分子生物学实验报告
分子生物学实验
院系：生命科学与技术学院
专业：生物科学（基地）
班级： 201101班
学号：
姓名：
分子生物学基础实验
分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。
实验一质粒DNA的小量制备
一、实验原理
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。
质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
二、实验目的
1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。
2．了解制备原理及各种试剂的作用。
三、实验材料和试剂
材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。
试剂：
1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH
至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。
2.溶液Ⅰ（缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。
灭菌后存放。
3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一
天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。
4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏
水28.5mL。
5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体
积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。
6.无水乙醇
7.70％乙醇
8.pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶
20μg/mL。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
四、操作步骤
（一）培养细菌
将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。
（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA
1．取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。
2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。
3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。
4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5．10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。
6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm 离心5min。倒去上清液。
8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。
9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。
这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度，故在此要进行一次电泳，下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：
原理：根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。
由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。
表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA片断
总DNA含量为100%
琼脂糖凝胶板的制备
1．琼脂糖凝胶的制备
称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
2．胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3．加样
用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污染。加样时，枪头不要插入胶板
内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)
4．电泳
加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
5．染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。
6．观察
在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。
五、注意事项
1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。
3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。
4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。
5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。
6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。
7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。
因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。
六、实验结果与分析
提取质粒DNA后，经琼脂糖凝胶电泳，图谱如下：
图中M为Marker，4号为本人所提取的
质粒DNA凝胶电泳的检测图，本人所用的
质粒为pEGFP-N3。由跑胶结果可知，质
粒DNA分子条带较为明亮，说明所提取的
DNA浓度很高；前面原理部分提到，质粒
DNA分子的结构多样，包括超螺旋结构，
开环结构以及线性结构等，它们在凝胶中
的泳动速度不同，所以在图谱中显示有多
条带；胶孔中比较亮的部分表明提取的质
粒中有大量蛋白质残留；条带非常宽而且
两侧有轻微的拖尾迹象表明点样时样品量
加的过多，在质粒检测中可以适当减少加
样量，使得条带清晰均匀一点。一般在实
验室中，不会单独检测质粒DNA，或者检
测质粒DNA时不用Marker，这主要是因为质粒DNA分子结构多样，在电泳图谱中并不能够正确显示其大小。
七、思考题
1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？
答：首先注意的是SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。其次是在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡，否则会是质粒DNA 断裂，影响提取的效果与浓度。
2．质粒的基本性质有哪些？
答：质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，是双链闭合环状结构的DNA分子；具有自主复制和转录能力；可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中。3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？
答：溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液，葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管EP的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA 是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，NaOH是最佳溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。
-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。c能与蛋白质结合成为R-O-SO
3
SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。
溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液，pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。
酚/氯仿液(V/V＝1/1)：用苯酚处理时，能使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚能有效变性蛋白质，抑制了DNase的降解作用；氯仿能克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）；异戊醇的作用是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含质粒DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入乙醇后，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，DNA失水聚合。
70%乙醇：将质粒DNA表面的离子洗去。
pH 8.0 TE缓冲液：由于缓冲液是TrisH+ /Tris，不存在金属离子的干扰作用，而TE
缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris 调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA 比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
4.抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？
答：DNA提取分为三个基本步骤：1、破碎细菌细胞壁，加入去污剂除掉膜脂从而裂解细胞，使蛋白质与DNA变性，利用醋酸盐沉淀基因组DNA、细胞碎片与蛋白质。
2、酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白。
3、将DNA在冰乙醇中沉淀，因为乙醇与水互溶，而DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。
5.如何提高质粒DNA的产量？
答：第一是扩大质粒DNA的拷贝数，一般认为，培养16小时的菌液状态最好，最适合提取，可以在此基础上扩大接种量，等比例扩大LB培养基的体积，采取多次抽提的方法提高质粒DNA的产量；第二是在提取过程中小心谨慎，在加入苯酚/氯仿溶液离心之后小心吸取的同时尽量吸取完全，减少损失。
6.为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？
答：当质粒存放在-20℃的条件下保存时，由于TE缓冲液中含有水分，会结成冰晶插入到质粒DNA分子的间隙中，而在4℃条件下不会出现这种状况。若是质粒DNA 分子反复冻溶，水溶液的反复结冰会导致环状DNA分子断裂，导致得到线性的质粒DNA，在接下来的实验中将会影响到酶切与检测。为了保护质粒DNA分子不受到损害，应当将近期需要使用的质粒存放于4℃冰箱保存，方便使用，而对于暂时不用的质粒，则应存放于-20℃冰箱，长期保存。
实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定
一、实验原理
测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。
1．紫外分光光度法
DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。根据计算在260nm波
=1时，双链DNA含量为50ug/mL，长下，每1ug/mL DNA钠盐的A值为0.20，即在A
260
单链DNA与RNA含量为40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL。
双链DNA含量＝A
×50×稀释倍数（ug/mL）
260
RNA 含量＝A 260×40×稀释倍数（ug/mL ）
单链DNA 含量＝A 260×33×稀释倍数（ug/mL ）
此外还可以根据260nm 和280nm 的读数间的比值（A 260/A 280）估计核酸的纯度。
2．琼脂糖凝胶电泳法
根据DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB 嵌入DNA 分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA ，就可以从照片上比较鉴别。
由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA 样品。
表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA 片断
总DNA 含量为100%
二、实验目的
1．从以上实验中提取到的质粒DNA ，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必
须测定DNA 的纯度、含量以及分子量大小。
2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA 、含量与相对分子质量大小。
三、实验材料和试剂
材料：自制的质粒DNA、λDNA/ Hind Ⅲ、。
试剂：
1．标准DNAmarker(λDNA/ Hind Ⅲ)
2．限制性内切酶E co RⅠ或HindⅢ和10X缓冲液
3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖)，已配好。
4．溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。
5．0.5×TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用时稀释10倍即可。
6．0.7％琼脂糖
仪器：37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
四、实验操作
（一）质粒DNA的酶解
1．新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如E co RⅠ）进行处理，即：
质粒DNA 5μL
10×缓冲液 1μL
E co RⅠ 0.5μL
O 4μL
ddH
2
2．37℃，保温30min。
3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。
（二）琼脂糖凝胶板的制备
1．琼脂糖凝胶的制备
称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
2．胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一
个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3．加样
用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污染。加样时，枪头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为λDNA/ Hind Ⅲ)
4．电泳
加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
5．染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。
6．观察
在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。
五、注意事项
1．基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。
2．酶应在－20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回－20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。
3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管
壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏加。
4．为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。
5．溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。
六、实验结果与分析
如图所示，M为Marker，泳道1为被酶Eco R I 所切后的质粒跑出来的条带。因为质粒在酶切之前大都以超螺旋的形式存在，在酶切之后以线性形式存在，所以泳道1只有一条条带。查资料知道pEGFP-N3质粒的大小为4729bp，大小基本符合。2号泳道为未酶切的对照组质粒，因为状态不同，所以显示出比酶切之后的条带跑的慢。分子量相同的超螺旋环状、带切口环状以及线状DNA通过琼脂糖凝胶时速度不一。由图中看，酶切后的质粒条带及未经酶切的质粒条带都不明亮，且对照组质粒的三条带不明显，说明提取的质粒浓度较小。这三种DNA的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但也受所用电流强度、缓冲液的离子强度及超螺旋度的影响。
七、思考题
1.简述EB显色的原理。
答：溴化乙锭（EtBr，EB），是芳香族荧光化合物，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。是一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色，是一种强的诱变剂，可能也是一种致癌物或致畸剂。EB分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。
2.使用溴化乙锭时应注意什么？
答：不慎与眼睛接触后，立即用大量清水冲洗并征求医生意见；穿戴适当的防护服、手套和护目镜或面具；若发生事故或感不适，立即就；避免皮肤接触；吸入有极高毒性，避免吸入。
3.说明不同电压对电泳结果的影响是什么？
答：限制性内切酶消化后的DNA分子片段，低电压时，迁移率与所用电压成正比。
在电场强度增加时，不同分子量的DNA 段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。原则上场强度不要超过5V~8V/cm，高电压可明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。使用50V左右的低电压可以让DNA分子片段沉降到胶孔中的适当位置，分散更加均一后缓慢泳出加样孔，条带整齐集中，对于微量珍贵样本（1~50ng）和小片段样本（容易在凝胶中扩散消失，显色不清）尤其有利于观察到清晰结果。为了提高效率，节省时间，在核酸条带浓缩集中后（10~20min），可以转换高电压100V，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约0.5~1.0cm时，停止电泳。综上，两种电压交替使用既提高分离效果，又较好节余时间。
4．如何判断DNA的纯度？
答：DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
实验三感受态细胞的制备及转化
一、实验原理
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。
二、实验目的
1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。
2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
三、实验材料和用具
材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。
试剂：
LB琼脂平板(无抗生素)、
LB琼脂平板(含50μg/L卡那霉素)、
LB液体培养基5mL(无抗生素)、
LB液体培养基100mL(无抗生素)、
LB液体培养基5mL(含50μg/L卡那霉素)、
0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
四、操作步骤
(一)大肠杆菌感受态细胞的制备
1．从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。
2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。3．可用移液枪将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。
4．于4℃，5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。
6．制好的感受态细胞可在冰上放置。
(二)细胞转化
取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）：样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA
对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水
对照2为质粒DNA对照组：100μL0.1mol/LCa Cl2＋2μL质粒DNA
将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为
500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min，使受体细胞恢
复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。
(三)平板培养
取各样品培养液100μL分别接种于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培养基
上（分别记为Kan—和Kan＋），涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠
时停止培养。
不含抗生素培养基含抗生素培养基结果分析
受体菌对照组有大量菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性菌株质粒对照组无菌落长出无菌落长出质粒DNA不含杂菌转化实验组有大量菌落长出有菌落长出质粒进入受体菌中产生抗
药性
(四)检出转化体
五、注意事项
1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。
2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。
3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。
六、实验结果与分析
经过一夜培养后，第二天上午9点从烘箱中取出培养皿观察结果如下图所示，实
验比较成功，转化实验组的不含卡那的平板有大量菌落长出，含卡那的平板有少许菌
落长出；对照组1即受体菌对照组不含卡那的平板有大量菌落长出，含卡那的平板没
有菌落；对照组2即质粒对照组不含卡那的平板上发现一个菌落，含卡那的平板没有
菌落。
转化实验组
受体菌对照组
质粒对照组
思考题
1．感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？
答：感受态细胞制备后在冰上放置一段时间后再进行转化可提高转化率。在0摄氏度
的氯化钙低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42摄氏度短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。所以需要先冰上放置30min，以增强其转化效率。
2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。
答：培养结果如上图所示。对照组1为受体菌，因为受体菌为DH5α菌株，并未导入含有卡那霉素抗性的质粒，所以在含有卡那霉素的培养基上不会生长，而在不含卡那霉素的培养基上则生长良好，由受体菌对照组图可知，菌体大部分存活，形成菌苔；对照组2为质粒，因为既不含有受体菌，也不含有经过转化的菌体，所以涂板之后应该在Kan﹣与Kan﹢的平板上未长出菌落，但由于无菌操作的不过关，以致于在不含卡那霉素的平板上长了一个菌落，如质粒对照组图所示；至于转化的实验组，因为感受态细胞中有一部分转入了含有卡那抗性的质粒，一部分没有转入，在Kan﹣的平板上所有的大肠杆菌都可以生长，而在Kan﹢的平板上只有转入质粒的大肠杆菌能够生长，如转化实验组图所示，因此在Kan﹣的平板上生长状态良好，长出菌苔，而在Kan﹢的平板上，部分转化成功的大肠杆菌生长，所以形成菌斑。
综上来说，实验总体还算成功，但还有一些实验细节需要注意，像对实验进程的把握、无菌操作技术等这些方面都是有待提高的。
附录：
缓冲液(灭菌后使用) ：
葡萄糖0.991g
EDTA-Na20.372g
Tris-HCl 0.303g
H2O 100mL
2. 5mol/L KAc：49.08g KAc溶于100mL H2O。
3. PH
4.8乙酸钾溶液：取60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O 即可。
4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g溶于100mL H2O。
5. 0.2mol/LHCl：取1.724mL浓HCl稀释到100mL。
6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入29.2mL
0.2mol/LHCl，补H2O至100mL即可。
7．pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的H2O中，用固体NaOH调节其pH值，最后定容至100mL。
8．pH8.0TE：取10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后定容至100mL，调节pH至8.0。含RNA酶（RNaseA）20ug/mL。9．pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入38.5mL
0.2mol/L HCl，补H2O至100mL即可。用于饱和酚/仿混合物。
10．酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂）
饱和酚：重蒸酚12.5mL
三氯甲烷12mL
异戊醇0.5mL
用pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl平衡2～3次，在饱和酚/仿上，加入等体积的pH7.6
0.01mol/L Tris-Cl保护，棕色瓶保存，4℃存放。
11．5×TBE：称取Tris-Cl 21.8g，硼酸11.0g和EDTA-Na2 1.4g用蒸馏水溶解，定容至400mL。临用时稀释为0 .5×TBE。
12．0.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于500mL H2O。灭菌后备用。
13．无菌水。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
临床分子生物学检验 总
四个阶段： 一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心 二、以PCR技术为核心 三、以生物芯片为核心 四、以DNA测序技术为核心 广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物 临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主 基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标 病原生物基因1.菌种鉴定：PCR-测序和PCR-DNA探针杂交;缩短检测时间 2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，监测疗效 3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状 4.细菌耐药监测和分子流行病学调查：随机扩增多态性DNA；指导选择 治疗方案，控制病原菌的感染传播 基因变异1.致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3.肿瘤相关基因 单基因病1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。 2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷 顿病、强直性肌营养不良等。 基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2.疾病诊断和遗传咨询3.多基因病的研究4.器官移植配型和个体识别 循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测 临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术 分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。 分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。 重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI) 3.日本国立遗传研究所（DDBJ） 一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ； 蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
分子生物学检验完整版word精品
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的 激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力 低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46，XX（XY）/47，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优 势 1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA ）的检测、基因分型和耐 药基因分析等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、F WII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法； 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。
医学分子生物学实验报告
医学分子生物学实验报告
日期：2012-04-14 医学分子生物学实验报告 一、实验名称： 1、质粒的提取 2、质粒DNA的限制性内切酶酶切 3、DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验目的： 1、掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点 2、了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 3、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 三、实验原理： 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。 质粒检测：(1)电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型；（2）吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA 同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位点分别为 GAATTC 和AAGCTT CTTAAG TTCGAA DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分
分子生物学检验技术
1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变，为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。 2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。（1）感染性微生物的检测。如：用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。（2）基因突变的检测。如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。 （3）法医学检测。如：用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。 （4）基因异常表达的检测。如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。 （5）基因定位。如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。 3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 4、基因：是基因组中一个功能单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位。 7、质粒：是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。 8、转座因子：又称为转座元件，是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。 9、原核生物基因组的结构特征： （1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。 （2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列。 （3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。（4）具有编码同工酶的基因。 （5)含有可移动的DNA序列。 10、病毒基因组的结构特点： （1）与细菌和真核生物基因组相比，病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。 （2）病毒基因组的核酸类型较多，有双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA；有环状分子，也有线性分子。但无论是哪种核酸类型，一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种，或
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
分子生物学实验报告(模板)
分子生物学 实验报告 200X级生物XX专业XX班 实验X组 组长: XX 22200731724XX 组员: XX 222007317242XX XX 222007317242XX XX 222007317242XX XX 222007317242XX XXX年X月
从基因组中获得甘薯ADK基因 XX,XX,XX,XX,XX (西南大学,生命科学学院,重庆400715) 摘要：从甘薯的新品种渝苏303中提取基因组DNA。先以此DNA片段为模板使用 PCR技术在体外扩增扩增获得 adk 基因核心片段，再扩增目的基因片段通过琼 脂糖凝胶电泳并回收，在16℃与T载体连接30min以上用于转化DH5α感受态。 -----------。 关键词：甘薯；PCR技术；基因克隆；转化 To Obtained the ADK gene from the genome of sweet potato Xiong Chun-Qing, Zhang Li, Huang Jia, Jiang Yue, Li Wen (College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715) Abstract: The new varieties of sweet potato, 303 Yusu extracted genomic DNA. Adenylate kinase gene of potato extract (ADK) and antisense expression vector construct. To make use of this DNA fragment amplified by PCR, in vitro, and then the initial or the target gene fragment was amplified by low-melting-point agarose recovery in more than 16 ℃ for 30min to connect feelings into DH5α state. State will be felt into DH5α E. coli DH5α competence, plasmid DNA in a large number of receptor cells and then choose to copy the positive transformation of body, to carry out gene extraction. Bioinformatics analysis showed that the highest level of starch synthesis in the plants, adenylate kinase and the molecular evolution of the highest genetic similarity. Access to the engineering bacteria strain can be used for genetic transformation of potato, sweet potato and cassava starch and other important crops, for the realization of starch laid the foundation for metabolic engineering. Key words: sweet potato; PCR technologies; gene cloning; transformation 1 综述： 甘薯学名：Ipomoea batatas Lam. 英文名：Sweet Morningglory旋花科 (Convolvulaceae) 属一年生或多年生蔓生草本，又名山芋、红芋、番薯、红薯、
医学检验本科班分子生物学检验技术试卷
医学检验本班《分子生物学检验技术》试卷 一. 选择题（在备选答案中选择一个最佳答案,每题2分,共20分）: 1. 在核酸提取时,常需要使用氯化钠,醋酸钠等盐溶液,真正的目的是（） A. 中和核酸的负离子,使其易于沉淀 B. 调节PH值 C. 保持核算的完整性 D. 提高核酸的浓度 E. 无特定目的 2. 在一个DNA分子中,如G所占摩尔比为17.2%,则A所占摩尔比为（） A. 82.8% B. 32.8% C. 17.2% D. 65.6% E. 无法计算 3.下列那项不是扩增反应所必需的?（） A. 引物和模板 B. dNTP C. Mg++ D .DNase E. 缓冲液 4. 下列那项是分子生物学技术形成的理论基础?（） A. 基因结构与功能的关系 B. 基因结构变异与疾病的关系 C. 病原微生物的基因结构特征 D. 基因的表达.调控与疾病的关系 E. 以上皆是 5. 分子生物学检验技术主要包括那些技术?（） A. 核酸分子杂交技术 B. DNA测序技术 C. PCR技术 D. DNA重组技术 E. 以上全是 6. 下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?（） A. 肝功能检测 B.乙肝两对半检测 C. 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测 D. 肿瘤细胞培养 E. 病原微生物培养 7. 在核酸的分离纯化过程中,为保证其一级结构的完整性,应采取（） A. 尽量简化分离步骤,缩短提取时间 B. 适当延长提取时间 C. 在37摄氏度条件下进行 D. 加入Mg++,Ca++等二价金属离子 E. 以上全是 8. 有一核酸样品,测得A260/A280=2.0,请问该样品属于哪类核酸样品?（） A. DNA B. RNA C. 是DNA,但有蛋白质污染 D. 是RNA,但有蛋白质污染 E. DNA和RNA 9. 在RNA提取和纯化过程中,为避免Rnase污染而导致RNA的降解,应采取（）
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学大实验报告
分子生物学实验 ： 专业： 学号：
目录 实验一细菌培养 实验二质粒DNA提取 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验五聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验六地高辛标记的Southern杂交
实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1. 胰蛋白胨 2. 酵母提取物 3. 氯化钠 4. 1mol/L NaOH 5. 琼脂粉 6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等） （三）仪器 1. 培养皿 2. 带帽试管 3. 涂布器 4. 灭菌锅 5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等） 6. 恒温摇床 四、操作步骤 （一）LB培养基的配制 配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入： 细菌培养用胰蛋白胨10g 细菌培养用酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。 这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 （二）细菌的培养 （１）在液体培养基中培养