微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2018, 7(2), 79-86
Published Online June 2018 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/journal/amb
https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.12677/amb.2018.72010
Progress of β-Glucosidase
from Microorganisms
Zhishuai Chang*, Hui Lan, Yali Bao, Zhanying Liu#
Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia
Received: Jun. 7th, 2018; accepted: Jun. 21st, 2018; published: Jun. 28th, 2018
Abstract
β-glucosidase can effectively decrease the inhibitory effect of cellobiose on cellulase activity, which is a bottleneck on the complete hydrolysis of cellulose. Because of its low activity and high cost, the β-glucosidase, which is highly resistant to acid and alkali, is more suitable for industrial production and application by means of genetic engineering technology and expressing in hetero-logous hosts. In this paper, there is a detailed summary about β-glucosidase in the classification and cloning about different sources of β-glucosidase gene, enzyme activity determination and so on, which provides theoretical support for enzyme researches.
Keywords
β-Glucosidase, Gene Cloning, Enzyme Activity Determination
微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展
常治帅*，兰辉，包亚莉，刘占英#
内蒙古工业大学，内蒙古呼和浩特
收稿日期：2018年6月7日；录用日期：2018年6月21日；发布日期：2018年6月28日
摘要
β-葡萄糖苷酶能有效解除纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是限制纤维素彻底水解的重要因素。由于β-葡萄糖苷酶酶活相对较低、成本高等因素，通过基因工程手段对其定向改造，异源表达获得高酶活、耐*第一作者。
#通讯作者。
常治帅等
热耐酸碱的β-葡萄糖苷酶，使其更适用于工业生产和应用。文中从β-葡萄糖苷酶的分类、微生物来源β-葡萄糖苷酶基因的克隆、酶活力测定方法等几方面对β-葡萄糖苷酶进行综述，以期为β-葡萄糖苷酶的研究提供借鉴。
关键词
β-葡萄糖苷酶，基因克隆，酶活力测定
Copyright ? 2018 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/licenses/by/4.0/
1. 引言
纤维素水解的过程需要大量的酶参与，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
内切葡聚糖酶随机切割纤维素链的糖苷键得到短链，外切葡聚糖酶则作用于所得短链的非还原端，得到纤维二糖和纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶催化外切葡聚糖酶的水解产物，得到葡萄糖[1]。但是酶解过程中产生过多的纤维二糖会成为非竞争性抑制物，反馈抑制纤维素酶的活性。而β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖，有效地解除其对纤维素酶活性的抑制，是纤维素酶组分中的关键酶类，也是影响纤维素彻底水解的瓶颈。
β-葡萄糖苷酶来源也十分广泛，既可以存在于植物、微生物中，又可以存在于动物体中，便于获得。
随着科学技术的不断发展，这类酶己被定向改造，获得具有更适合工业大规模生产特性的菌株，不仅降低了工业生产的成本，同时提高了生产效率。β-葡萄糖苷酶具有很好的发展前景，在食品方面，可以提高酒香，使茶叶的香味增加；在工业方面，可以大量生产大豆异黄酮苷元产品；在医药方面，其浓度可以作为肠损伤的早期生化指标，同时β-葡萄糖苷酶的底物特异性[2]、转糖苷功能[3]和葡萄糖耐受性[4]等也备受关注。因此，深入研究β-葡萄糖苷酶，使其在科学研究和工业应用中发挥重要作用，对于人类的生产和生活具有重大意义。
2. β-葡萄糖苷酶分类
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶，该酶可以水解连接烃基或芳香基与糖原子团间的糖苷键，最终得到单体葡萄糖。
β-葡萄糖苷酶根据其不同的特点可以有多种分类方法。根据β-葡萄糖苷酶所存在的部位来划分，可分为胞内和胞外两种。根据其作用的底物不同可以将β-葡萄糖苷酶分为3类：第一类是单一水解含有烃基的β-葡萄糖苷的酶，其作用的底物一般为纤维二糖等；第二类是单一水解含有芳香基的β-葡萄糖苷的酶，该酶作用的底物为对硝基苯-β-葡萄糖苷等；最后一类是能水解含有烃基或芳香基的β-葡萄糖苷的酶，其作用的底物一般为纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等。微观方向基因序列的不同，可以将β-葡萄糖苷酶分为A、B两大类。刘震等人利用MEGA5软件构建系统发育树[5]，发现不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列上均存在很大的差别，如图1。因此根据氨基酸序列的不同可将β-葡萄糖苷酶进行分类。CAZy网站根据结构相似性，将所有糖苷水解酶分类为153个家族(https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/Glycoside-Hydrolases.html，2018年4月更新)，但是目前报道较多的一般为家族1和3两类。依据不同的特点对β-葡萄糖苷酶进行分类，为更深入的科学研究提供了方便。
常治帅等
Figure 1. Phylogenetic tree of β-glucosidase from different species [5]
图1. 不同来源β-葡萄糖苷酶的系统发育树[5]
3. 不同来源β-葡萄糖苷酶及其活力比较
1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶。经过长期的研究发现，β-葡萄糖苷酶既可以存在动物中又可以存在植物的果实中，同时在微生物中也发现了该酶的存在，该酶来源十分广泛。
可以产生β-葡萄糖苷酶的植物有橄榄果、甘蓝、玉米、大豆等，但是植物来源β-葡萄糖苷酶活性要比微生物中的β-葡萄糖苷酶活性低；可以产生β-葡萄糖苷酶的动物有蜜蜂、牛肝等。相比较，关于微生物来源的β-葡萄糖苷酶的研究内容较多。微生物主要包括细菌、丝状真菌、放线菌、酵母和古细菌等；同时在如盐碱湖、热泉等一些生存环境苛刻的条件中，也发现一些具有产β-葡萄糖苷酶能力的微生物，其中丝状真菌中主要有曲霉属、青霉属、热子囊菌属、木霉属、踝节菌属等，相比较，青霉属菌类能产生大量的β-葡萄糖苷酶，霉菌可以产生活性高的β-葡萄糖苷酶。现在的研究主要集中在酵母、真菌、细菌和放线菌。原核微生物产该酶的菌株有柠檬酸杆菌属菌株[6]、脑膜脓毒性黄杆菌、约氏黄杆菌、特异腐质酶、胶质类芽孢杆菌等；一般来说，来自极端环境的β-葡萄糖苷酶与普通生物来源的相比，其酶的最适温度和热稳定性都会偏高[7]。不同来源的β-葡萄糖苷酶其理化性质和催化活力均存在很大差别。部分不同来源β-葡萄糖苷酶的性质如表1所示。
4. 基因的克隆和表达
随着分子技术的快速发展，自然选育、诱变育种、原生质体融合等技术已经远远不能满足人类需求，而基因重组技术具有定向性，也越来越受到关注，利用该技术来获得高产β-葡萄糖苷酶工程菌株已经成为现在的研究热点。
对β-葡萄糖苷酶研究的不断深入，目前，多种不同来源的β-葡萄糖苷酶已被成功克隆在不同的载体中并异源表达得到高活性蛋白。表达宿主一般是大肠杆菌或者巴斯德毕赤酵母，但由于大肠杆菌是原核生物，不能有效修饰真核基因，表达量相对来说也比较低，故现在更倾向于毕赤酵母表达系统。毕赤酵母具有有效修饰真核基因、操作简单和蛋白表达水平高等优点[13]。表2中是近十几年来β-葡萄糖苷酶基因成功表达在真核系统的部分实例，其中使用毕赤酵母表达系统的研究居多。
微生物可以产生大量的β-葡萄糖苷酶，酶活比植物来源的要高，但在工业生产上，其产量远远不能满足工业要求。将产β-葡萄糖苷酶微生物的基因克隆在异源表达载体中，其分子量、比活、热稳定性以及催化效率等酶学性质发生较大的变化，热稳定性提高，更有利于工业生产和应用。
细菌具有较高的纤维素降解能力，但是大部分细菌产生的都是胞内酶。因此利用细菌来源的葡萄糖苷酶
常治帅等
Table 1. Characteristics of β-glucosidases from different sources
表1. 部分不同来源β-葡萄糖苷酶的性质
来源分子量(kDa) 最适pH 最适温度(℃) 构型Km/(mM·L?1)
p-NPG
Vmax/(U·mg?1)
p-NPG
比活(U·mg?1)
疏水层析
Brassica oleracea [8]130 6.0 35 二聚体0.755 604 1719.63 Putranjiva roxburghii[9]68 5.0 65 NR 0.52 11.73 s?1119.1 Bursaphelenchus xylophilus[10]52 8.0 38 NR 2.334?9.017 180.3
Aspergillus oryzae[11]90 4.5 55 NR 2.906
(纤维二糖) 0.138 μmol·(L·min)?1
(纤维二糖) 40.84
Bacillus korlensis [12]90 7 40 NR 0.73 NR 1.64 × 105 注：NR表示文献中未有具体的数据。
Table 2. Examples of β-glucosidase genes expressed in eukaryotic systems
表2. β-葡萄糖苷酶基因在真核系统的成功表达的部分实例
菌株表达宿主基因序列长度GenBank登录号Saccharomycopsis fibuligera [14]酿酒酵母NR NR Paecilomyces thermophila[15]毕赤酵母2557bp/858aa HM998770
Aspergillus fumigatus Z5 [16]毕赤酵母2622bp/844aa HQ836475
Trichoderma reesei[17]酿酒酵母2622bp/847aa NR
Aspergillus niger NL-1 [18]毕赤酵母2583bp/861aa HQ385276 Aspergillus oryzae GIF-10 [19]毕赤酵母2586bp/862aa NR
Putranjiva roxburghii[9]酿酒酵母1617bp/539aa KF006311
注：NR表示文献中未有具体的数据。
基因进行克隆和表达以获得高活性重组酶对生产具有重要的意义。KIM等[20]将来自Thermococcus pacificus P-4中的Tpa-glu基因在大肠杆菌中进行克隆和蛋白表达，其重组β-葡萄糖苷酶在pNPG为底物时最适pH为7.5，最适温度75℃，Km值较小，该重组酶具有较高的耐热性和底物特异性，在一定程度上降低了工业生产成本。同时也有研究[21]将Humicola insolens RP86中的bglhi基因在大肠杆菌中进行克隆和异源表达，其重组蛋白pH稳定范围更大，在pH为4.5~8.0范围内其酶仍然保持稳定，最适温度上升为60℃，最适pH为5.0~7.0，最适pH范围的扩大减少了工业生产中调节发酵液酸碱度的费用；重组酶对纤维素的催化效率提高，是原始菌株的三倍多，这为生物质资源化的研究方向提供了有价值的借鉴，同时利用废弃的生物质不仅减少资源浪费也降低了环境污染。综和比较可以发现，大部分的葡萄糖苷酶经过克隆和异源表达后，其对温度的耐受性和pH的稳定性都有了较大的提高，并且对纤维素物质的水解效率提高，而这些特征在工业应用中具有重要的实践意义，甚至可以较好地利用纤维素材料生产乙醇、L-乳酸等重要产品。
相对于细菌，真菌生产的酶大部分为胞外酶，但是关于利用真菌进行克隆和表达的报道较少，主要原因是真菌基因中含有内含子和外显子，其糖基化过程复杂。但是大部分真菌通过质粒进行基因转移的特性促使其可以作为表达宿主，尤其是毕赤酵母其特殊的高细胞外蛋白生产性能已经成为用于工业酶生产的理想基因表达系统并且被用于异源蛋白表达[22]。表3为部分微生物在毕赤酵母中成功表达的实例。毕赤酵母具有生产β-葡萄糖苷酶的能力并且成功表达真菌来源的重组蛋白[23]。里氏木霉可以产生大量的酶组分，因此基因改造里氏木霉获得理想特性如热稳定性和酸性耐受性的重组酶具有很高的价值，大量的葡萄糖苷酶可以更好地促进生物质水解。对里氏木霉进行工程化使其产生包括β-葡萄糖苷酶在内的
常治帅等Table 3. Properties of recombinant β-glucosidases expressed in P. pastoris
表3. 重组β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母过表达的特性
来源基因载体宿主分子量
(kDa)
最适
pH
最适
温度
(℃)
Km (mM) Vmax (μmol·(min·mg)?1
pNPG Cellobiose pNPG Cellobiose
P. thermophila J18 [2]PtBglu1 pMD18-T P. pastoris
GS115 56.7 6 55 0.55 1 NR NR
Aspergillus fumigatus Z5 [16]Bgl3 pPICZαP. pastoris
X33 130 6 60 1.76 2.2 131.4 52.9
Neosartorya fisheri P1 [24]NfBGL1 pPIC9 P. pastoris
GS115 80 5 70 0.51 NR 2172 NR
Penicillium funiculosum NCL1 [23]Bgl4 pPICZαP. pastoris
KM71H 130 5 60 2.5 1.25 3332 2083
一系列糖化酶，这可以成为降低加工成本的途径之一。
5. 酶活力测定
国内外对β-葡萄糖苷酶的酶活力测定有多种方法，总结起来酶活力的测定主要有四种方法，包括电化学法、荧光法、分光光度法、高效液相色谱法等。但是对于其活性测定尚没有确定的统一方法，其中以分光光度法最为常用。
5.1. 电化学法
Guilbault和Kramer设计通过电化学法测定β-葡萄糖苷酶的活力。主要方法是以扁桃苷作为底物，通过酶的作用发生反应生成氢化物，然后利用与自发(内)电解池相联结的一对银–铂电极来测定葡萄糖苷酶活性。该方法比较复杂，灵敏度低，很少使用。
5.2. 荧光法
由Robinson设计利用荧光吸光度来测定β-葡萄糖苷酶酶活力。依据4-甲基伞形酮能发出强烈的荧光，以4-甲基伞形酮的β-D-葡萄糖苷作为底物，经过β-葡萄糖苷酶水解可以产生游离的4-甲基伞形酮，根据其荧光吸光度来计算酶的活力[25]。荧光法最初的用途是检测动物组织中β-葡萄糖苷酶的含量，该方法灵敏度高且快速，但是操作复杂，且重现性不好，现在多不使用。
5.3. 分光光度法
分光光度法，又称Barush和Swiain法，是应用较广的一种方法，该法简单方便，普遍使用。
5.3.1. 水杨苷为底物
水杨苷经过酶的水解可以产生水杨醇和β-D-葡萄糖。该方法以水杨苷为底物，利用DNS试剂对其产物葡萄糖进行比色测定；或者利用4-氨基安替比林对水解产物水杨醇进行显色，并利用分光光度计测定其吸光度。该方法的反应过程易被周围环境干扰，且灵敏度不高，很少使用。
5.3.2. 对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物
对硝基苯基β-D-葡萄糖苷，又称pNPG，经过酶解可以产生对硝基苯，且在400~420 nm处有吸光度。基本原理是利用pNPG为底物并对产物进行吸光度测定来确定酶的活力。该方法具有操作简单快速、灵敏度高且其重现性好的优点，现在实验室普遍使用，但不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质存在较大的差别，故使用该方法测定酶活力时测定条件也需要发生不同的变化[26]。
常治帅等
5.3.3. 京尼平苷
京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，经过酶水解后产物京尼平能与氨基酸发生显色反应，生成蓝色物质，且在590 nm处有吸光度。梁华正等人通过多次研究发现以京尼平苷为底物可以确定β-葡萄糖苷酶的活力[27]。同时发现酶活力在0.05~1 U/mL范围里时，吸光度和酶活力呈线性相关，且能检测出的最低酶活力为0.02 U/mL。与以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物的测定方法相比较，该法灵敏度低，但是精密度和准确度较好，结果稳定。
5.4. 高效液相色谱法
以纤维二糖为底物，利用高效液相色谱，通过测定水解生成的葡萄糖量来判断酶活也是现在比较新颖的方法。但是该方法只适用于稀释后酶活力范围为0.17~0.37 IU/mL，且葡萄糖产量在2.0 mg以内的酶活力测定[28]。该方法简单、快速、灵敏度高，但是现在实验室很少使用。同时研究发现，β-葡萄糖苷酶以纤维二糖为底物时，其酶活性偏高。
综合比较，电化法和荧光法操作复杂、灵敏度，不适合用于精确测定酶活；分光光度法是操作最简单、快速的方法，适合酶活测定，也是现在实验室测定酶活经常用的方法；高效液相法现在使用的频率不高，但是灵敏度度相对来说比较高，是一种新颖的酶活测定方法，有可能成为实验室酶活测定的常用方法。
6. 应用
β-葡萄糖苷酶的应用范围极广，可以应用于食品、工业、医药等各个领域中，对其催化机制、克隆和性质等进行深入研究对于工业和科学发展都有重大的意义。
6.1. 在食品中的应用
在食品工业中，β-葡萄糖苷酶的主要作用是改善产品口味，符合人群需求。比如在青梅饮料中，青梅本身富含营养，但其中存在的苦杏仁苷使产品出现苦味，通过添加适量的β-葡萄糖苷酶可以使其苦味降低，饮料口味也更符合人群需求。评价葡萄酒品质高低的标准之一是其风味，β-葡萄糖苷酶能够水解风味前体物质，产生具有挥发性香气的成分，是影响葡萄酒品质的重要酶类，同时它对葡萄酒的抗氧化保健功能也具有重大的影响[29]。
6.2. 在工业中的应用
在工业中利用纤维素酶对木质纤维素材料进行发酵生产乙醇或者乳酸等产品，不仅降低了工业生产成本减少环境污染，同时也为新能源的开发与利用提供了基础。此外，β-葡萄糖苷酶还可以用于水解大豆异黄酮，生产大豆异黄酮苷元产品[30]等。
6.3. 在医药中的应用
坏死性小肠结肠炎(NEC)主要在早产儿或患病的新生儿中发生，在我国新生儿疾病中死亡率高达10%~50% [31]，严重威胁其生命。研究发现，患儿血液中β-葡萄糖苷酶浓度上升早于肠壁出现组织学变化，故可以将该检测作为肠损伤的早期生化指标，为患儿争取更多的治疗时间[32]。
7. 总结与展望
β-葡萄糖苷酶通过保留型和反转型两种催化机制将纤维寡糖和纤维二糖水解为葡萄糖，减少了纤维二糖对其他纤维素酶的抑制作用，提高了酶的水解效率。除此之外，β-葡萄糖苷酶在其他领域的应用也
常治帅等
十分广泛。该酶可以用于工业生产乳酸或者大豆异黄酮苷元产品等，同时还可以用于医疗中判断新生儿疾病等。目前，通过基因工程技术定向改造获得工程菌株或通过蛋白质工程技术获得高活性、具有耐热耐酸碱等特性的β-葡萄糖苷酶已成为现在研究的热点。
对于酶活力的测定方法，发现实验室最常用的方法仍是以pNPG为底物测定酶解产物的吸光度，此方法简单、快速，结果也比较准确；根据β-葡萄糖苷酶的特性，高效液相色谱法也有可能成为主要的测定方法。但是，针对不同来源的β-葡萄糖苷酶尚没有建立更加简便精准的活力测定方法体系，加深对β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究将有利于对β-葡萄糖苷酶进行更深入的研究。同时尝试从基础领域出发，研究酶的催化机制，找到酶活力测定方法误差来源，真正从根本上减少误差，提高测定方法的精确度也是现在的研究内容之一。
基金项目
国家自然科学基金(61361016)；兰州重离子加速器国家实验室项目资助；中国科学院“西部之光”人才培养计划资助；内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划资助；内蒙古“草原英才”工程及“草原英才”滚动支持；内蒙古科技计划项目，内蒙古自治区人才开发基金，内蒙古自治区留学归国人员科技活动项目。
参考文献
[1]Yang, F., Yang, X., Li, Z., et al. (2015) Overexpression and Characterization of a Glucose-Tolerant β-Glucosidase
from T. aotearoense, with High Specific Activity for Cellobiose. Applied Microbiology & Biotechnology, 99, 8903-8915.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1007/s00253-015-6619-9
[2]Yang, S., Hua, C., Yan, Q., et al. (2013) Biochemical Properties of a Novel Glycoside Hydrolase Family 1
β-Glucosidase (PtBglu1) from Paecilomyces thermophila Expressed in Pichia pastoris. Carbohydrate Polymers, 92, 784-791. https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1016/j.carbpol.2012.09.086
[3]Mallek-Fakhfakh, H. and Belghith, H. (2016) Physicochemical Properties of Thermotolerant Extracellular β-Glucosidase
from Talaromyces thermophilus and Enzymatic Synthesis of Cello-Oligosaccharides. Carbohydrate Research, 419, 41-50.
[4]Taku, U., Katusro, Y. and Kentaro, M. (2015) Glucose-Tolerant β-Glucosidase Retrieved from a Kusaya Gravy Meta-
genome. Frontiers in Microbiology, 6, 548.
[5]刘震, 朱秋享, 石贤爱, 等. β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展[J]. 福州大学学报, 2015(4): 565-571.
[6]Albaser, A., Kazana, E., Bennett, M.,et al.(2016) Discovery of a Bacterial Glycoside Hydrolase Family 3 (GH3)
β-Glucosidase with Myrosinase Activity from a Citrobacter Strain Isolated from Soil. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 64, No. 7.
[7]于海玲. 黑葡萄穗霉中β-葡萄糖苷酶及β-木糖苷酶基因的克隆、表达与酶学分析[D]: [硕士学位论文]. 阿拉尔:
塔里木大学, 2013.
[8]B e?i?, L., A?i?, A., M uhovi?, I., et al. (2017) Purification and Characterization of β-Glucosidase from Brassica olera-
cea. Journal of Food Processing and Preservation, 41, e12764. https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1111/jfpp.12764
[9]Kar, B., Verma, P., Haan, R.D., et al. (2017) Characterization of a Recombinant Thermostable β-Glucosidase from Pu-
tranjiva roxburghii Expressed in Saccharomyces cerevisiae and Its Use for Efficient Biomass Conversion. Process Bi-ochemistry, 63, 66-75.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1016/j.procbio.2017.08.005
[10]Zhang, L., Fu, Q., Li, W., et al. (2017) Identification and Characterization of a Novel β-Glucosidase via Metagenomic
Analysis of Bursaphelenchus xylophilus and Its Microbial Flora. Scientific Reports, 7, 14850.
https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1038/s41598-017-14073-w
[11]陈静, 郝伟伟, 王春梅, 等. 产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选鉴定、纯化及酶学性质分析[J]. 食品科学, 2013, 34(5):
191-196.
[12]郑芳, 曹小芳, 张亚玲, 等. 一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究[J]. 微生物学通报, 2012,
39(8): 1059-1068.
[13]Ma, Y., Liu, X., Yin, Y., et al. (2015) Expression Optimization and Biochemical Properties of Two Glycosyl Hydro-
常治帅等
lase Family 3 Beta-Glucosidases. Journal of Biotechnology, 206, 79-88.
[14]Tang, H., Hou, J., Shen, Y., Xu, L., Yang, H., Fang, X. and Bao, X. (2013) High Beta-Glucosidase Secretion in Sac-
charomyces cerevisiae Improves the Efficiency of Cellulase Hydrolysis and Ethanol Production in Simultaneous Sac-
charification and Fermentation. Journal of Microbiology & Biotechnology, 23, 1577-1585.
[15]Yan, Q., Hua, C., Yang, S., et al. (2012) High Level Expression of Extracellular Secretion of a β-Glucosidase Gene
(PtBglu3) from Paecilomyces thermophila in Pichia pastoris. Protein Expression & Purification, 84, 64-72.
https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1016/j.pep.2012.04.016
[16]Liu, D., Zhang, R., Yang, X., et al. (2012) Characterization of a Thermostable β-Glucosidase from Aspergillus fumi-
gatus Z5, and Its Functional Expression in Pichia pastoris X33. Microbial Cell Factories, 11, 25.
https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1186/1475-2859-11-25
[17]Treebupachatsakul, T., Nakazawa, H., Shinbo, H., et al. (2015) Heterologously Expressed Aspergillus aculeatus
β-Glucosidase in Saccharomyces cerevisiae Is a Cost-Effective Alternative to Commercial Supplementation of
β-Glucosidase in Industrial Ethanol Production Using Trichoderma reesei Cellulases. Journal of Bioscience & Bioen-
gineering, 121, 27-35.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1016/j.jbiosc.2015.05.002
[18]Zhao, L., Zhou, T., Li, X., et al. (2013) Expression and Characterization of GH3 β-Glucosidase from Aspergillus niger
NL-1 with High Specific Activity, Glucose Inhibition and Solvent Tolerance. Microbiology, 82, 356-363.
https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1134/S0026261713030181
[19]Tang, Z., Liu, S., Jing, H., et al. (2014) Cloning and Expression of A. oryzaeβ-Glucosidase in Pichia pastoris. Mole-
cular Biology Reports, 41, 7567-7573.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1007/s11033-014-3644-1
[20]Kim, Y.J., Lee, J.E., Lee, H.S., et al. (2015) Novel Substrate Specificity of a Thermostable β-Glucosidase from the
Hyperthermophilic Archaeon, Thermococcus pacificus P-4. The Korean Journal of Microbiology, 51, 68-74.
[21]Souza, F.H.M., Meleiro, L.P., Machado, C.B., et al. (2017) Gene Cloning, Expression and Biochemical Characteriza-
tion of a Glucose- and Xylose-Stimulated β-Glucosidase from Humicola Insolens RP86. Journal of Molecular Cataly-
sis B Enzymatic, 106, 1-10. https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1016/j.molcatb.2014.04.007
[22]Singhania, R.R., Patel, A., Pandey, A., et al. (2017) Genetic Modification: A Tool for Enhancing Beta-Glucosidase
Production for Biofuel Application. Bioresource Technology, 245, 1352-1361.
[23]Ramani, G., Meera, B., Vanitha, C., et al. (2015) Molecular Cloning and Expression of Thermostable Glucose-Tolerant
β-Glucosidase of Penicillium funiculosum NCL1 in Pichia pastoris and Its Characterization. Journal of Industrial Mi-
crobiology & Biotechnology, 42, 553-565.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1007/s10295-014-1549-6
[24]Yang, X., Ma, R., Shi, P., et al. (2014) Molecular Characterization of a Highly-Active Thermophilic β-Glucosidase
from Neosartorya fischeri P1 and Its Application in the Hydrolysis of Soybean Isoflavone Glycosides. PLoS ONE, 9,
e106785.
[25]杨晓宽. β-葡萄糖苷酶研究进展[J]. 河北科技师范学院学报, 2012, 26(1): 77-81.
[26]李斐然, 刘石生, 王海燕. 橡胶籽中β-葡萄糖苷酶活力测定条件研究[J]. 食品科技, 2011(5): 264-267.
[27]梁华正, 刘富梁, 彭玲西, 等. 京尼平苷为底物测定β-葡萄糖苷酶活力的方法[J]. 食品科学, 2006, 27(4):
182-185.
[28]李旭晖, 朱明军, 郭启军. 一种测定粗纤维素酶中β-葡萄糖苷酶酶活方法的建立[J]. 现代食品科技, 2010, 26(3):
323-325.
[29]桑苇. 黑曲霉β-葡萄糖苷酶对葡萄酒酶解增香调控及风味物质影响的研究[J]. 江南大学, 2015, 41(5).
[30]Kim, B.N., Yeom, S.J., Kim, Y.S., et al. (2012) Characterization of a β-Glucosidase from Sulfolobus solfataricus for
Isoflavone Glycosides. Biotechnology Letters, 34, 125-129.https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.1007/s10529-011-0739-9
[31]陈盛, 何念海. 136例新生儿坏死性小肠结肠炎临床分析[J]. 重庆医学, 2004, 33(4): 494-496.
[32]王丹. β-葡萄糖苷酶在新生儿坏死性小肠结肠炎患者血清中的浓度测定及意义[J]. 重庆医学, 2012, 41(32):
3410-3411.
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β-葡萄糖苷酶
β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)使用说明
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)使用说明 货号：G8820 规格：1g/5g 级别：BR 其他名称：α-D-葡萄糖苷酶;α-葡糖苷酶 CAS号：9001-42-7 提取来源：黑曲霉 产品简介： α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）又被称为α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶（GTase），是一种α-D-葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖，或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6-糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖。α-葡萄糖苷酶来源广泛，在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α-葡萄糖苷酶广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等行业。 酶活定义： 每小时产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个α-葡萄糖苷酶活力单位。 酶活检测方法：参见QB2525-2001。 产品特性： 酶活力：300000U/g 最适作用温度：50℃，合适的作用温度：50-55℃。 最适作用pH：5.0，合适的作用pH：4.8-5.4。
外观：淡白色粉末或淡黄色液体，分子量约为68.5KD，无臭无味，溶于水，不溶于乙醚和乙醇。 用途： 生化研究。能水解葡萄糖苷(Glucoside)成葡萄糖和其他组成物质，是一种具有生物催化剂功能的蛋白质。本产品的建议添加量为800U/g干物质，根据实际情况改变添加量。 抑制剂： 铜、钛、钴等金属离子对本品有一定的影响。铅、铝、锌等金属离子对本品有较强的抑制作用。 贮存： 建议密封储藏于干燥、低温的环境中（≤25℃），最好在冷藏条件下（4-8℃）储藏。25℃以下，液体可以储存3个月，保质期内酶活不会降低于产品标示的活力；4℃以下，可较长时间储存。
β-葡萄糖苷酶测定试剂盒使用说明
β-葡萄糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法50管/24样货号：BC2560 产品简介： β-GC（EC3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。 β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 提取液：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体25ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80ml×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，取1.5ml EP管加入1ml，5mol/ml的对硝基苯酚溶液。 操作步骤： 一、样品的前处理：
1.细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2.组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml 提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准样品的准备：取100μL标准液，加入到400μL试剂三中，得到1mol/ml标准液，十倍稀释到100nmol/ml，倍比稀释：50、25、12.5、6.25nmol/ml，稀释液用试剂二。100、 50、25、12.5、6.25nmol/ml做标准液。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2.加样表 试剂名称（μl）对照管测定管标准管试剂一400 试剂二500500 样本100100 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止 水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） 试剂一400 充分混匀，8000g，4℃，离心5min，取上清液
α-葡萄糖苷酶的研究综述
α-葡萄糖苷酶的研究综述 摘要：α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20 ) 因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重视。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。 关键词:葡萄糖苷酶淀粉水解转糖苷反应研究进展 生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持。淀粉水解酶( 包括转化酶) 是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖和水解多糖的水解酶类。同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链接方式。淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物利用碳源等。特别是具有特殊性质和新的应用领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等。α-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来α-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益。 1、α-葡萄糖苷酶的简介 α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，α-Glucosidases) 为淀粉水解酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时， 它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，α-1，4-糖苷键转化成α-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。Ⅰ型α-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对--硝基苯酚α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ，且水解速率比低聚麦芽糖快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。 2、α-葡萄糖苷酶来源及分布 α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所
嗜热微生物的研究进展及应用
嗜热微生物的研究进展及应用 宜春学院化学与生物工程学院03生物教育张志刚 指导老师：姜琼 摘要嗜热微生物是一类最适生长温度高于45?C的微生物，嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，由于嗜热酶分子内部有很多氢键、二硫键及紧密而有韧性的空间结构的存在，所以嗜热酶在高温条件下具有很强的稳定性，高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，嗜热酶在许多方面都有广泛的应用。当前获得嗜热酶的方法主要有：直接从嗜热微生物中提取、利用基因工程技术在中温宿主中表达和利用定向分子进化技术筛选。目前酶的纯化主要采用层析法、高效液相色谱法和电泳法等方法。由于环境恶化,能源危机,全球变暖等原因, 嗜热酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。 关键词嗜热微生物；嗜热酶；嗜热机制；应用 Thermophilic microorganism research progress and application Zhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang Qiong Abstract Thermophilic microorganisms is a type of microorganisms that the most suitable growth temperature is above 45?C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzyme have a very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distilled directly from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening environment, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground. Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application 最适生长温度高于45?C的微生物称为嗜热微生物，是在高温环境下生存的一类微生物，它们有其自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下保持极好的稳定性，使很多高温化学反应得以实现从而将极大的促进生物技术产业的发展。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酶。今后，还应继续在嗜热酶的结构与功能、应用等方面作深入而全面的研究。本文主要对嗜热酶的研究进展及应用作一综述。 1 嗜热微生物的分类及其酶的种类和特点 1.1 嗜热微生物的分类 嗜热微生物是一类生长温度跨度在40～150℃之间的微生物,它可分为轻度嗜热(最适生长温度低于60℃)、中度嗜热(最适生长温度低于85℃) 和极度嗜热(最适生长温度大于85℃) ,主要分布于地热环境
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法
2.2实验方法 2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法 2.2.1.1 反应溶液的制备 （1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。 （2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。 （3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。 （6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。 2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制 精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程： y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。
微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2018, 7(2), 79-86 Published Online June 2018 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/journal/amb https://https://www.sodocs.net/doc/163421188.html,/10.12677/amb.2018.72010 Progress of β-Glucosidase from Microorganisms Zhishuai Chang*, Hui Lan, Yali Bao, Zhanying Liu# Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia Received: Jun. 7th, 2018; accepted: Jun. 21st, 2018; published: Jun. 28th, 2018 Abstract β-glucosidase can effectively decrease the inhibitory effect of cellobiose on cellulase activity, which is a bottleneck on the complete hydrolysis of cellulose. Because of its low activity and high cost, the β-glucosidase, which is highly resistant to acid and alkali, is more suitable for industrial production and application by means of genetic engineering technology and expressing in hetero-logous hosts. In this paper, there is a detailed summary about β-glucosidase in the classification and cloning about different sources of β-glucosidase gene, enzyme activity determination and so on, which provides theoretical support for enzyme researches. Keywords β-Glucosidase, Gene Cloning, Enzyme Activity Determination 微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展 常治帅*，兰辉，包亚莉，刘占英# 内蒙古工业大学，内蒙古呼和浩特 收稿日期：2018年6月7日；录用日期：2018年6月21日；发布日期：2018年6月28日 摘要 β-葡萄糖苷酶能有效解除纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是限制纤维素彻底水解的重要因素。由于β-葡萄糖苷酶酶活相对较低、成本高等因素，通过基因工程手段对其定向改造，异源表达获得高酶活、耐*第一作者。 #通讯作者。
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)试剂盒说明书
货号：QS2613 规格：50管/24样β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。 测定原理： β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、培养液、血清（浆）等液体样本：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 ， 第1页，共2页
产脂肪酶的微生物研究进展
产脂肪酶细菌的筛选与鉴定 姓名：范丽萍学号：0911040203 班级：生09级6班 前言 1.脂肪酶的简介 脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶u J。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。 2.微生物产脂肪酶的研究历程 脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质[1]开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母[2]、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candida lipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制剂供应市场。 表1 常见的产脂肪酶的徽生物 菌名 黑曲霉荧光假单胞菌 白地霉无根根霉 毛霉圆柱假丝酵母 巢子须霉德氏根霉 多球菌棉毛状酶 圆弧青霉粘质色杆菌 表2 常见商品酶 enzyme abbreviation manufacturer Candida cylindraces CC Sigina,amano Aspergillus niger AN Amino,fluka Rhisopus delemar RD amano 就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面还有很大的研究空间，本实验主要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。 3.微生物产脂肪酶的用途
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
β-葡萄糖苷酶研究进展
β-葡萄糖苷酶研究进展 1.1问题的提出及意义 随着能源危机、食物短缺、环境污染等问题正日益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、节省粮食、减少环境污染显得越来越重要。纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源。全世界每年的植物体生成量高达100-500亿吨干物质，其中一半以上为纤维素和半纤维素[1]。纤维素在一定条件下可以被水解成单糖，单糖可再通过微生物发酵生产各种有用的产品，如饲料、燃料、化工原料、食品、药品等，并且可取代目前的淀粉原料发酵生产的各种产品，以及由化工燃料合成生产的部分有机产品[2,3]。开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。 纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系,根据其中各酶功能的差异，可将其分为三大类：(1)内切β- 1，4- 葡聚糖酶(endo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.4，也称Cx 酶)，作用于纤维素分子内部的非结晶区或羧甲基纤维素，随机水解β - 1 ，4 - 糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量小分子纤维素；(2)外切β- 1，4- 葡聚糖酶(exo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.91，也称C1 酶)，作用于纤维素线状分子末端，水解β - 1 , 4 - 糖苷键，每次从纤维素链的非还原端切下一个纤维二糖分子，可以水解微晶纤维素；(3)β-葡萄糖苷酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21，简称CBH)，水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖[4]。3种酶协同作用，完成对纤维素的降解。 1837年，Liebig 和Wohler 首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[5]。后来研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于植物[6]、昆虫[7]、酵母、曲霉及细菌体内。它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要成员，在纤维素水解时，纤维二糖的积累会抑制内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性，而纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低，因此成为纤维素酶解的瓶颈[8]。增加β-葡萄糖苷酶活性，会有效提高纤维素酶解效率。目前，国内外多家研究机构正致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究，以期望更好改善纤维素酶的催化效率，利用纤维素资源。 1.2国内外研究现状
糖苷酶实验指导
α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定 实验原理： 食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。 仪器与试剂 缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。 酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。 底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 实验内容 1.分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品 大、中、小剂量组、待测样品组空白 空白对照： 170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM 的pNPG 阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂 待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG 待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品 2.实验步骤
a-糖苷酶抑制剂
种类 天然α-葡萄糖苷酶抑制剂（glucosidase inhibitor）主要源于动物、植物、微生物，目前已上市并在临床上应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药主要有：拜唐苹（阿卡波糖），每片50毫克（德国拜耳）；卡博平（阿卡波糖），每片50毫克（中美华东）；倍欣（伏格列波糖），每片0.2毫克（天津武田）；奥恬苹（米格列醇，miglitol），每片50毫克（四川维奥）。其中拜唐苹及卡博平为医保药物，倍欣与奥恬苹尚未进入医保目录。 拜唐苹：（阿卡波糖），Acarbose 特点：由白色放线菌属菌株发酵而成，为德国拜耳公司出品，仅有微量原形或分解产物为人体吸收，绝大部分经肠道排出。 规格：50毫克/片 剂量：150~300毫克/日 副作用：消化道反应：肠鸣，腹胀，恶心，呕吐，食欲减退，偶有腹泻，一般两周后可缓解，必要是可减量。 倍欣：（伏格列波糖），V oglibose 特点：由日本武田药品有限公司生产，通过抑制α- 葡萄糖苷酶，延缓双糖（淀粉在淀粉酶作用下水解为双糖）在α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单糖，延缓葡萄糖与果糖的吸收速度，从而降低餐后血糖。 规格：0.2毫克/片 剂量：0.6毫克/日 副作用：同拜糖平。 编辑本段 作用机制 食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理的状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 编辑本段 作用特点 （1）抑制小肠上皮细胞表面的α-糖苷酶。药物与酶的结合时间大约是4～6小时，此后酶的活性可恢复。 （2）延缓碳水化合物的吸收，而不抑制蛋白质和脂肪的吸收。 α-葡萄糖苷酶抑制剂 （3）一般不引起营养吸收障碍。 （4）几乎没有对肝肾的副作用和蓄积作用。 （5）主要降低餐后血糖。 编辑本段 临床药效 （1）可显著降低糖耐量受损者发生2型糖尿病的危险。餐后血糖升高是糖耐量受损（IGT）
β-葡聚糖研究进展
?-葡聚糖的研究进展 程彦伟李魁赵江 燕麦β－葡聚糖是一种存在于大燕麦皮中的天然非淀粉类水溶性植物糖，其基本结构是由D葡萄糖以β14，β1-3糖苷键连接而成的线性多糖，这两种糖苷键的比例大致为7：3。 燕麦β－葡聚糖是一种水溶性膳食纤维，因其具有的黏性阻碍淀粉、蛋白质等物质的消化和吸收，并可增殖消化道有益菌，所以可对人体具有一些极为有利的生理功能：具有显著的降血脂、降血糖及提高免疫能力，维持肠道微生态环境等。另外，它还能加快确定人群的免疫细胞。对细菌感染的反应并控制住细菌感染的位置，使感染面尽快恢复；作为化妆品的有效成分，可以提高皮肤抗过敏能力，激活免疫功能，延缓皮肤衰老。燕麦水溶性膳食纤维和燕麦葡聚糖，可有效降低餐后血糖浓度和胰岛素水平，降低胆固醇和预防心血管疾病.燕麦纤维食品易被人体吸收，并且因含热量很低，既有利于减肥，又适合心脏病,高血压和糖尿病患者食疗的需要。 降低胆固醇 早在多年，科学家就发现bata一葡聚糖能够减少肠胃吸收脂肪酸的速率,降低人体胆固醇的合成.随着bata一葡聚糖研究的日趋成熟，学者们先后在动物及人体实验水平上进行了大量的实验,证实了bata一葡聚糖在降低胆固醇和低密度脂蛋白方面具有特 异的生理功能.科学家发现bata一葡聚糖对胆固醇的影响主要在于能显著降低血浆中 总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDI一TC),而对高密度脂蛋白(HDL)和甘油三醋(TG)没有明显影响仁。燕麦葡聚糖对高血脂人群有明显的降低胆固醇的作用。 有关燕麦葡聚糖降低胆固醇的机理目前有四种假说: ①可结合胆汁酸,增加了胆汁酸的排泄,从而降低胆汁酸水平和血浆胆固醇浓度。 ②可被肠道中微生物发酵而产生短链脂肪酸，可抑制肝脏中胆固醇的合成。 ③可促进LDL一C分解。 ④可在消化道中形成高粘度环境，阻碍消化道对脂肪，胆固醇和胆汁酸的吸收。 降血糖 每天食用葡聚糖燕麦食品后，患者血糖水平可降低约50%，使用燕麦食品有显著降低血糖作用燕麦汗葡聚糖可通过降低血脂含量，改善血液流动性能,加快糖类成分在吸收利用过程中的转运速度和效率，同时对糖尿病所并发的肝肾组织病变有良好的修复作用，并且可有效降低肝糖原的分解，从而导致血糖降低。 增强免疫力 燕麦葡聚糖具有免疫调节作用,燕麦p一葡聚糖可使小鼠淋巴细胞增值,增强小鼠 抵抗细菌侵袭的能力；可刺激小鼠腹膜巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF一ALPHAhe)和白介素一1(In-terlukinIL一1)及巨噬细胞p338DI的释放，经灌胃或肠外注射燕麦葡聚糖,小鼠血清免疫球蛋白数量明显增加，说明燕麦葡聚糖具有提高小鼠免疫力的作用。 抗癌功能
转葡萄糖苷酶1
申报资料 Dossier 食品添加剂新品种New food additive 转葡糖苷酶Transglucosidase
公开征求意见的内容： 2、通用名称、功能分类，用量和使用范围 通用名称：转葡糖苷酶Transglucosidase 来源：李氏木霉Trichoderma reesei 供体：黑曲霉Aspergillus niger 功能分类：加工助剂食品用酶制剂 使用范围：主要应用于谷物加工，如低聚异麦芽糖的生产。用量：按生产需要适量使用，在低聚异麦芽糖的生产中的 推荐使用量为每吨干淀粉0.5-1.5公斤。
3、证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件 该商业化的转葡糖苷酶产品将替代本公司目前的由黑曲霉生产的转葡糖苷酶。李氏木霉是公认安全且产蛋白能力较高的微生物。本公司经过多年对该菌种基因、代谢能力的研究与改良，将其作为宿主菌开发并进行DNA重组表达。我们所开发的李氏木霉生产菌（表达了天然黑曲霉的转葡糖苷酶基因）与传统的黑曲霉相比，李氏木霉产酶的效率更高，生产过程更加稳定，从而节约了宝贵的资源，包括原料、能源和水，从可持续发展的观点，李氏木霉比传统的黑曲霉的生产更有优势。 该酶的使用与目前由黑曲霉生产的转葡糖苷酶相同。使用转葡糖苷酶的主要目的是把谷物淀粉中的低聚麦芽糖转化为低聚异麦芽糖（IMO）。在上述应用中，该酶可同时催化α-D-低聚葡萄糖的水解和转苷反应。转苷反应主要发生在葡萄糖基的6-OH上，从而使D-葡萄糖转化为异麦芽糖，以及从麦芽糖转化成潘糖。转苷反应也可发生在D-葡萄糖基的2-OH或3-OH上，形成曲二糖和糖化曲二糖，一部分还发生在4-OH上形成麦芽糖。该酶作用于麦芽糖，可以产生等摩尔浓度的潘糖（4-α-葡糖基麦芽糖）和葡萄糖。转苷反应的结果是低聚麦芽糖被转化成低聚异麦芽糖。
微生物果胶酶研究进展
微生物果胶酶研究进展 果胶质广泛存在于高等植物中，是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分，植物的细胞组织间起“黏合”作用。近几年来，果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注。能够分解果胶质的酶被称作果胶酶(pectinase)，它广泛存在于各种微生物中，细菌、真菌和放线菌都能产生相关酶类。果胶酶类的应用领域非常广泛，不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中。果胶酶主要分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果胶酯酶等几大类，研究果胶酶各组分的性质，有利于果胶酶的单一酶种的开发利用。同时微生物果胶酶的分子生物学研究将有助于更合理地利用果胶酶。 1、果胶简介 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起[1]。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大致的结构简图如图1所示，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布。
山药多糖对葡萄糖苷酶抑制实验设计汇编
山药多糖提取物对葡萄糖苷酶的抑制实验 2 0 1 6 年5 月
一．所需试剂 （1）PBS缓冲液 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至6.8，最后加蒸馏水定容至1L 称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g,KH2PO40.24g，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至6.8，加水定容至1L，常温保存备用。 实际配制500ML即可。 （2）3 mmol/L 谷胱甘肽溶液 谷胱甘肽分子量：307.32，称取46.1mg谷胱甘肽定容至50ml蒸馏水中，即为3 mmol/L 谷胱甘肽溶液。 （3）0.01 mol/L PNPG 溶液 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷分子量：301.25,称取150.6mg定容至50ml蒸馏水水中，即为0.01 mol/L PNPG 溶液。 （4）0.2 mol/L Na2CO3溶液 Na2CO3分子量：105.99，称取2.12g定容至100ml,即为0.2 mol/L Na2CO3溶液一．实验流程 1】酶活性的测定 1.检测样配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL， 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液60 μL， 37 ℃保温10 min 后， 加0.01 mol/L PNPG 溶液100 μL，摇匀， 37 ℃保温继续反应10 min， 加入0.2 mol/L Na2CO3溶液800μL终止反应， 于400 nm 波长处测定吸光值. 2.参比配置 取67 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1.4 mL、 3 mmol/L 谷胱甘肽溶液40 μL，
β-葡萄糖苷酶的研究(中文)
β-葡萄糖苷酶的研究 来源：添加时间：2011/2/24 13:43:00 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。 2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定方法 β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。 3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质 不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表1）。 3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小 β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250 kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构成。此外，有的菌株本身含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有时来源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是两种不同分子量酶的混和物，甚至是多种不同分子量酶的混合物。 3.2 β-葡萄糖苷酶最适pH值及pI值 目前很多的研究结果表明，β-葡萄糖苷酶为酸性蛋白酶，其最适反应pH值一般在3.0～7.0范围内，其中许多酵母、细菌的胞内β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值接近6.0左右；一般β-葡萄糖苷酶的pH值稳定性范围较广，在pH值3.0～10.0范围内，糖苷酶的稳定性较好。对大部分β-葡萄糖苷酶而言，它们的pI值都在酸性范围，并且变化不大，一般在3.5～5.5之间。如来源蜜蜂的β-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5～4.8。 3.3 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为40～110 ℃。一般来说，来自古细菌的β-葡萄糖苷酶其热稳定性和最适反应温度要高于普通微生物或动