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浓香型大曲中酯化酶细菌的分离鉴定及产酶条件研究(1)

浓香型大曲中酯化酶细菌的分离鉴定及产酶条件研究(1)
浓香型大曲中酯化酶细菌的分离鉴定及产酶条件研究(1)

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌(Fungi)是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其他都有分支或不分支的丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种,属于病原真菌。 一、基本性状 (一)形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yeast)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(mold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)的不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在37℃或体内呈单细胞的酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似,有定型的细胞核及完善的细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。 1.菌丝(Hypha)真菌在合适的环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2.孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种:关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数是无性孢子。 (1)厚壁孢子:当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成,呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

根际细菌分离纯化及鉴定实验方案

根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案 一、方法: 稀释涂布分离法 二、培养基: 1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar) 2、牛肉膏蛋白胨培养基(NB ) 3、金氏培养基B (King ) 4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar) 5、YG 6、NA 7、无氮培养基 8、分解纤维素菌筛选培养基 9、TSA 培养基 三、实验流程 梯度稀释 涂板分离 挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元 连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品

四、具体实验方案 1、采集根际土壤样品:将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。 2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离:梯度稀释土壤样品,取10-1、10-2、10- 3、10- 4、10- 5、10-6六个梯度涂板,每个浓度梯度涂3个平行,过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。选择合适的浓度平板,根据形态、大小、颜色,挑取不同菌株的典型单个菌落,达到分离纯化的目的。 3、挑取不同单菌落于斜面保种:通过上述的分离纯化步骤,可筛选得到不同的菌株,对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。最后斜面放于4℃冰箱保存,备用。 4、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min,37℃)培养。过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。剩下的菌液用于以下实验。 5、提取DNA(CTAB法): (1)取1.5ml菌液于1.5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。 (2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。 (3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),混匀,于55℃温育1h。 (4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl溶液,混合后再65℃温育30min。 (6)冷却后加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP 管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。 (7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。 (8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。 (9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属(Shigellae)细菌又称痢疾杆菌,引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿,死亡110万,发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高,如阿根廷990.6/10万、印度972.3/10万;发达国家相对较低,如美国6~12/10万、德国2.7/10万、法国0.3/10万;我国上世纪50~80年代发病率在46.37~1018.93/10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位,但在卫生状况不良的地区,发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感,各年龄组均可受到感染,5岁以下儿童发病率最高。 据估计,在临床就诊的腹泻病人中的5%~15%是志贺菌引起的,而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见,发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%,但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现,除印度次大陆地区较为常见外,其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性,发病高峰为夏秋季,通常在7~9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容: 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据; 缺乏快速、简便的病原学诊断方法,细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍; 志贺菌耐药性谱的不断扩大,细菌性痢疾抗菌治疗难度加大; 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化; 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体(O)抗原,某些新分离菌株有表面(K)抗原。 (一) 菌体(O)抗原 1.型特异性抗原:多糖,光滑型菌株主要抗原;分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原:光滑型菌株次要抗原,主要存在于B群,籍此将菌型分

生物酶法制备生物柴油

生物酶法制备生物柴油 摘要:石油资源日益匮乏,生物柴油已经成为国际新能源研究的热点。生产方 法以及生产原料成为生物柴油发展的两大瓶颈。生物柴油主要是以动植物油为原料,通过酯交换反应而制备的长链脂肪酸酯类物质。目前生物柴油的生产工艺主要有化学法和生物酶法。化学法是当前的主流工艺,但存在能耗高、工艺复杂、醇消耗量大、环境污染等缺点。生物酶法具有对原料中脂肪酸和水含量要求低、工艺简单、反应条件温和、选择性高、醇用量小、副产物少、生成的甘油容易回收且无需进行废液处理等优点,因而被认为是取代化学法生产生物柴油的绿色工艺。生物酶法包括游离脂肪酶催化法、离子液体脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法和细胞内脂肪酶催化法等。全细胞酶法弥补了脂肪酶的生产成本高、使用寿命短、易失活等不足,节省了设备和运行维护费用,成为了未来生物柴油制备的发展方向。收集餐饮废油和工业废油脂,发展高油作物和工程微藻,以此为原料生产生物柴油能够显著降低原料成本。改进传统生物柴油生产工艺,加快脂肪酶酯化工艺的研发,开发原料适应性广、酯化效率高、连续化、自动化程度高的环保经济新工艺,是目前生物柴油产业发展的核心。 关键词:生物柴油;生物酶法;全细胞酶法 1、生物柴油及其利用现状 生物柴油(Biodiesel)是指以植物、动物油脂等可再生生物资源生产的可用于压燃式发动机的清洁替代燃油。生物的柴油的制备过程是通过酯交换反应进行的,酯交换法是指通过酯基转移作用将高粘度的植物油或动物油脂转化成低粘度的脂肪酸酯,该过程需要一定的催化剂才能进行。生物柴油作为可再生清洁能源,具有优良的环保特性,无芳烃,含硫低,含氧高,可达11%,十六烷值高,燃烧性能好,润滑性好,闪点高,运输和使用安全等优点。因此,利用生物柴油作为新能源替代传统柴油,在环保和能源领域都有着非常深远的意义。 随着石油资源的日益匮乏,原油价格的不断攀升,生物柴油的优势尤为凸显,被国际可再生能源界誉为最具发展前景的替代油品,生物柴油的研究也已经成为国际新能源研究的热点。图1所示为2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量。 图 1 2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量

浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究

酿酒 HQUOR MAKING V01.30.No.2 Mar.,2OO3 文章编号:1002—8110(2003)02—0018一o4 浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 王耀,范文来,徐岩2,刁亚琴,陆红珍 (1.江苏洋河集团有限公司,江苏宿迁223725;2.江南大学生物i程学院,江苏无锡214036) 摘要:对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应,与传 统测定方法(需反应100h)相比,它能简单、快捷检测大曲质量,适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应 条件为:在30mL正庚烷有机反应介质中,35 的条件下,0.15M的底物酸,己酸与乙醇的浓度比为1:1.25,加 入15g(干曲)的大曲,仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。 关键词:浓香型,大曲,酯化酶,酯化,测定方法 中图分类号:TS262.31;TQ925 文献标识码:A‘ 0 前言 酯酶(Eaemse E.C.3.1.1.2)亦称羧基酯酶,是指可以水 解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸 酯Ll J。由于该酶既能催化酯的合成,也能催化酯的分解,因 此,白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7 J。酵母、霉 菌、细菌中均含有酯酶[ ,6.。目前已经发现,红曲霉、根霉中 许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5' 。 酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e,E.C.3,1.1,3)是一 类特殊的酯酶,全称Tr/acy/g/ycerd acy/hydro/aseo脂肪酶的正 式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘 油,又能催化脂肪的合成【5.9J。按Novo Nordisk公司的定义, 脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶, 而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。 对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J, 但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20 世纪90年代[ 一·M一刮。 传统的酯化力测定方法【6J,是利用皂化反应和反滴定法 来测定。此法测定时间长,操作复杂。本文研究了利用有机 相代替水相的酯化酶活力的测定。 0.1 传统酯化力的测定【6J 6 先用碱中和酯化液中的游离酸,再加入一定量的碱使酯 皂化,过量的碱用酸进行反滴定,用酚酞作为指示剂。其反 应式为: RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐,初学者不易掌握,寻找一种简便方法。方法:玻璃片上将细菌与碱液混合,用接种环或接种针往上挑,观察有无丝状物出现,我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果:用本法鉴别细菌革兰氏染色性质,G^-菌有丝状物出现,即拉丝实验阳性,G^+菌无丝状物,拉丝实验阴性经过对照使用,本法具有快速,准确,简便,结果易判断,成本低廉等优点,值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同,革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色,为革兰氏阳性细菌,有的细菌染上复染的的红色,为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌,染色后为红色,细菌形态为短小的杆状,单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌,染色后为紫色,细菌形态为杆状,比大肠杆菌大,可排成链状的,有的菌体里有椭圆芽孢(无色)或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群,但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种,其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌,是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官,可引起急性炎症或继发感染;有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时,可判断它们已被粪便污染。因此,大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 (一)形态与培养特性 【材料与方法】 1.大肠杆菌革兰染色标本片。 2.大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1.大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌,两端钝圆或稍弯曲,呈分散排列。 2.菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形,中等大小,灰白,整齐,光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色,有金属光泽 (二)生化反应 【材料与方法】 1.取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管,37℃培养24h,观察结果。 2.取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基,37℃培养24h,观察结果。 3.靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验),见实验四。 【结果】

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法,了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点,了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙(或其他患细菌性疾病的水产动物)、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌(虎纹蛙白内障病的病原) 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机(包括离心管)、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 (一)病原菌的分离与鉴定 1 .培养基的制备 ( 1 )普通肉汤培养基: 按以下剂量称取各种试剂(先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏),置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ~ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤,将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器,待灭菌。 ( 2 )普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质,对病原性细菌无营养作用,但在水中加温可融化,冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ~ 2 %即可固定培养基,如加入 0 . 3 ~ 0 . 5 %则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中,加热煮沸,待琼脂完全融化后,将 pH 调至 7 . 4 ~ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌,并控制火力,不使培养基溢出或烧焦,并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤,固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤(切勿使培养基凝固在纱布上),之后按实验要求,将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中,包扎好待灭菌,将培养基置于高压蒸汽锅内,121 ℃ 灭菌 15 ~ 30min ,趁热将试管口一端搁在玻棒上,使之有一定斜度,凝固后即成普通琼脂斜面,也可直立,凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触,若将瓶紧握手中觉得烫手,但仍能握持者,此即为倾倒平皿的合适温度( 50 ~60 ℃ ),每只灭菌培养皿倒入约 15 ~ 20ml ,将皿盖盖上,并将培养皿于桌面上轻轻回转,使培养基平铺于皿底,即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分,如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性,故应过滤除菌,再按规定的量加入培养基中。 2 .病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物,病原菌的分离方法如下。 体表分离:先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒,再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织,接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官:用 70 %酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭,进行体表消毒,无菌打开病鱼的腹腔,以肝、肠、心脏等脏器为材料,先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

动物检验检疫学 实验一 动物病原细菌的分离与鉴定

实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定:利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性,观察细菌培养特征; 确定细菌的血清型、毒力因子:血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征:37℃,培养24h,各种培养基生长特征: 普通营养琼脂平板:白色圆形,隆起,中等大小 麦康凯琼脂:红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基:底层变黄,产酸产气 伊红美蓝培养基:黑色、金属光泽 革兰氏染色:革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定:玻片凝集实验:颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中,为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用,利用O抗原的耐热性高于K抗原,实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1)材料:可疑病料,需提前三天提供小鼠 2)菌株:致病性大肠杆菌菌株 3)试剂:营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4)仪器:显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天: 1.)处死小鼠,无菌解剖 2.)观察各脏器是否出现肉眼病理变化; 3.)无菌采集内脏病料,通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯(CT-MAC)琼脂平板各一块,37℃培养24h; 4.)同时无菌挑取一小块病料,直接涂片,吉姆萨染色,油镜观察组织中的细菌特征; 第二天 5.)挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤,37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖(醇)类发酵实验:接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基,麦芽糖发酵培养基,一支接种,一支对照;接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚(Indol)试验:接种到胰蛋白胨水(含色氨酸)培养基中,37℃培养24-48h。 甲基红(Methyl red)试验:将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中,37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验:将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中,37℃培养48h。 硫化氢试验:将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中,37℃培养24h。 柠檬酸盐试验(Citrate utilization):取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上,37℃培养24h。 第三天 1.观察现象,滴定检验

细菌分离纯化及鉴定protocol

细菌分离纯化培养及鉴定protocol 样品菌株分离: 准备工作 1用报纸将平板包好(约12个一包)灭菌后放入烘箱烘干,最好隔夜; 2按照培养基的配方配制好液体培养基后,调pH值(注意灭菌后培养基pH会略有升高),其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后,倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二,约一半左右;剩余液体培养基加入试管中,每支5ml(其中3ml用于保种,2ml用于提取菌株基因组DNA),用胶塞封好,与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌; 3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟,将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后,在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中,每块板中倒入约20ml,厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内,待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的,可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称,标注日期,姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上,尽量把培养皿托平,将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全,待冷却后,在酒精灯下将液体涂布均匀(最好涂布至培养基将液体全部吸收)。 5将涂好的培养皿正置培养2小时后,用封口膜封好,倒置培养。

定时观察平板,描述菌落的颜色、形状,记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化: 1待涂布好的培养皿上长出单菌落后,用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化,挑取的菌落用记号笔标出。 2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全,稍冷却后,在平板上进行Z字形三个方向划线。 3若在新板上又长出新菌落,再次分离划线 4划线需做至少2-3次,直至菌落完全纯化(纯化步骤很关键) 保种: 1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内(注意要取单菌落),摇床150r/min, 28℃培养,直到其生长至指数期 2在2ml冻存管(预先灭菌并烘干)中加入1ml 30%甘油(甘油预先配置好灭菌后待用),再加入1ml上述1中的菌液,盖紧管盖,混匀后在管壁做好样品标记和日期,同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管,做好记录,放入冷存盒,放入-80度冰箱内,记录存放位置。 4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。 DNA的提取:可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行

实验 金黄色葡萄球菌的分离和鉴定

实验题目金黄色葡萄球菌的分离和鉴定 一、实验目的 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在,空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而,食品受其污染的机会很多。近年来,美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题,在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒,占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占到45%,我国每年发生的此类中毒事件也非常多。为控制金黄色葡萄球菌的对人的危害,我们要分离出它们并研究。 二、实验原理 典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径0.8um左右,显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜,革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧,最适生长温度37°C,最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1—2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10—15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气。甲基红反应阳性,V—P反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感,十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 三、实验材料和设备 1.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基(13%NaCl):牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠130g,琼脂15g,蒸 馏水1000ml,121℃灭菌20min后倒平板。 肉汤培养基:酵母膏5g,蛋白胨10g,氯化钠10g,蒸馏水1000ml,121℃灭菌20min。 甲苯胺兰-DNA平板 2.试剂 磺胺类药物、革兰氏染液 3.仪器和设备 显微镜、超净工作台、水浴锅、培养皿、锥形瓶、移液器、灭菌锅、培养箱、试管、载玻片、接菌环。 四、实验方法 金黄色葡萄球菌的分离: 1.称取5g土样,在无菌条件下放入灭菌的锥形瓶中,加入50ml蒸馏水,再加入200ul 磺胺类药物,振荡10min,使土样充分混匀。利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性,杀死其他细菌。 2.从上述锥形瓶中取5ml上清液放入一只干净的试管中,30℃,200rpm,24h。 3.取培养好的菌液,按梯度稀释法稀释土壤悬液,依次制备成100、1000、10000、100000倍悬液后,分别取200ul涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,置于37℃培养箱中培养24h。利用高盐培养基抑制其他细菌的生长,从而分离金黄色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌的鉴定: 1.菌落形态:菌落较小,较湿,较透明,边缘整齐,隆起。

病原细菌的分离与鉴定

病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海,宽容作舟,泛舟于海,方知海之宽阔;生活如山,宽容为径,循径登山,方知山之高大;生活如歌,宽容是曲,和曲而歌,方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期:2009-05-09 浏览次数:827 字号:[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术,促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术,增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力,为预防、控制和消灭畜禽病原微生物,保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌,对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项: 1.病料采集 (1)病料的种类主要决定于疫病的性质,一般方法为: ①全身感染→血液及内脏; ②局部感染→病患部位; ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染,均应采含菌最多或病变明显的组织 (2)病料的采集时间也应特别注意: ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化; ②患畜死后→应立即采集病料,越早越好。 2.无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中,既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求,必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下,头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程,例如:病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用,金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min,玻璃器皿可高压灭菌也可

细菌分离及鉴定的实验方案

从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料:新鲜土壤。 a)培养基:灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基;高氏一号培养基;马铃薯蔗糖培养基; 细菌半固体培养基;淀粉培养基;葡萄糖酵解培养基;乳糖酵解培 养基;LB培养基 b)试剂:草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器:有玻璃珠100ml三角瓶(1)、培养皿(50套)、试管(20支)、移液 管(3支)、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布,电子天平、记号笔,火材等 相关培养基的配方:

1.1实验总流程 1土壤取样:

2制备土壤稀释液: 2.1. 称取土壤1g,放入99mL无菌水的三角瓶中,振荡20min,即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支,用记号笔分别编上10-3、10--4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液,振荡后静止0.5min,用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中,并在试管内轻轻吹吸数次,使之充分混匀,即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中,需换用不同的吸管(或枪头) 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养,每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管,以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL,加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平,倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 (1)掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 (2)掌握平板划线分离法 (3)掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 (1)实验仪器:试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂:生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB)、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 (1)肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作:把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌,用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中,混匀。 ②细菌得分离接种:用接种环取适量配置好得细菌悬液,在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 (2)肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种:从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上,一部分直接深入培养基中底部,一部分直接涂抹于斜面处,置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断:取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基,观察现象,初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。

(3)肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定:分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只(注意管内得小倒管则应充满液体,不含气泡),用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管,将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。(注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌) ②动力检查:用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中,将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质(吲哚)加入到蛋白胨水培养基中,并观察记录现象。(注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌) ③血清学鉴定:取洁净玻片一张,将其用蜡笔分为两格,两边各取生理盐水一滴,再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中,与生理盐水混匀不摊开。(注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌)然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清,混匀不摊开,轻轻摇动玻片,经1~2min观察两格中有无凝集现象。注:本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行,由于条件有限,因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 (1)EMB培养基现象与分析: ①培养基下部呈现黑色现象,上部培养基仍为红色,培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析:培养基下部出现黑色现象,说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体,由于培养基中含铁,因而硫化氢能够与

土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文(设计) 题目:土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定 学院:生物科学与工程学院 姓名: 学号: 专业:生物工程 年级: 指导教师:职称: 二0一一年五月

摘要 目的:通过分离、筛选与纯化,从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法:根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌,通过平板法进行初筛,根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代,选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛,最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果:从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌,筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌,1号菌株水解圈直径(D)/菌落直径(d)为2.625,2号菌株水解圈直径(D)/菌落直径(d)为2.44,经过五代培养,将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天,然后进行解磷能力测定,测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L,菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L,具有较强解磷能力。结论:通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。 关键词:果树根际土壤,解磷菌,无机磷,分离,鉴定

Abstract Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria. Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal

乳酸菌的分离纯化与鉴定

乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1.培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6.8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫:结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液:番红2.5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

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