胚胎工程--体外受精及胚胎培养(试管婴儿)

精子获能常用的化学物质可能是下列哪一种( )

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小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

3.2体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植

高二生物选修三导学案使用时间: 2014年3月25日编制:高海乐杨建磊张双双 审核: 包科领导: 班级：小组：姓名：评价： 专题三胚胎工程 3．2体内受精、早期胚胎培养和胚胎移植 【学习目标】 1.熟练掌握体外受精、胚胎移植的过程，能正确理解胚胎移植的生理学基础。 2.自主学习，合作探究，学会应用试管动物技术解决实际问题。 3.全力以赴，感受生物科技发展带给人类的贡献。 【学习重难点】 重点：1.体外受精的主要步骤 2.胚胎移植的过程和生理学基础 难点：1.精卵的采集与培养 2.胚胎移植的生理学基础 【使用说明及学法指导】 1.先通读教材，划出重点，然后再完成导学案，并把不明白的问题标出来，再翻阅课本，解决问题。 有些问题需要认真思考和总结，切忌抄课本和资料。 2.A层完成掌握学案，并完成课后题的相关内容。B层掌握好学案的内容，C层完成好学案。 预习案 1.勾画并记忆试管动物技术的概念，写出体外受精的三步聚？ 2.结合课本，写出收集卵母细胞和精子的方法各有哪些？ 3.在体外使精子获能的主要方法有哪两种?受精时的外界培养液有哪两种？ 4．早期胚胎培养的目的及培养液的成分？ 5.勾画并记忆胚胎移植的概念及进行胚胎移植的原因；写出胚胎工程的最后一道工序？ 6. 在课本中勾画并记忆胚胎移植中供体牛和受体牛各自的作用。写出胚胎移植的意义是什么？ 7.胚胎移植的生理学基础是什么？ 8.同期发情处理、超数排卵采用的激素分别是什么？冲卵指的是什么？

巩固训练 （A/B/C层）1．下列关于精子的说法，不正确的是( ) A．精子的发生从初情期开始 B．它与卵细胞的受精发生在子宫内 C．精细胞变形为精子时保留的细胞器主要是线粒体 D．精细胞变形为精子时细胞内的一些物质最后脱落 （A/B/C层）2．下列有关卵子的产生说法中，正确的是（） A．哺乳动物卵泡的形成是在初情期 B．排出成熟卵子细胞的过程即为排卵 C．卵子形成时的分裂过程均在卵巢内完成 D．卵子产生中的减数第二次分裂是在精子和卵子的结合过程中完成的 （A/B/C层）3．在受精作用过程中，体现受精实质的是（） A．同类生物的精子和卵细胞互相识别B．精子的头部进入卵细胞 C．卵细胞膜增厚形成受精卵膜D．雄原核与雌原核互相融合 （A/B/C层）4．2009年2月2日，山东省干细胞工程技术研究中心的科学家宣布成功克隆出5枚符合国际公认技术鉴定指标的人类囊胚。该课题首席专家称他们掌握此项技术不是为了制造克隆人，而是进行人类治疗性克隆研究。下列有关囊胚和桑椹胚的说法中，不正确的是（） A．桑椹胚的各细胞结构功能基本相同 B．囊胚期细胞出现了细胞分化，但遗传物质未发生改变 C．囊胚期细胞分化是由遗传物质突变引起的 D．囊胚期内细胞团和滋养层细胞差异不是复制水平上的差异，而是转录水平上的差异引起的 （A/B层）5.下图是某种动物发育的几个阶段，下列有关叙述不正确的是（） A．在由2～11的过程中，可能发生细胞的增殖和衰亡 B．在1～11的过程中细胞的全能性逐渐减小 C．图示细胞的增殖方式是有丝分裂 D．细胞分化过程从2开始

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

胚胎干细胞体外培养

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

小鼠胚胎干细胞的培养

小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

不孕症病人体外受精与胚胎移植的护理

不孕症病人体外受精与胚胎移植的护理 Ｎｕｒｓｉｎｇ　ｃａｒｅ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆｏｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ 陈向红，陈玉珍，陈惠仪，蒙顺好，阙文清 Ｃｈｅｎ　Ｘｉａｎｇｈｏｎｇ，Ｃｈｅｎ　Ｙｕｚｈｅｎ，Ｃｈｅｎ　Ｈｕｉｙｉ，ｅｔ　ａｌ （Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５１０１２０Ｃｈｉｎａ） 摘要：［目的］探讨整体护理干预对不孕症病人体外受精与胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）治疗的影响。［方法］将２０１１年１月—２０１１年１０月接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的１　４６１例病人随机分为护理干预组和对照组，对照组给予常规护理，护理干预组实施整体护理，比较两组病人的术后妊娠率。［结果］护理干预组病人的妊娠率明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。［结论］不孕症病人采用ＩＶＦ－ＥＴ结合整体护理，可有效提高妊娠成功率。 关键词：不孕症；体外受精；胚胎移植；护理Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｐｒｏｂｅ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｏｌｉｓｔｉｃ　ｎｕｒｓｉｎｇ　ｉｎｔｅｒ－ｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＶＦ－ＥＴ）ｆｏｒ　ｐａ－ｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｆｏｒｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄａｔａ　ｏｆ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１４６１ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｈｏ　ａｃｃｅｐｔｅｄ　ＩＶＦ－ＥＴ　ｉｎ　ａｆｆｉｌｉ－ａｔｅｄ　Ｓｕｎ　Ｙａｔ－ｓｅｎ　ｍｅｍｏｒｉａｌ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｆｒｏｍ　Ｊａｎ．ｉｎ　２０１１ｔｏ　Ｏｃｔ．ｉｎ　２０１１．Ａｌｌｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｎｕｒｓｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｒａｎｄｏｍｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｔ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎｂｏｔｈ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｉｎ　ｎｕｒｓｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｖｅｎ－ｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩＶＦ－ＥＴ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｔｏ　ｈｏｌｉｓｔｉｃ　ｎｕｒｓｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ　ｃａｎ　ｅｆ－ｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ；ｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ；ｎｕｒｓｉｎｇ 中图分类号：Ｒ４７３．７１ 文献标识码：Ｂ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－４７４８．２０１２．０９．００１ 文章编号：１６７４－４７４８（２０１２）３Ｃ－０７６９－０２ 体外受精与胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）是一项高、精、尖的助孕技术，是近年来治疗不孕症的主要手段之一，首先取出不孕夫妇女方的卵子和男方的精子，精子经过密度梯度离心加上游法洗涤，并于卵子取出３ｈ～４ｈ后加进培养皿中进行体外受精并培养成胚胎，４８ｈ～７２ｈ后再将胚胎植入母体宫腔内以达到妊娠目的［１］。我国育龄女性中约有１０％患有不孕症，不孕原因包括输卵管性不孕、免疫性不孕、子宫内膜异位症及多囊卵巢综合征等，男性病人有弱精、少精症［２］，其有效治疗手段均可选择ＩＶＦ－ＥＴ，但研究发现配合整体护理干预可以明显提高病人术后的妊娠率，因此值得深入研究。本组回顾了２０１１年１月－２０１１年１０月在我院接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的１　４６１例病人的临床资料，探讨整体护理干预对不孕症病人ＩＶＦ－ＥＴ治疗的影响。 １　资料与方法 １．１　一般资料　本组１　４６１例接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的不孕症病人，经诊断女方宫腔形态均正常，年龄２２岁～４３岁（３０．８岁±５．５岁），男方年龄２４岁～４７岁（３４．１岁±４．９岁）；不孕年限２年～２１年（９．３年±５．５年）；原发性不孕６５９例，继发性不孕８０２例；不孕原因：输卵管不孕５１６例，排卵障碍２７例，男方因素２１７例，子宫内膜异位４４例，原因不明６２例；双方因素４２５例，多重因素１７０例。随机分为护理干预组７３０例和对照组７３１例，两组病人在性别、不孕年限及不孕因素等方面均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），具有可比性。 １．２　方法 １．２．１　治疗方法　根据病人个体情况制订治疗方案，本中心常用的方案有：长方案、短方案、微刺激方案、拮抗剂方案及超长方案。实施短方案、微刺激方案、拮抗剂方案的病人于月经周期１ｄ～３ｄ使用降调节药物和促排卵药物；超长方案适合子宫内膜异位症的病人，需要治疗一段时间后才进入试管婴儿周期；实施长方案的病人在其月经周期２０ｄ左右使用降调节的药物，然后于下次月经３ｄ～５ｄ加用促排卵药物，连续使用１０ｄ左右，每次使用的剂量是根据病人的卵巢功能来决定的，待卵泡成熟，加用绒毛膜促性腺激素促卵泡最后成熟，３４ｈ～３６ｈ后经阴道在Ｂ超监测下穿刺取卵。取男方精子做精液优化处理后，与卵子行体外受精，在体外培养４８ｈ～７２ｈ后，再将胚胎植入到母体宫腔内，并于术后２周检查病人妊娠是否成功。 １．２．２　护理方法　对照组实施常规护理，护理干预组实施整体护理，具体方法有如下。①健康教育：围术期实施一对一的健康教育；每天下午由专人组织病人上课，初期以自愿为原则，以后规定进入周期治疗的病人都必须听课；为进入周期的病人派发一些文字资料，由护理人员交代不同阶段注意事项，态度亲切；教育内容包括不孕症、ＩＶＦ－ＥＴ的相关知识，检查治疗的目的、方法，试管婴儿流程，费用介绍、成功率，手术过程示意，预期结果、注意事项，如何配合治疗等；为病人提供相关报刊、书籍或健康教育手册［３］，同时告知病人可电话咨询任何相关问题。②心理护理：护理人员需重视病人的心理变化情况，主动关心病人，耐心听取病人主诉，并予以适当的心理疏导；耐心告知病人治疗的良好预后，以安抚病人的不良情绪；鼓励病人多与他人交流，以分散注意力。③围术期护理：取卵前要详细告知病人取卵过程及注意事项，包括用药及注射情况、饮食情况、术前排尿及阴道灌洗方法等。态度亲切热情，耐心解答病人疑问，以安抚病人紧张等负面情绪。取卵时，护理人员全程陪同，指导病人正确的体位和减轻疼痛的方法，术前可采用镇痛或麻醉止痛来减轻病人术中的疼痛。取卵后，告知病人手术情况，取卵的数目，有无阴道塞纱，定时为病人测量血压，肌肉注射黄体酮或绒毛膜促性腺激素，并告知下次回院时间及做好胚胎移植的准备。胚胎移植时，嘱咐病人适量饮水至膀胱中度充盈时进行，同样，在移植

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1　刘红林2　范必勤1　钟　卉3　丁家桐4 (1　江苏农科院牧医所,南京　210014;2　南京农业大学动物科技学院,南京　210059;3　南京铁道医学院,南京　210009;4　扬州大学农学院动物科学系　225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1　材料和方法 111　动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112　溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113　胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α

小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究

江丙农业学报2010，22(12)：144～146 A c t a A g r i c uhu r ae J i an gxi 小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究 林峰，陈玉霞+，孙克宁，杨婷，田晓军 (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002) 摘要：为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响，分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明：子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0．01)，而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P< O．05)，两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P>0．05)，说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著，且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明：超排处理后，在公母鼠合笼后76～79．5h采胚，胚胎大多处于桑椹胚期，而在公母鼠合笼后88～91．5h采胚，胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期；采用TC M l99+15％胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。 关键词：小鼠；超数排卵；早期胚胎；体外培养；冲胚方法 中图分类号：Q132．8文献标识码：A文章编号：1001—8581(2010)12—0144—03 St udy on E f f ect of Super ovul a t i on and i n vi t r o C ul t ur e of Ear l y Em br yo i n M ous e LI N Fe n g，C H E N Y u—xi a‘，SU N K e—ni ng，Y A N G Ti ng．T I A N X i ao—j u“ (C ol l ege of A n i m a l H us ba ndr y a nd V et er i nar y M e di ci ne，H enan A矛c ul t ur al U ni ver si t y．Z he ngzhou450002，C hi na) A bs t r act：I n t hi s paper．t he e ffe c t of dif f erent m e t h ods of c o l l ec t i n g e m br yos on t he s uper ovul at i on of m i c e w a s s t udi ed，and t he e m br yos i n t he suoer ovul at ed m i Ce w er e coll ected by usi ng t he ut erus—m i nc i ng m e t ho d a nd ut er us—col l ect i ng m e t hod re s pec t i ve l y．ne r es ult s show e d t ha t t he aver age num ber of eggs and em bryos obt ai ned by t he ut er us—co l l ect i ng m e t ho d w er e,ext r em el y s ignif i ca ntl y hi gher(P<0．01)t han t hos e obt ai ned by t he ut e r us—m i nci ng m e t hod，an d t he aver age nu m ber of us abl e em bryos obt ai ned by t he u t e r r us—coll ect i ng m e t he d w强si gni f i cant l y hi gher(P<0．05)t han t ha t di d by t he ut erus—m i nc i ng m et hod．ne aver age num be r of an-fe r t i l i zed eggs obt ai ned by t hes e t w o m e t h ods w a s no t s ignif i cant ly di f f er e nt(P>O．05)．So t he s uper ovu l at i on e ffe c t of m i c e W a S s i g-nif i e ant lv i nnue nee d by t he m e t ho d of coll ect ing em bryos．T he obs er vat i on r es ult s of ear l y e m br yos de vel opm ent i ndi cat ed t hat m ost of t he em bryos coll ected76—79．5hour s aft er com bi ni ng cages w e r e at m or ul a s t age．w hi l e m os t of t}l e em bryos coll ected88～91．5 hour s a ft e r com bi ni ng cages w e r e a t com pa ct e d m or u l a s t a ge and bla s t o e yst s t ag e．I t W a S f eas i ble t ha t t he em bryos of m i c e w er e cul t i—vat ed i n vi t ro by usi n g t he m i xed s o l ut i o n of T C M l99and15％F C S． K e y w or ds：M ouse；Sup er ov ul at i on；E ar l y em br yo；I n vi t ro cul t ur e；M e t hod of coll ect ing em bryos 雌性哺乳动物一生所产的卵子总数早在其胚胎发育形成卵巢的过程中已被确定，成熟卵子在成年后的发情周期中分别排出，但是单纯依靠动物的自然排卵，一方面所得到的卵母细胞数或胚胎数较少，另一方面又消耗大量的时间和浪费较多的动物．因此为了获取大最的胚胎，多采用超数排卵的方法，即利用外源性促性腺激素诱发多个卵泡同时发育并排出具有正常受精能力的卵子¨。1。该技术大幅度地开发利用了卵巢上的卵母细胞资源，为胚胎工程和转基因动物等相关领域的研究提供了大量的研究素材。小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强等特点，是畜牧兽医科学研究领域应用最为广泛的实验动物，研究小鼠超数排卵对动物胚胎工程等研究具有重要意义。 近年来，随着遗传工程小鼠的大量开发，人们对小鼠卵母细胞和胚胎的需求量日趋增多，因而完善的超数排卵技术是遗传工程小鼠研究获得成功的重要前提条件。到目前为止，能够获得大量胚胎来源的技术仍为超数排卵。超数排卵反应是一个极其复杂的生理过程。研究资料表明，小鼠超排效果受激素的种类、剂鼍以及动物的生理状态等多种因素影响，这些因素错综复杂，使超数排卵效果很不稳定H—o。为了进一步研究冲胚方法对超数排卵的影响及小鼠冲胚的有效方法，本试验在控制以上因素一致的条件下，采用两种不同的冲胚方法来进行对比，以期为今后的小鼠超数排卵研究提供一定的参考依据，为胚胎生物技术研究提供借鉴。 l材料与方法 1．1试验地点和时间本试验于2009年l O月16日至2010年5月27日在河南农业大学牧医工程学院胚胎生物技术研究室进行。 1．2试验动物 1．2．1试验动物的条件试验用昆明小白鼠购于河南省实验动物中心。雌性小鼠(未经产)为17周龄、体重30 收稿日期：2010一 基金项目：河南省重点科技攻关计划项目(82102130005)；河南省蕈大科技攻关计划项目(0422011200)。 作者简介：林峰(1972一)。男．山东栖霞人．副教授，博士，主要从事动物胚胎生物技术研究。通讯作者：陈玉霞。

体外受精-胚胎移植IVF及其衍生技术临床操作规程

体外受精—胚胎移植及其衍生技术临床操作规程第一节不孕症的诊断 一对夫妇在没有采取避孕措施的情况下，有规律性生活1年而未能自然妊娠，即诊断为不孕症（WHO，1995）。首诊时详细询问并记录患者的不孕时间、既往性生活史、既往妊娠史、既往检查及结果、遗传病史、家族史，了解患者是否可能暴露于毒性物质,夫妇双方有无酗酒、吸烟、非处方镇静剂的使用、吸毒等，详细询问可能影响生育能力的疾病史，包括糖尿病、内分泌疾病、自身免疫性疾病，了解月经周期、经量、经期、是否痛经等，询问患者性生活的频率,了解有无性功能障碍，并根据情况建议不孕症夫妇接受以下检查,以明确不孕症病因。 1、女方因素 （1）月经第2~5天，抽血检查性激素水平：FSH、LH、E2、PRL、T。 （2）月经干净3~7天，输卵管碘油造影检查或腹腔镜检查。 （3）阴道B超自然周期排卵监测，至卵泡破裂。 （4）黄体中期（监测排卵后1周）抽血检查孕激素水平。 （5）必要时宫腔镜检查了解子宫腔内病变。 （6）抗精子抗体。 2、男方因素 （1）精液常规分析，结果异常需复查1~2次 （2）按Kruger严格形态标准进行精子形态分析 （3）连续3次精液离心检查均未发现精子者建议行以下检查： 经直肠精囊、前列腺彩超（TURS） 染色体核型分析 性激素：FSH LH T PRL E2 睾丸/附睾穿刺，了解睾丸/附睾中是否有成熟活动精子 （4）抗精子抗体

第二节体外受精与胚胎移植的适应症与禁忌症 一、体外受精与胚胎移植的适应症： 1、女方各种因素导致的配子运输障碍。 2、排卵障碍。 3、子宫内膜异位症。 4、男方少、弱精子症。 5、不明原因的不育。 6、免疫性不孕。 二、体外受精与胚胎移植禁忌症： （1）如有下列情况之一者，不得实施体外受精-胚胎移植及其衍生技术 ①男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病； ②患有《母婴保健法》规定的不宜生育的、目前无法进行胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病； ③任何一方具有吸毒等严重不良嗜好； ④任何一方接触致畸量射线、毒物、药物并处于作用期； （2）女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。 第三节体外受精与胚胎移植助孕前常规检查 1、全身体格检查：血压、脉搏、身高、体重（BMI）、皮肤粘膜、心脏、肺脏、乳房、肝脏、脾脏、肾脏、脊柱、四肢等。 2、女性生殖系统检查：有无生殖道畸形、分泌物异常，宫颈有无糜烂，子宫大小、质地、位置、活动度，附件有无包块及其大小。 3、实验室检查： 女方检查项目男方检查项目 血常规血型（ABO Rh）尿常规血型（ABO Rh） 白带常规细胞涂片或阴道镜精液常规 支原体衣原体淋球菌支原体衣原体淋球菌