引物设计注意事项
引物设计
首先引物与模板的序列要紧密互补，
其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，
再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于
38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同
的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
非配对结构最好出现在引物中间。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。
5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱
基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产
生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端。引物5′ 端修饰包括：加酶切位
点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
9.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
10.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
11. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
引物合成
1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步，将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷
酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？
引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.定量不准是怎么回事儿？
（1）生产人员定量错误。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。
（3）系统误差，10%左右为允许误差。引物工作浓度范围很宽，少许偏差不影响实验。
（4）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。
5.需要什么级别的引物？
引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求
一般PCR扩增< 45base OPC
>45 base PAGE
诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE
DNA测序20base左右OPC
亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE
反义核酸根据实验要求定PAGE
修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC
6.最长可以合成多长的引物？
引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分
比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？
根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD 数是否一致。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.
10.如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。
11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns–62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，W A, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A 混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
常规修饰基团分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
12.如何溶解引物？
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
(ddH2O2为去离子水过柱子)
13.如何保存引物？
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。
14.合成的引物5’端是否有磷酸化
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化。
15.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA 分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
16.测序发现引物有突变是怎么回事？
测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在
一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。
引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。
17.长链引物为什么出错的几率非常高？
引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18.如果测序发现突变，该如何处理？
遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，但正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
19.如果测序发现引物突变，是否有补偿？
没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。
20.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
21.为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高？
有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。还有那30%是什么？引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。
22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。
23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5’端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在68-70℃左右。
有用的荧光染料参数
Name Name 吸收波长发射波长colors 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet
24 略
25.用软件设计的引物为什么不管用？
答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。
26.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66
27.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如
Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
28.引物不纯会有什么后果？
引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5' 端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
29.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？
有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。
PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。
30.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
31.引物质量好坏的判断标准是什么？
合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。
32 略
33.PCR扩增不出就引物有问题吗？
基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高
温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1）RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT–PCR方法是很难扩增出来的。RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。
34.PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？
不能。扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。
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利用Primer premier 反向互补序列
1 2
1.最初界面；
2：单击file-可选new和open 打开文件。子菜单都有DNA和protein 可选。
3 4
3：new菜单单击DNA。
4：鼠标复制（或ctrl+c）---ctrl+v粘贴。此时可选：①As is（原序列）；
②reversed（反向）；③complented（反向）；④reverse complented（反向互补）
选4-----点OK
5 6
点击OK后，到5.
6：最大化，鼠标选中，然后ctrl+c，目标文件鼠标或ctrl+v粘贴。
利用Primer premier 设计引物
第四步选as is（原序列）到以下5，此时左上function 框中primer，enzyme ，motif可用。
5
6 选primer（此时显示默认数据）
7，选search，（开始编辑参数，选择primer length；search type（sense，anti-sense 或both）；search ranges；注意最上的search for）8，OK--
9,点击8的OK
10,点击右上的结果即可在左上的信息框看结果
10，注意右上的sense，anti-sense，引物个数；右上框中的sense（或anti-sense）的发夹、错配等信息（红色found，为有）
注意：Primer premier设计的sense引物（棕色）是基因的互补链，可直接用；
anti-sense（A）时,引物是基因序列，需要反向互补才能用。（要从3---5延伸）。
最后在保存的基因上标出，再保留必要的引物信息。关闭Primer premier（关时有对话框提示保存否）
DNAman设计引物
1打开界面，点左上角的（新建按钮）或点击File下拉菜单new或ctrl+N到3
3，复制（鼠标或快捷键），ctrl+v 到4 4，鼠标拉选到5
5，此时上中变为可选。选中到6 6，
7，primer下拉菜单design primer for DNA 8，设计参数。一般只选上半部分。
9，8中点击下一步到此。 10，9中单击下一步。
11，10中单击下一步。
用DNAclub 评价引物
1，打开 2，PCRPrimers---evaluate a primer 1）.下拉按钮可选择合适的引物，
2）.保存，在保存的基因上标出。
3）.复制记录引物信息。
4）. Sense 引物可直接标出。
Anti-sense 引物已经反向互补，故亦
可直接应用。
5）.关闭DNAman 。
3，此时考入引物序列，点击evaluate primer 4，分析结果。
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
设计方案注意事项
设计师出设计方案注意事项： 1、设计师接单：必须了解业主的装修设计风格意向,业主居住人口、性别、年龄、 空间布局需求，同时记录，以备忙时忘记查看或因需要转交其他设计师时所需。必须要有业主的联系方式，多向业主或业务营销人员索取客户详细资料与交流的信息，确保设计方案与业主需求相近，便于下次会面与谈单的沟通，缩短洽谈时效，提高工作效率。 2、接到业务单子，首先了解：房屋结构，墙体是否可动，（不建议改动承重墙， 或明令禁止的部位）。如确需改动结构应先向业主详细说明，我们可代为操作或协助操作，施工合同与预算中不得体现出来，费用应另外支付，如万一有事，我们可出面代为调解，责任与费用应由甲方自负。 3、注意房屋内的梁、柱、层高、窗台高度的结构，进出水管道位置，，排污出口， 油烟机、换气风管出口，煤气管道，空调内外机摆放位置，是否需要安装新风系统、地热、中央空调、太阳能热水器、锅炉、电热水器、燃气热水器，是否需要安装监控、智能配电、纯净水净化器。 4、平面布局，日常用品，家具摆放，家电位置，开关插座，常规使用，特殊要 求，把业主的家结合业主的要求综合自己的设计思路，当做自己的家来设计布局。 5、公司承诺：接到户型图48小时内，设计师应出1-3套平面方案，认为最满意 的一套方案出顶面，为方便与业主见面谈单，也体现我们公司员工的认真、负责的态度与工作的效率。第一次见面要主动递上名片与公司简介资料。去洽谈见面，千万别忘记带上设计协议，永远记住，卖不出去的图纸，叫废纸。 6、洽谈方案如果满意，深入洽谈立面效果，色彩搭配，诚挚要求业主签约设计 协议，预交设计订金。（注：如有能力收设计费最好收进，设计费按公司规定比例分成） 7、立面布局，应结合实际，家具常规尺寸图，顶部标高尺寸图、侧视图、俯视 图、接点图，如有特殊要求，应在图纸上注明，水路管道也应画出走向图。 公司规定给水管全部走顶面或墙面，禁止地面施工，预算内必须有防水处理项目，以防漏水现象发生。 8、强弱电布置应合理到位，有线电视线旁应放置网络线，客厅考虑音响线。电 脑桌旁应安置电话线，注明强弱电禁止走同一管道，壁挂电视应放置隐墙穿线孔?50-?75两根，靠近窗帘部位尽量少放插座，防止用电打火花引起火灾。 9、木制作造型设计尽量简洁明快，现代感强，整体方安尽量考虑空气对流，通 风采光到位，色彩搭配协调一致，背景墙纸柔和，耐人寻味，品位无穷，多做亮点，争取把作品体现到最佳状态。 10、设计制作完毕，别忘记把图纸设计制作说明打印出来，与客户签定合同 后，千万别忘记给施工人员做开工前交底，并做好交底确认记录，开工放样，以防止施工中途出现大量更改图纸。开工后应多跑工地，公司规定每套工地应不低于七次到场验收与察看。多了解施工工艺与制作用材及方法，为下一次谈单作更好的准备。请记住有备无患；一分耕耘，一分收获，付出了就有回报。服务好每一位业主是我们神圣的职责，努力让我们的每一位顾客享受到服务，使用了我们的产品，脸上都露出真挚微笑。 杭州艺创装饰工程有限公司 2006年10月16日
景观设计方案注意事项
方案设计部分-GENERAL PLAN 平面图方案的选择与活用训练快题设计中，平面图占有近一半的分值，它直接反映出绘图者方案设计的能力。在应试准备时，应准备好自己擅长的平面组合方式，然后将其运用于各类场地中，学会改图活用。 功能空间平面组合方式的选择。功能空间的平面组合方式多种多样，常见的有网状平面组合(棋盘式)、轴线式平面组合(线状平面布局)、放射式平面组合(中心辐射平面布局)、自由式平面组合。 在快题考试中以自由式平面组合为宜，即综合型的平面布置形式。它没有固定的构图方法，是以设计师的独特创意和构思为主导，更加注重人在空间中的体验。适用在场地面积较小，形态不规则、功能要求比较多的情况。 它能有效地避免网状和轴线式平面组合的呆板和冷漠感，又能较好地解决放射式平面组合在场地功能要求方面的局限。因此，在功能空间平面的选择上应从给定场地的环境入手，选用适宜的平面布局模式。由于快题设计的场地一般较小，同时又要能体现出设计师的创意思维，所以自由式布局形式是备战快题考试的重点选用模式。 平面图的活用练习。在反复确定应试平面方案后，应练习将基本的构图母题运用于各类形状和地形中去。
以下图示为例，先设定了多个布局形式，在反复修改调试后确定为：以圆为核心景观，具有放射形布置和轴线形布置于一体的自由式平面布局形式。基本平面图为长方形，周边为道路的布局构思。 在练习中应考虑到各类地块形状的选用，具体可以分为以下几类。 (1)形状类:正方形、椭圆形、长方形、带状长条形、三角形、不规则五边形，分块场地等。这类练习，可以考虑其为街头绿地，四周均为道路的情况。在各个形状中最难运用的是带状长条形和分块场地。 由于带状长条形为线型，难以布置核心区景观。此时可以考虑保留母题，局部发散的手法，将主题加以强化统一。 分块场地由于被外界道路占用，空间使用上显得比较零散，此时应该将各个区块统一考虑，系统整合。
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
PCBLAYOUT安规设计注意事项
安规设计注意事项 1.零件选用 (1)在零件选用方面,要求掌握: a .安规零件有哪些?(见三.安规零件介绍) b.安规零件要求 安规零件的要求就是要取得安规机构的认证或是符合相关安规标准; c.安规零件额定值 任何零件均必须依MANUFACTURE规定的额定值使用; I 额定电压; II 额定电流; III 温度额定值; (2). 零件的温升限制 a. 一般电子零件: 依零件规格之额定温度值,决定其温度上限 b. 线圈类: 依其绝缘系统耐温决定 Class A ΔT≦75℃ Class E ΔT≦90℃ Class B ΔT≦95℃ Class F ΔT≦115℃ Class H ΔT≦140℃ c. 人造橡胶或PVC被覆之线材及电源线类: 有标示耐温值T者ΔT≦(T-25)℃ 无标示耐温值T者ΔT≦50℃ d. Bobbin类: 无一定值,但须做125℃球压测试; e. 端子类: ΔT≦60℃ f. 温升限值 I. 如果有规定待测物的耐温值(Tmax),则: ΔT≦Tmax-Tmra II. 如果有规定待测物的温升限值(ΔTmax),则: ΔT≦ΔTmax+25-Tmra 其中Tmra=制造商所规定的设备允许操作室温或是25℃ (3).使用耐然零件: a.PCB: V-1以上; b.FBT, CRT, YOKE :V-2以上; c.WIRING HARNESS:V-2以上; d.CORD ANONORAGE: HB以上; e.其它所有零件: V-2以上或HF-2以上; f.例外情形: 下述零件与电子零件(限会在失误状况下,因温度过高而引燃的电子零件)若相隔
13mm以上,或是相互间以至少V-1等级之障碍物隔开,则其耐燃等级要求如下: I.小型的齿轮,凸轮,皮带,轴承及其它小零件,不须防火证明; II.空气载液的导管,粉状物容器及发泡塑料零件,防火等级为HB以上或HBF以上 g.下述件不须防火证明: I.胶带; II.已获认证零件; III.密封于无开孔且体积小于0.06m 金属壳之零件; IV.仪表壳,仪表面,指示灯或宝石,置于至少V-1等级的PCB上的IC,晶体管,光耦合器及其它小零件的外壳. 2.整体配置 (1)安全距离(沿面距离和空间距离) 如果知道了工作电压及绝缘等级,就可决定所需之安全距离. 表一: 绝缘等级及各式绝缘适用情形
滑块设计要求及注意事项
倒勾处理(滑块) 一?斜撑销块的动作原理及设计要点 是利用成型的开模动作用，使斜撑梢与滑块产生相对运动趋势，使滑块沿开模方向及水平方向的两种运动形式，使之脱离倒勾。如下图所示： 上图中： β=α+2°～3°(防止合模产生干涉以及开模减少磨擦) α≦25°(α为斜撑销倾斜角度) L=1.5D (L为配合长度)
S=T+2～3mm(S为滑块需要水平运动距离；T为成品倒勾) S=(L1xsina-δ)/cosα(δ为斜撑梢与滑块间的间隙,一般为0.5MM； L1为斜撑梢在滑块的垂直距离) 二?斜撑梢锁紧方式及使用场合 简图说明 适宜用在模板较薄且上固定 板与母模板不分开的情况下配 合面较长，稳定较好
适宜用在模板厚、模具空间大 的情况下且两板模、三板板均 可使用 配合面L≧1.5D(D为斜撑销直径) 稳定性较好 适宜用在模板较厚的情况下 且两板模、三板板均可使用， 配合面L≧1.5D(D为斜撑销直径) 稳定性不好,加工困难. 适宜用在模板较薄且上固定板 与母模板可分开的情况下 配合面较长，稳定较好 三?拔块动作原理及设计要点 是利用成型机的开模动作，使拔块与滑块产生相对运动趋势，拨动面B拨动滑块使滑块沿开模方向及水平方向的两种运动形式，使之脱离倒勾。 如下图所示：
上图中： β=α≦25°(α为拔块倾斜角度) H1≧1.5W (H1为配合长度) S=T+2～3mm (S为滑块需要水平运动距离；T为成品倒勾) S=H*sinα-δ/cosα (δ为斜撑梢与滑块间的间隙,一般为0.5MM； H为拔块在滑块的垂直距离) C为止动面，所以拨块形式一般不须装止动块。(不能有间隙)
园林景观施工与注意事项
第一部分景石绿化 假山：山水结合、相映成趣、相地合宜、造山得体、巧于固借、混假于真、独立端严、次相辅弼、三元变化、移步换 置石五类型： 园林中的置石依其作用、构成，主要可分为特置、对置、散置、群置、山石器设五类。 特置:选石应体量大、轮廓线突出、姿态多变、色彩突出、具有独特观赏价值，最好有透、瘦、漏、皱、丑、清、玩、拙等特点。特置的选材特别重要，并不是什么石头都可以用来作特置的，要求石材本身应具备一定的观赏价值，能独立成果，或形奇、或姿俏、或花纹绮丽、或雄浑厚重。此外，还要具备一定的体量才行。特置的相地也很讲究。它一般是整体或局部的构图中心和视线焦点。可于入口处作障景或对景，也可置于视线集中的廊间、天井中间、漏窗后面、水边、路口或园路转折的地方，要与周围的环境、尺度、颜色相配。 对置:对置山石的要求、工法仿效特置，在某轴线左右对称布置。其与特置的区别是：特置独立成景，而对置则对称成景。要求对置山石姿态不俗，或体量、形态均相似，或大小、姿态呼应顾盼，共同的构成一幅完整的画面。 散置:散置在园林中应用的非常普遍，在一般情况下不作为主景，只起点缀、烘托，增加品位的作用。因此，对石材的要求不是很高，但重在组合，组合的优劣决定着散置的成功与否。常用奇数来散置，对石材要求相对要比特置低一些，但要组合得当散置要“攒三聚五，散漫理之”。 群置：山顶、池畔、路边、交叉口、大树木，可与特置结合造景跌水处。 实际操作中，常有一些山石体形颇佳，但白璧微瑕，稍有缺陷，或由于运输中保护不善而造成部分损坏。这类山石弃之可惜，可用背景加以衬托，适当配以植物、小品或其他办法加以弥补，弥补的好，常会产生令人惊喜的效果 景石绿化 1.景石要奇数或三、五块成组搭配。 尽可能多地搭配球、草本植物、花卉等来丰富景石。2. 3.要用植物对景石进行遮掩，做到欲遮还露。 4.景石与主景树的体量搭配要协调，观赏面要自然美观。 5. 景石周边植物要富于变化，要有层次，色彩要跳动。 6.景石与园路、铺装、墙体及绿化的结合，做到手法细腻，浑然天成。 7.转角处应放置景石，搭配球类植物，起到弱化硬质边角，障景的作用。 8. 当以石头做主景（如黄蜡石）时，植物充当背景，此时绿化应简洁处理。 9.景石下可搭配麦冬、黄馨、连翘、细叶芒等具有野趣的植物，质朴、敦实，给人们以回归自然的意境。 水景绿化 1. 在自然式水景中，绿化要做到有幽深感，尽可能地回归自然 2. 水边植物要丰富，用球和柔枝型的灌木来组合，遮掩驳岸，回归自然。 3. 水边植物色彩要丰富，品种要多，做到杂而不乱。 4. 根据水面大小，适当地种植一些水生植物，软化驳岸。 5.河石要有大中小三种不同规格，加强对比，摆放手法要遵循园林美学。 6. 水边可以种植枝杆弯曲的乔木（如造型朴树），伸展到水面上，增加情趣。
引物设计注意事项
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
设计需要注意事项
1、鞋柜的隔板不要做到头，留一点空间好让鞋子的灰能漏到最底层，水槽和燃气灶上方装灯。定卫生间地漏的位置时一定要先想好，量好尺寸。地漏最好位于砖的一边，如果在砖的中间位置的话，无论砖怎么样倾斜，地漏都不会是最低点。 2、卫生间，空调插座均未设计开关。特别是卫生间电热水器，以一双级开关带一插为宜。如要关去电热，拔插头有危险 3、关于面砖阳角部分的处理方法，归根到底是看工人的水平。如果泥水工工人水平不错，而且磨瓷砖的工具比较好的话，就应该毫不犹豫的选择磨45度角的做法。从效果上来看，只要磨的好，磨45度角的阳角做法，是最漂亮的！如果工人的水平确实不怎么样，那么你还是选择用阳角条吧，因为磨的不好的45度角做法还不如用阳角条的效果。 4、排好水管后的水管加压测试也是非常重要的。测试时，大家一定要在场，而且测试时间至少在30分钟以上，条件许可的，最好一个小时。10公斤加压，最后没有任何减少方可测试通过。 5、塑钢门的时候一定要算好塑钢门门框凸出墙壁的尺寸，知会安装人员，使得最后门框和贴完瓷片的墙壁是平的，这样既美观，又好做卫生。 6、木工的包门套和泥工的贴瓷砖也是要配合的，包门套的时候，要考虑下面的地面（门的两边地面的任何一面）是否还要贴瓷砖或者其他水泥砂浆找平的事情，因为门套如果在贴瓷片前钉好，一直包到地面，将来用水泥的时候，如果水泥和门套沾上了，就会导致门套木材吸水发霉 7、床垫下方和床板一定要透气。床板一般用杉木板最好 8、做油漆尽量多用纸胶带 9、买灯具要注意：一般尽量选用玻璃、不锈钢、铜或者木制（架子）的，一般不要买什么铁上面镀什么其他镀层啊、什么漆啊之类的，容易掉色。 10、脸盆尽量用陶瓷盆，玻璃盆难搞卫生 11、水电改造要自己计划好，要求他们按直线来开曹。自己看着他们画线，全按画的线开曹。每一项都要自己验收才行。 12、防水一定要做好，一定要试水！ 13、很多施工中口头上的协议成了结帐时被宰的缺口,一定要写成白纸黑字，增减的项目都一定要把价格问清，写出来! 14、地面如果装地板，地面均要重新做水泥层重新抹平。 15、厨房门，还是要装修的木工做木制的吊轨门为好。 16、客厅里尽量多地装电源插头。 17、洗手间的淋浴外还是要做隔断。不能图省事拉一个浴帘了事，实际很不方便，水流满地。 18、做门与门框的材料要选木纹细致的材料。 19、在安装橱柜前一定要确认你家的水路是否OK。 20、厨卫地砖一定别挑白色。 21、天花板要特别注意抹平腻子后才能抹多乐士 22、客厅灯光盏数不宜过多，简洁为好，否则象灯具店！ 23、买那些需要安装的东西尽量要求卖货的安装，实在不包安装，也一定要坚持安装完后才付完全款！！ 24、装修期间，把你以前所收集到的厂家商家的名片随身带着 25、铝扣板的保护膜最好在装之前就去掉。 26、鞋柜最好用百叶门，防臭。鞋柜边可以留一个插座，用来插烘鞋。 27、切菜的地方可以安个小灯。 28、方便的话餐厅也可以安排气扇，这样吃火锅或做烧烤时就不会弄脏厅屋的天花板。 29、门口最好安排一个放杂物的柜子，可以放在鞋柜的上面。把常用的东西，如伞，包，剪刀，零钱，常吃的药等等放在那里，这样就很方便了。
景观设计应注意的事项
景观设计流程 一．景观设计定位： 二．相关资料准备和设计任务书： １.甲方提供项目规划图：规划地段位置图，规划地段现状图，规划总平面图，道路交通规划图，竖向规划图，单项或综合工程管网规划图等． ２.管网综合图：给排水(雨污水)，强弱电(电力，通迅，电视，安全防护)，煤气等． ３.消防平面图：消防平面图要先于景观扩初图，景观的交通流线，转车场要满足消防要求． ４.项目地质勘查报告： ５.建筑施工总图：建筑施工总图要先于景观扩初图． ６.单体建筑施工图：此图是景观施工图的依据． ７.其他相关图纸：建筑效果图，建筑各外立面效果图． 三．景观设计任务书： １．景观设计总体要求： (１)范围及用地情况 a．项目位置和地理特征： b．项目占地面积： c．项目指标：建筑场地总占地面积，景观设计总面积(是否含道路)，硬质铺装面积，软质铺装面积，景观建筑面积，水体总面积， 绿化率，各小品雕塑数量(雕塑，花钵，垃圾桶，座椅，体育器
械等) d．景观定位： e．产品形态和客户群： (２)景观设计总体要求： a.根据建筑特点，结合建筑营造与居住相结合的有生态特点及较高 品位的宜人景观空间．本项目定位西班牙风格的建筑和景观特征，要求景观设计要融会贯通中外地中海景观设计先进理念，展现中国自然风光和异域风情的完美结合． b.景观设计应满足相应的功能规定，强调景观的可使用性和可融入 性，注重景观与人的交流，强调居民的居住感受． c.景观材料的选择应注意形成独特风格，注意本地化和性价比． d.根据项目特点，在景观设计中要突出以下景观元素： □注重台地的竖向景观．住宅依山势而建，要设计具有景观观赏性和实用性的台阶，坡地，栏杆，墙体．竖向构筑物(含挡墙)要打破呆板，用立方体化造型和绿化，挂饰等手法使错台式构筑成为景观优势． □要突出小区绿化设计．以常绿树为主，以落叶树为辅，达到较高的绿化体量和密度．其中特别注意： 使用本土树种；强调建筑周边的树木掩映，建筑边界和院落要有树木掩映，墙角要有灌木护根，绿树和建筑融为一体；重点部位要使用大树构造绿化空间(胸径30-35cm)；使用成片树林构造绿化背景；绿化设计上要体现层次，上木，下木搭配，地被植物丰
结构设计注意事项
方案阶段 1.建设场地不能选在危险地段。 由于结构设计在建设场地的选择中一般是被动的接受方，因此，在结构方案及初步设计阶段，应特别注重对建设场地的再判别。对不利地段，应根据不利程度采取相应的技术措施，相关节。规定见《抗规》4.32.山地建筑尤其需要注意总平布置。 《抗规》第 3.3.5条规定: 山区建筑场地应根据地质、地形条件和使用要求, 因地制宜设置符合抗震设防要求的边坡工程; 边坡附近的建筑基础应进行抗震稳定性设计。建筑基础与土质、强风化岩质边坡应留有足够的距离, 其值应根据抗震设防烈度的高低确定, 并采取措施避免地震时地基基础破坏。 《抗规》第4.1.8 条规定: 当需要在条状突出的山嘴、高耸孤立的山丘、非岩石的陡坡、河岸和边坡边缘等不利地段建造丙类及丙类以上建筑时,除保证其在地震作用下的稳定性外, 尚应估计不利地段对设计地震动参数可能产生的放大作用, 其地震影响系数最大值应乘以增大 系数。其值可根据不利地段的具体情况确定, 在1.1~1.6 范围内采用。 此条为强条; 台地边缘建筑地震力放大系数也意味着单体建筑成本的增加。实际上, 有时边坡支护的费用可能远远大于边坡上单体的费用。曾经有的方案设计单位布置总平时将18~33层的高层布置在悬崖边缘或跨越十多米高的边坡, 这些都是对结构及地质不了解才会产生的错误。3.是否有地下室。 高层建筑宜设地下室；对无地下室的高层建筑，应满足规范对埋置深度的要求。4.高度问题房屋高度有没有超限。房屋高度是多少，室内外高差是多少， 5.结构高宽比问题 《高规》3.3.2条规定，6、7度抗震设防烈度时，框架-剪力墙结构、剪力墙结构高宽比不宜超过6。高宽比控制的目的在于对高层建筑结构刚度、整体稳定、承载能力和经济合理性（主要影响结构设计的经济性，对超高层建筑，当高宽比大于7时，结构设计难度大，费用高）的宏观控制。6.结构设计应与建筑师密切合作优化建筑设计和结构布置。 采取必要的结构和施工措施尽量避免设置各类结构缝（伸缩缝、沉降缝、防震缝）。当必须设置时，应符合现行规范有关缝的要求，并根据建筑使用要求、结构平面和竖向布置的情况、震要求等条件、综合考虑后地基情况、基础类型、结构刚度以及荷载、作用的差异、 抗 . . . . 确定。 各缝宜合并布置，并应按规范的规定采取可靠的构造措施和保证必要的缝宽，防止地震时发生碰撞导致破坏。结构长度大于规范时, 应设置伸缩缝, 高层建筑结构伸缩缝的最大间距: 。45m剪力墙结构为框架结构为55m, 7.结构平面布置不规则问题 《抗规》：1）扭转不规则，规定水平力作用下位移比大于1.2；2）凹凸不规则，平面凹进的尺寸，大于相应投影方向总尺寸的30%；3）楼板局部不连续，楼板的尺寸和平面刚度急剧变化，例如，有效楼板宽度小于该层楼板典型宽度的50%或开洞面积大于该层楼面面积的，或较大的楼层错层。30%8.《高规》限制结构长宽比 结构长宽比6、7度不应大于6。限制长宽比，其目的就是要在结构设计中控制长矩形平面的使用，当平面的长宽比大于3时，虽然未超过规范规定的限值，但已对抗侧力构件（如剪力墙等）的设置及楼盖结构的整体性提出了较高要求（见《抗规》6.1.6条及《高规》8.1.8条等）。框架抗-震墙及板柱-抗震墙结构以及框支层中，楼板的整体性对结构的协同工作影响很大，结构设计时应特别注意加强楼板的整体性及面内刚度。9.《高规》3.4.3条规定，不宜采用角部重叠的平面图形或细腰形平面图形。
景观施工图内容及注意事项(整理)
景观工程施工图 图纸设计规、结构容及技术要求 第一部分景观设计的依据： 景观设计主要依据的国相关设计法规与规标准有： 1．《城市绿地设计规》 2．《公园设计规》 3．《城市居住区规划设计规》 4．《城市道路绿化规划与设计规》 5．《城市绿化工程施工及验收规》 6．《森林公园总体设计规》 7．《风景园林图例图示标准》 8．《居住区环境景观设计导则》 第二部分图纸结构容及技术要求 一、总要求 施工图的设计文件要完整，容、深度要符合要求，文字、图纸要准确清晰，整个文件要经过格校审，避免“错、漏、碰、缺”。
施工图设计应根据已通过的案设计文件、初步设计文件及设计合同书中的有关容进行编制，容以图纸为主，应包括：封面、图纸目录、设计说明、图纸、材料表、材料附图、详细面积指标等。 施工图设计文件一般以专业为编排单位，分别为园建、绿化、结构、给排水、电气专业等。各专业的设计文件应经格校审、签字后，可出图及整理归档。 二、设计深度 施工图的设计深度应满足以下要求： 1 能据以编制施工图预算； 2 能据以安排材料、设备订货及非标准材料的加工； 3 能据以进行施工和安装； 4 能据以进行工程验收； 在设计中应因地制宜地积极推广和正确选用、行业和地的建筑标准设计，并在设计文件的设计说明中说明图集名称和页次。 关于设计说明书和图纸应表达的容、深度等要求，是考虑对园林景观工程通用而编制的。在进行一项园林工程具体设计时，应根据设计合同书的要求，参照本文对相应容的深度要求编制设计文件；当工程项目中有本文未列入的容时，宜参照本文对深度的要求，将其增加编入设计文件中。 三、图纸封面及图框 图纸封面应包含项目名称、图纸专业、设计出图单位、出图时间及出图版本。
给排水设计方案过程注意事项
新手必读（一）给排水设计过程与注意事项——排水设计的新手往往只知道要查规范去画图，而对一个工程如何展开、各专业如何提资协作建筑对于刚从事给 ~直到竣工验收，并没有一个清晰准确的认识。为了让大家更快进入设计师的角色，收集了一些资料在此奉上！流程介绍分为设计阶段（工程建议书—可行性研究报告—初步设计—施工图设计—施工图审查、消防 审查、人防审查）和施工阶段（图纸会审——工地处理——竣工验收）。一、工作阶段划分工程建议书——可行性研究报告——初步设计（扩初设计）——施工图设计——施工图 1、设计阶段：审查、消防审查、人防审查。图纸会审——工地处理——竣工验收。 2、施工阶段二、设计工作流程施工图绘制按下面八个步骤进行，根据情况也可交叉进行：人员提供平面、立面、剖面。水专业提资，确定互相提资时间，列出工作计划，建筑设计1、召集各专业开会个阶段，第一阶段提管井位置、面积，电容量，水池容积，设备房面积等，一般时间在一周之内；第二阶段应分3第三阶段向概算专业 3周；提设备房布置，消火栓、湿式报警阀、水流指示器位置等，一般时间在中前期，约2～提设备材料表，一般在出图前一周。其它专业应向本专业提的资料必须明确提资时间并写入工作计划。第一阶段空调应提供空调补充水量，第二阶段建筑应该提供卫生间大样，时间也是在中前期，使本专业绘制完设备房大样图后第一次建筑提资一般比较简单，在做第一阶段提资能马上进入卫生间大样的绘制，提资的时间一定要坚持尽早。 的同时，仔细看一次图纸，不清楚的地方一定要问，设计范围要明确，管井分布面积要落实。还要着手写联系函给业主要求提供相关资料（如市政自来最低水压、管径、位置，市政排雨水管道标高、位置等，由业主相关部门索要资料），明确做法（如住宅卫生间大样画到什么程度，水表怎么设置，有什么特殊要求等），确定管道材料等等，而且要业主来文答复，作为设计依据，发生纠纷时有据可查（保护自己），并作为归档资料的一部分归档。 2、写统一技术条件，交审核人签字认可。设计依据，建筑等级，计算的方法，各个系统的技术方案（如给水系统方案是否市政水直供、水泵－水箱供水），关键的技术指标（用水定额、消防用水量等），采用的管材一定要写清楚，技术方案和设计的关键问题应该先与审核人取得一致意见，否则校审时才修改工作量太大，而且影响其它专业。 3、写计算书。这阶段先计算涉及向其它专业提资的内容，如水池容积计算，水泵选型等，计算完成后给校对人检查。 4、向各相关专业第一阶段提资，接受各专业提资。要严格按工作计划提资，一定要按质量管理体系要求填写提资单，出现问题的有据可查，避免承担不必要的责任。提资单给校对及专业负责人签字时应该提交相应部分的计算书。 5、画图，完成计算书余下内容，第二阶段提资。绘制施工图的顺序应该是大样图?平面图??系统图。画图当中注意与建筑等工种的沟通和协商，经常发生建筑修改或某专业要求修改建筑不通知其它专业的情况。 6、设计人自校。提交校审时出现图纸相互矛盾等错误是不应该的，而且不允许出现很明显的简单错误，例如立管编号错编成其它系统的，编号重复等等。 7、校对审核。提交校审时应一起提交统一技术条件和计算书，白纸图设计人应签好名。 8、会签，出图。 三、画图注意事项． 。计算编制计算书时关键的技术指标（用水定额、消防用水量等）必须取自经审核人认可的统一技术条件1、的步骤应详细列出使用的计算公式，然后列式将数值代入计算，给水管径可在给出计算公式后列表计算。所有需要计算的设计数据均应在计算书中表示，不能漏项。：设计总说明—平面图—大样图—系统图—设备材料表—采用的标准图集。2、图纸目录编排顺序；尺寸及标高标注的数字高为4mm，数字高3～3、全套图纸字体大小要统一。一般说明中单线汉字高5mm ，尺寸及标高标注的数字为2.5mm。；使用window字库中的ture type字型时在说明中为4mm2.5mm 0.6mm。0.54、粗线宽度一般为～。建筑提资的图上有很多尺寸、标注是其专业本身的，如门窗号与尺寸、建筑选用的图集、突出本专业内容5做法等，可以删去，只保留总尺寸、轴线尺寸、需要的细部尺寸标注。建筑的墙线要变成细线。本专业不同系统的给排水制图标准》设置。管线要用图例、颜色、图层来区别。图例应严格按照《。按顺序画平面图时自校大样图，画系统图时自校平面图，最后自校系统图，提交校审前再、6坚持严格自校自校一次，花费的时间不多，可以避免自相矛盾的错误。四、图纸绘制应注意的一些问题1、卫生间大样画卫生间大样首先要确定给排水立管的位置，要根据各层平面图特别是转换层是否能方便连接考虑，排水立管布置尽量靠近大便器。住宅卫生间没有蹲厕的应设地漏。公用卫
景观规划设计步骤及注意事项
景观规划设计步骤及注意事项 景观, 设计, 步骤 一、接受设计任务、基地实地踏勘，同时收集有关资料 作为一个建设项目的业主(俗称"甲方")会邀请一家或几家设计单位进行方案设计 作为设计方(俗称"乙方")在与业主初步接触时，要了解整个项目的概况，包括建设规模、投资规模、可持续发展等方面，特别要了解业主对这个项目的总体框架方向和基本实施内容。总体框架方向确定了这个项目是一个什么性质的绿地，基本实施内容确定了绿地的服务对象。这两点把握住了，规划总 原则就可以正确制定了。 另外，业主会选派熟悉基地情况的人员，陪同总体规划师至基地现场踏勘，收集规划设计前必须掌握 的原始资料。 这些资料包括①所处地区的气候条件，气温、光照、季风风向、水文、地质土壤(酸碱性、地下水位)．②周围环境，主要道路，车流人流方向．③基地内环境，湖泊、河流、水渠分布状况，各处地形标高、 走向等。 总体规划师结合业主提供的基地现状图(又称"红线图")，对基地进行总体了解，对较大的影响因素做到心中有底，今后作总体构思时，针对不利因素加以克服和避让；有利因素充分地合理利用．此外，还要在总体和一些特殊的基地地块内进行摄影，将实地现状的情况带回去，以便加深对基地的感性认 识。 二、初步的总体构思(雏形)及修改 基地现场收集资料后，就必须立即进行整理，归纳，以防遗忘那些较细小的却有较大影响因素的环节。在着手进行总体规划构思之前，必须认真阅读业主提供的"设计任务书"(或"设计招标书")。在设计任务书中详细列出了业主对建设项目的各方面要求：总体定位性质、内容、投资规模，技术经济相符控制及设计周期等。在这里，还要提醒刚入门的设计人员一句话：要特别重视对设计任务书的阅读和理解，一遍不够，多看几遍，充分理解，"吃透"设计任务书最基本的"精髓"。 在进行总体规划构思时，要将业主提出的项目总体定位作一个构想，并与抽象的文化内涵以及深层的警世寓意相结合，同时必须考虑将设计任务书中的规划内容融合到有形的规划构图中去。 构思草图只是一个初步的规划轮廓，接下去要将草图结合收集到的原始资料进行补充，修改。逐步明确总图中的入口、广场、道路、湖面、绿地、建筑小品、管理用房等各元素的具体位置。经过这次修改，会使整个规划在功能上趋于合理，在构图形式上符合园林景观设计的基本原则：美观、舒适（视 觉上）。 三、方案的第二次修改文本的制作包装 经过了初次修改后的规划构思，还不是一个完全成熟的方案。设计人员此时应该虚心好学、集思广益，多渠道、多层次、多次数地听取各方面的建议。不但要向老设计师们请教方案的修改意见，而且还要虚心向中青年设计师们讨教，往往多请教讨教别人的设计经验，并与之交流、沟通，更能提高整个方 案的新意与活力。 由于大多数规划方案，甲方在时间要求上往往比较紧迫，因此设计人员特别要注意两个问题：
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二
级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）
设计人员注意事项
四、设计人员易出现的问题 初学者经常会出现忘记加出血线；在填加黑色时，往往用四色黑，那样黑色印出来，小字会重影；拼大版时版心过大，容易忽略角线给印刷裁切带来不便，忘记模式转（RGB转CMYK）、图像精度不够，出现乱码等。虽然这是初学者易犯的错误，但对于有经验的设计师来说也应注意。 （一）设计制作检查 1、文字校对； 2、版面尺寸设置； 3、页面上各元素前后层次关系对否； 4、图像分辨率设置是否合理； 5、EPS图是否正确加网； 6、汉字是否做过heavy处理； 7、叠在底图上的黑色文字、线条及色块是否做了套印处理； 8、色块相接处是否做了扩缩； 9、文字与色块套印是否有必要做扩字缩底处理； 10、分色版中是否有专色。 （二）输出检查
1、线设定正确与否（包括无素信息、半色调加网、打印和RIP的设置）； 2、阴、阳片药膜面正反设定正确与否； 3、裁切线及折标设定与否； 4、打印机类型和页面尺寸及方向的设定正确与否。 （三）菲林片检查 1、软片网点密度如何； 2、网点锐利否以及信息对否； 3、线条特性如何； 4、分色版上颜色名对否； 5、软片是否平整、干净、无明显折痕、划痕及污迹是否有不规则线或网出现。（四）打样检查 1、成品版式及尺寸是否符合要求； 2、色彩正确与否； 3、折手对否。 （五）“组版十查”口诀 一查图形，二查字，三查位置，四查序；
五查颜色，六查网，七查尺寸，八规矩； 九查周边无差错，十查格式要仔细； 保证质量最重要，问题解决组版里。 了解到这里有一些刚入门的朋友，对印刷设计的相关常识知之甚少，发一些东西，以供参考。 这些东西还不全，但很多是做平面设计的人必须要知道的。 还有什么不知道的可以跟贴提问，我会尽快回答。 1、什么是图像分辨率？为什么强调它？ 答：高分辨率的图像比相同尺寸的低分辨率的图像包含的像素多，图像信息也较多，表现细节更清楚，这也就是考虑输出因素确定图像分辨率的一个原因。如一幅图像若用于在屏幕上显示，则分辨率为72像素/英寸即可；若用于600Dpi的打印机输出，则需要150像素/英寸的图像分辨率；若要进行印刷，则需要300像素/英寸的高分辨率才行。图像分辨率设定应恰当：若分辨率太高的话，运行速度慢，占
引物设计常见问题
引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理 答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿 答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入 答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高