.60%;该c DNA序列在G enBank的登录号为DQ494491.
图1BS M T3基因cDNA序列和推导的蛋白质序列
Fi g.1c DNA nu cleoti de sequen ce and deduced a m i no aci d sequen ce of BS M T3
2.2矮牵牛BS MT原核表达
从图3结果可以看出,矮牵牛花香基因BS M T c DNA正确插入了原核表达载体pGEX4T-1,重组表达质粒质粒命名为p GB-S MT;转化BL21(DE3)得到的表达菌株命名为p GBS MT/BL21,
177
2期喻麟等:矮牵牛花香基因BS M T3的c DNA克隆与表达特征分析
经IPTG 诱导后的SDS -PAGE 电泳结果(图4)表明得到了正确表达,表达的融合蛋白分子量与预期大小66.6@103基本一致(Lane 4,L ane 6),含空载体p G E X 4T -1转化菌p GEX 4T-1/BL 21诱导表达蛋白(Lane 2)的分子量与预期的26@103一致.
2.3 矮牵牛BS MT 在不同组织的免疫定位
从图5可以看出,矮牵牛花香基因BS M T 在根、茎、叶、花萼中均无表达产物,而在花瓣和花管中有BS M T 表达,表达产物主要集中在细胞质.
图2 矮牵牛BSMT3与已有报道的蛋白序列比较
Fi g .2 C o mp aris on of the ne w BSM T c DNA w it h ot h ers reported f or P.hybri da i n a m i no aci ds
AAO45012:P.hybri da BSM T1;AAO45013:P.hybri da BS M T2
图3 矮牵牛BS M T 原核表达重组质粒的酶切鉴定
F i g .3 Enzy m atic i den tification of t he reco mb i n ant plas m id
for prok aryo expression of P.hybri da BS M
T3
图4 重组质粒原核表达产物SDS -PAGE (10%Gel)
Fi g .4 SDS -PAGE of prokaryoti c produ cts of t h e exp res s i on of pgBSM T (10%
Gel)
图5 BSM T 基因在矮牵牛不同组织的表达定位
F i g .5 Iden tificati on for BSM T gene express i on i n d i ff eren t tiss ues of P.hybrida
178 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷
3讨论
植物花香具有重要的生物学意义,但目前对植物花香的研究还不够深入,且集中在花香气成分的分析与提取以及人工合成,而对花香的生物合成研究相对较少[18].参与植物花香形成的酶类基因结构解析研究的报道近年来逐渐增多,仅2005年G enBank登记花香形成相关基因的植物种类就达30余种.随着植物花香生物合成机理的研究发展,植物花香的生物合成将成为新的研究热点.
高丽萍等(2001)报道茉莉花香气成分除萜烯醇和芳香醇等醇系香气外,主要决定茉莉花特征香气的还有乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯等酯类化合物,但酯类香气化合物的合成途径及其酶学却少有研究.他们研究发现,在茉莉花开放过程中,苯丙氨酸解氨酶在花初开时(20:00)活性有所提高;非特异性酯酶同工酶谱带显示酯酶与香气释放有关[19].M ah m oud和Croteau等(2001)应用薄荷呋喃合成酶(m entho f uran synthase,M FS)的反义基因进行转基因,获得的转基因植物的薄荷醇含量增加[20].L e w i nsohn等(2001)将C l arkia bre weri的S-芳樟醇合酶基因(S-li na l oo l synthase,LIS)在番茄果实中实现了特异超表达,转基因番茄果实中S-芳樟醇比对照高123~833倍,其它类萜含量没有观察到明显变化[21].V erbe rne等(2000)在质体中超表达编码细菌ICS和IPL酶基因,转基因烟草植株与野生型植株相比,水杨酸含量高出1000倍,相关防御基因持续组成性表达,抵抗病毒和真菌的能力明显提高,但植株其它性状均正常[22].目前,植物次生代谢基因工程最大的困难是我们对植物次生代谢途径及其调控了解不多,仅鉴定和克隆了少数几个基因[23].未来研究的一项任务是探明植物次生代谢途径,包括次生代谢途径的中间产物和终产物的来龙去脉、参与各步反应的酶及其基因的表达与调控、次生代谢产物合成的细胞分区、定位和转运以及各代谢途径之间的相互联系等,有效地确定代谢基因工程的靶标[24].
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179
2期喻麟等:矮牵牛花香基因BS M T3的c DNA克隆与表达特征分析
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.sodocs.net/doc/0c18154570.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
目的基因的克隆与及表达
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中
目的基因的克隆表达
目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环
（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记