一、测序样品要求

一、测序样品要求：

质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；

2．大质粒必须注明载体长度;

3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：

T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；

3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R

三、注意事项:

1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

2．T载体请注明是PGEM-T还是PMD18T、PUC18、PUC19。

3．M13＋/－请注明是M13F，M13R，还是M13F（-47），M13R（-48）。

4．一般测序样品浓度要求：100ng/ul。

5．若临时变更测序，请尽快电话联系我们，E-Mail通知无效，对于通知前已经安排的反应，照常收费。

6．超过3K需要测通的样品，请客户自己提供引物进行测序。

7．简并引物和随机引物不宜用于测序。

8．样品如需返还请填写备注栏，无特殊要求不返还。

9．所送样品及引物，我们将免费保存一个月，超过一个月后如客户无特殊要求，样品自动被销毁。

10．由于自带引物问题或样品本身原因（复杂结构，高级结构等）造成测序失败照常收费，非样品原因造成测序失败免费。

11．对于选择E-mail发送报告的，如对结果有异议，请在接到报告后3天内用电话联系我公司，未联系的则认为您接受结果与费用。

测序定单

客户姓名：必填手机：必填科室电话：必填 E-Mail（1）: 必填

单位科室： E-Mail（2）:

总反应数：

客户签字：

41. ACMG全外显子测序指南.

ACMG全外显子测序指南 摘要：美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）以前为序列突变的解释提供了指导.1在过去十年中，随着高通量测序的出现，测序技术迅速发展。通过采用和利用下一代测序，临床实验室正在进行基因分型，单基因，基因组，外显子，基因组，转录组和遗传疾病表观遗传学检测的不断增加的遗传检测目录。由于复杂性增加，基因检测的这种转变伴随着序列解释的新挑战。在这方面，ACMG于2013年召集了一个由ACMG，分子病理学协会（AMP）和美国病理学家学会的代表组成的工作组，重新审视和修订了序列突变解释的标准和准则。该组由临床实验室主任和临床医生组成。本报告代表ACMG，AMP和美国病理学家利益相关者联盟组成的工作组的专家意见。这些建议主要适用于临床实验室使用的遗传检测的范围，包括基因分型，单基因，panel，外显子和基因组。本报告建议使用具体的标准术语- “致病性”，“可能致病性”，“不确定性意义”，“可能良性”和“良性”来描述在导致孟德尔病症的基因中鉴定的突变。此外，该建议描述了基于使用典型类型的突变证据（例如，群体数据，计算数据，功能数据，分离数据）的标准将突变分类为这五个类别的过程。由于本报告中描述的临床基因检测的分析和解释的复杂性增加，ACMG强烈建议临床分子遗传学检测应在经过临床实验室改进修订批准的实验室进行，结果由相关职业认证的临床分子遗传学家或分子遗传病理学家或同等学科专家进行解释。 关键词：ACMG实验室指导; 临床遗传检测; 解释；报告; 序列变异术语；突变报告 前言 临床分子实验室正在不断增加检测的新的序列突变，因为在检测患者标本时不断发现大量与基因疾病相关的基因。虽然一些表型与单个基因相关，但许多与多个基因相关。我们对任何给定序列突变的临床意义的理解是循序渐进的，其范围从那些几乎肯定是疾病致病性突变到几乎肯定是良性的突变。虽然以前的美国医学遗传学和基因组学会（ACMG）的建议提供了序列突变的解释类别和解释算法，但是这些建议没有提供定义的术语或详细的突变分类指南.1。本报告描述了

50个全外显子测序揭示人类的高原适应机制

50个全外显子测序揭示人类的高原适应机制 Xin Yi等。 Science 329, 75 (2010); DOI: 10.1126/science.1190371 50个全外显子测序揭示人类的高原适应机制 生活于青藏高原的藏族人表现出了对极端高原环境的遗传适应性。我们对50个藏族人进行全外显子基因组测序，它们包含了92%的人类基因编码序列，人均覆盖度为18倍。基因分析显示了该特殊人群等位基因频率的变化，表明这些人对高原环境具有很强的适应性。 研究显示，表现出最强自然选择信号的基因是编码内皮细胞含PAS结构域蛋白-1(EPAS1)的基因，这是一个参与应答缺氧的转录因子。研究显示，EPAS1基因的一个单核苷酸多态性(SNP)在78%的藏族和汉族人群中存在差异，这是目前发现的速率改变最快的等位基因。该单核苷酸多态性与红细胞丰度的关联分析也支持EPAS1改变在适应缺氧环境中的作用，进一步表明它是适应高原环境的一个重要的遗传位点。 在广袤的大自然中生存的人类可能会存在文化和基因上的适应。其中人类面临的最严厉的环境挑战就是高海拔地区(如青藏高原)的低含氧量。这一地区的许多居民在海拔4000米以上居住，那里的氧气浓度比海平面大约低40%。藏族对缺氧环境有着他们自己的遗传适应性，如出生体重(1)，血红蛋白水平(2)，婴儿(3)和运动后的成年人(4)血液中的氧饱和度。这些结果暗示了高原适应机制的自然选择历史，我们对整个基因组的遗传差异进行分析，可能会发现这一点。 我们对中国西藏自治区海拔4300米以上(5)的两个村庄里的50个非亲个体进行全外显子基因组测序。针对将近两万个基因的外显子和侧翼区的34Mb序列，利用罗氏NimbleGen公司(威斯康星州麦迪逊市)的2.1M外显子序列捕获芯片(6)将其富集。测序采用了Illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥市)的基因组分析仪II平台，并使用序列比对程序SOAP(7)将测序片段比对到人类参考基因组序列上[美国生物技术信息中心(NCBI) 36. 3版]。 1深圳华大基因研究院，中国深圳，518083。 2中国科学院研究生院，中国北京，100062。 3加州大学伯克利分校综合生物学与统计系，美国加州，94820。4华南理工大学生物系本科创新班，中国广州，510641。 5西藏自治区人民医院，中国拉萨，850000。 6加州大学戴维斯分校进化与生态学系，美国加州，95616。 7哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根，1165。 8华南理工大学理学院本科创新班，中国广州，510641。 9深圳大学医学院基因组研究所，中国深圳，518060。 10拉萨市人民医院，中国拉萨，850000。 11西藏军区总医院，中国拉萨，850007。 12西双版纳傣族自治州人民医院，中国云南景洪，666100。 *以上机构及相关人员对本研究作出了贡献。如有疑问请联系： E-mail：wangjian@https://www.sodocs.net/doc/166334702.html, ( Ji.W.)； wangj@https://www.sodocs.net/doc/166334702.html, ( Ju.W.)； rasmus_nielsen@https://www.sodocs.net/doc/166334702.html, (R.N.) 全外显子测序的平均深度为18倍(表S1)，但这并不能保证个别基因型的准确性。因此，我们用贝叶斯统计法(5)估算出每个可能的基因型概率，从而估算出单核苷酸多态性(SNP)的概率和每个位点的人类等位基因频率。在藏族样本中总共151825个SNPs有超过50%被识别出是可变的，有101668个超过99%的SNP是可变的(表S2)。Sanger测序验证了56个SNPs 中的53个，至少包含95%的SNP和3%~50%的次等位基因频率。等位基因频率的估算值显示存在过量的低频变异(图S1)，特别是在非同义SNPs中。 该数据与来自于北京的40个汉族人的基因组进行比较[样本来自于中测检测(CHB)人类基因组单体型图计划(HapMap)，属于1000个基因组计划的一部分(https://www.sodocs.net/doc/166334702.html,)]，测序得出汉族人均大约4倍的覆盖度。北京的海拔不超过50米，几乎所有的汉族人来自于海拔2000米以下。在较低的遗传分化基础上汉族人样本与藏族人样本形成鲜明的对比(F ST= 0.026)。这两个藏族村庄是体现该族遗传结构的最小单位(F ST= 0.014)，因此，我们可以将他们当着整个群体进行分析。我们观察到，汉藏之间的等位基因频率有着很强的协方差(图1)，但是过量的SNPs在汉族中频率很低，在藏族中频率中等。 从两个群体同义位点的二维频谱，可以估算出人类历史模型(8)。最佳拟合模型表明，藏族和汉族人群在2750年前出现分化，汉族人口从最初的小规模逐渐增大，藏族人口从最初的大规模逐渐减少(图S2)。这估计是由于藏族人移民至汉族区，双方长期相互渗透所造成的。

全外显子组检测技术参数要求

附件：全外显子组检测技术参数要求 一、公司资质： 1.拥有先进的高通量二代测序平台和高性能计算平台； 2.具有短期处理大量样本，进行全外显子组和全基因组测序的经验； 3.实验室具有国内或国外权威机构的资质认证； 4.*应标的公司必须通过医学遗传中心选送的样本测试（三个以上生物学重复），并且需交 付原始下机数据，以中心提供的标准化流程统一进行质量评估。 二、技术参数： 1)污染防控 具有独立的实验方法进行样本身份鉴定，可追溯样本间发生的错误 2)测序质量 1.Q20平均比例在90%以上。 2.Q30平均比例在85%以上。 3.GC content 分布无明显偏移。 3)测序深度、覆盖度统计 下文涉及的数据均为经过去接头、比对、排序和去重后的有效数据。数据统计涉及的相关软件除特别说明外，应使用默认参数。 1.数据质量要求： 1)Mapped unique reads相对总reads的比例（PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED）不得低于

99% 2)有效数据总量（PF_UQ_BASES_ALIGNED）不得低于10G 3)On targeted bases相对总bases的比例（PCT_USABLE_BASES_ON_BAIT）不得低于50% 4)On and near targeted bases相对总bases的比例（PCT_SELECTED_BASES）不得低于 80% 5)全外显子碱基10X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_10X）不得低于95% 6)全外显子碱基30X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_30X）不得低于80% 7)全外显子组各区域覆盖的一致性统计要求：80%以上的target region的normalized coverage值不得低于0.3 三、项目内容： 500例耳聋患者全外显子组测序技术服务

人全外显子组序列捕获及第二代测序

人全外显子组序列捕获及第二代测序 概述 外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。外显子组序列捕获及第二代测序是一种新型的基因组分析技术：外显子序列捕获芯片（或溶液）可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域，后续利用Solexa/SOLiD/Roche 454测序直接解析数据。 与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的DNA 即可，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。可用于寻找复杂疾病（如：癌症、糖尿病、肥胖症等）的致病基因和易感基因等的研究。同时，基于大量的公共数据库提供的外显子数据，我们能够结合现有资源更好地解释我们的研究结果。 目前，SBC提供的外显子组序列捕获芯片是NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array及Agilent SureSelect Target Enrichment System（Human Exome）。 技术路线 以Nimblegen外显子捕获结合Solexa测序为例加以说明：基因组DNA首先被随机打断成500bp左右的片段，随后在DNA片段两端分别连接上接头。经过PCR库检合格后的DNA 片段与NimbleGen 2.1M Human Exome Array芯片进行杂交。去除未与芯片结合的背景DNA 后，将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来。这些DNA片段又随机连接成长DNA片段

后，再次被随机打断并在其两端加上测序接头，经过LM-PCR的线性扩增，在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。 外显子组测序的实验流程示意图（https://www.sodocs.net/doc/166334702.html,） 生物信息学分析流程图 研究内容 1．外显子组捕获与测序 将基因组DNA随机打断成片段，通过与人全外显子捕获芯片杂交富集外显子区域，通过第二代测序技术对捕获的序列进行测序。 2．基本数据分析 数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。 3. 高级数据分析 高级数据分析内容包括： （1）Clean reads序列与参考基因组序列比对； （2）目标外显子区域测序深度分析； （3）目标外显子区域一致序列组装；

人外显子测序

人外显子测序 药明康德基因中心，陆桂1. 什么是外显子测序（whole exon sequencing）？ 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究基因的SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 2. 外显子捕获试剂盒有哪些？ 目前主要有Roche、Illumina和Agilent三家的外显子捕获试剂。Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针，化学性质稳；Agilent的捕获试剂盒是RNA探针，有可能RNA 不是很稳定。 3. 外显子捕获效率是什么？ 外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。 Nimblegen大约是70% Agilent大约是60% Illumina大约是50% 4. 外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？ 一般做100X或者150X。较高的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现小比例的突变。另外，外显子测序的覆盖不是很均匀，这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。 5. 外显子测序能够测出多大的片段缺失？ 大致能测出50bp的片段缺失。目前的测序主要还是用Hiseq 2000,单侧的测长就是100bp。由于外显子测序的覆盖很不平均，所以如果有大段的缺失，无法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。目前能够测到的，就是在一个read中发现的缺失。一个read的长度也就是100bp，所以大到50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。 6. 外显子捕获可以做CNV吗？ 外显子测序因为有一个杂交捕获的过程，这样就会有一个杂交捕获效率的问题。各个外显子的杂交效率是不同的，其同源竞争的情况也不同，所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。所以一般情况下，外显子测序不能用于CNV的检测。但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测CNV。 现在我们有另外两种常规方法来检测CNV，一种是全基因组重测序，另外一种是用Affymetrix SNP6.0的芯片来测。其中Affymetrix SNP6.0的检测费用大约只有全基因测序费用的1/10，是一个相对经济的手段。 7. 外显子测序的优点是什么？

外显子组测序

技术参数 样品要求捕获平台测序策略 测序深度 项目周期 外显子组测序 37天 1. 单基因病/复杂疾病有效测序深度50X以上 2. 肿瘤有效测序深度100X以上 注：可根据老师研究目的进行更高深度测序 HiSeq PE150 Agilent SureselectXT Custom Kit 样品总量：≥1.0 μg DNA （提取自新鲜及冻存样本） ≥1.5 μg DNA （提取自FFPE样本）样品浓度：≥20 ng/μl 参考文献 外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，通过高通量测序，发现与蛋白质功能变异相关遗传突 变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更加经济、高效。 1. 直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异 2. 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异 3. 针对外显子组区域测序，约占基因组的1％，有效降低费用，周期和工作量 技术优势 生物信息分析 基本信息分析 1. 数据质控：去除接头污染和低质量数据 2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度 3. SNP／InDel检测、注释及统计 4. Somatic SNV／InDel检测、注释及统计（成对样本） 高级信息分析（单基因病） 高级信息分析（复杂疾病） 高级信息分析（癌症） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 新生突变筛选及分析（成三/成四家系） 4.1. de novo mutation 筛选 4.2. 新生突变速率计算 5. 候选基因功能富集 6. 蛋白互作网络分析（PPI） 7. 基因显著性分析 （推荐20对Case/Control or trios样本） 1. 突变位点过滤 2. 显/隐性遗传模式分析（需老师提供家系信息） 2.1. 显性遗传模式分析 2.2. 隐性遗传模式分析 3. 候选基因功能注释 4. 基因功能及通路分析 5. 家系连锁分析 6. 纯合子区域（ROH）分析 1. 易感基因筛查 2. NMF突变特征及突变频谱分析 3. 已知驱动基因筛选 4. 高频突变基因统计及通路富集分析 5. MRT高频突变基因相关性分析 6. OncodriveCLUST驱动基因预测 7. 高频CNV分布及重现性分析 8. 肿瘤纯度／倍性分析 9. 异质性／克隆结构分析 10. NovoDrug高频突变基因靶向用药预测11. NovoDR耐药突变筛选12. 基因组变异Circos图展示 案例解析 ［案例一］ 单基因病研究：外显子测序解析卵巢早衰的遗传因素[12] 卵巢早衰通常是指女性40岁之前闭经，1%的妇女患有此病，病因复杂，被认为受到遗传因素的影响。这项研究利用外显子测序技术首次在中东家系1（MO1DA）的卵巢早衰病人中发现了减数分裂基因中的STAG3基因突变可以导致隐性遗传卵巢早衰，也在小鼠动物模型和卵巢早衰病患中得到了证实。为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理，以及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了一个新的研究途径。 ［案例二］ 复杂疾病研究：外显子测序鉴定肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的致病 基因[13] 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS），又称为渐冻症，是一种成年型的神经退行性疾病。本研究选取了47个父母+患病儿的ALS家系，利用全外显子测序寻找De novo mutatio n 。发现了25个de novo突变基因，进行功能聚类分析，锁定了1个与染色质包装、神经树突生长相关的基因CREST，后期通过细胞试验验证了该基因突变会影响神经元的伸展，证实CREST突变与ALS相关。 ［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。 [1] Krawitz PM, Schweiger MR, R?delsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome[J]. Nature Genetics, 2010, 42(10): 827-829.[2] Liu Y, Gao M, Lv YM, et al. Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa) [J]. Journal of Investigative Dermatology,2011, 131(7): 1570-1572. [3] Wei A H, Zang D J, Zhang Z, et al. Exome sequencing identifies SLC24A5 as a candidate gene for nonsyndromic oculocutaneous albinism[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2013, 133(7): 1834-1840. [4] Sanna-Cherchi S, Sampogna R V, Papeta N, et al. Mutations in DSTYK and dominant urinary tract malformations[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(7): 621-629.[5] Musunuru K, Pirruccello J P , Do R, et al. Exome sequencing, ANGPTL3 mutations, and familial combined hypolipidemia[J]. New England Journal of Medicine, 2010, 363(23): 2220-2227. [6] O'Roak B J, Deriziotis P , Lee C, et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations[J]. Nature genetics, 2011, 43(6): 585-589. [7] Jones S, Wang T L, Shih I M, et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma[J]. Science, 2010, 330(6001): 228-231. [8] Yan X J, Xu J, Gu Z H, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia[J]. Nature Genetics, 2011, 43(4): 309-315. [9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116. [10] Yi X, Liang Y, Huerta-Sanchez E, et al. Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J]. Science, 2010, 329(5987): 75-78. [11] Tennessen J A, Bigham A W, O’Connor T D, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes[J]. Science, 2012, 337(6090): 64-69. [12] Caburet S, Arboleda V A, Llano E, et al. Mutant cohesin in premature ovarian failure[J]. New England Journal of Medicine, 2014, 370(10): 943-949.[13] Chesi A, Staahl B T, Jovicic A, et al. Exome sequencing to identify de novo mutations in sporadic ALS trios[J]. Nature Neuroscience, 2013, 16(7): 851-855.[14] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multi region sequencing[J]. Science, 2014, 346: 256-259. 群体研究 藏族人高原适应性研究[10]；深度解析人类罕见遗传变异[11]；…… 图1 STAG3 基因结构图 （红色箭头为 STAG3 基因突变位置） 图2 ALS家系图及CREST突变功能验证 图3 产生化疗抗性的个体样本中体突变的数量及频率

外显子组测序数据分析流程

外显子组测序 介绍 外显子（exon）是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。全部外显子被称为“外显子组”（Exome）。外显子组测序（Exome sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1%，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。 该项技术可用于以下研究 1）检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点； 2）配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因； 3）在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因； 4）用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。 我们能提供详尽的全基因组重测序数据的处理和分析服务。 如您没有标准化的数据、只需流程中的局部分析内容或要求特立独行的数据分析思路，我们亦能满足您的要求。 数据处理和分析流程图

预期结果示例图 示例图1 各类型SNV在样本中的个数统计。 示例图2 不同类型外显子区域上的SNV类型统计。 示例图4 融合基因预测[1]

示例图4 大量样本的GWAS分析结果[2] 示例图5 肿瘤样本高频率突变基因统计[3] 示例图来源文献 [1]. Kangaspeska, S., et al., Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms. PLoS One, 2012. 7(10): p. e48745. [2]. Craig, J.E., et al., Rapid inexpensive genome-wide association using pooled whole blood. Genome Res, 2009. 19(11): p. 2075-80.

全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义

２０１９年一２月第３９卷一第２期 基础医学与临床Ｂａｓｉｃ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＦｅｂｒｕａｒｙ２０１９Ｖｏｌ.３９一Ｎｏ.２收稿日期:２０１７￣１１￣０９一一修回日期:２０１８￣０３￣２７ 基金项目:湖北省教育厅重点项目(Ｄ２０１７１２０５)?湖北省自然科学基金(２０１７ＣＦＢ４５５) ?通信作者(ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ):ｚｒｔ０１１６＠１２６.ｃｏｍ文章编号:１００１￣６３２５(２０１９)０２￣０２７２￣０５短篇综述一 全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义 唐永莉?张瑞涛? (三峡大学医学院?湖北宜昌４４３０００) 摘要:全外显子组测序(ＷＥＳ)是利用序列捕获技术将全外显子区域ＤＮＡ捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法?外显子组测序较全基因组序列测序更简便二经济和高效?其目标区域覆盖度也更高?便于变异检测?外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中?肺癌是常见的恶性肿瘤之一?基于国内外对全外显子测序在肺癌中的研究成果?现就全外显子测序在肺癌的诊治以及肺癌的发生机制的研究进行综述? 关键词:全外显子组测序?肺癌?易感基因?基因突变 中图分类号:Ｒ７３４ ２一一文献标志码:Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｔｒｅａｍｅｎｔｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ ＴＡＮＧＹｏｎｇ￣ｌｉ?ＺＨＡＮＧＲｕｉ￣ｔａｏ? (ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｉｎａＴｈｒｅｅＧｏｒｇｅｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｙｉｃｈａｎｇ４４３０００?Ｃｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ(ＷＥＳ)ｉｓａｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｕｓｅｓｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃａｐｔｕｒｅｔｅｃｈ￣ｎｉｑｕｅｔｏｃａｐｔｕｒｅａｎｄｅｎｒｉｃｈｔｈｅｗｈｏｌｅｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎＤＮＡａｎｄｔｏｐｅｒｆｏｒｍｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.ＷＥＳｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｇｅｎｅｔｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｄｉｒｅｃｔｌｙ.ＳｉｎｃｅｔｈｅＷＥＳｉｓｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｄｏｎｌｙｆｏｒｔｈｅＤＮＡｏｆｔｈｅｅｘｏｎｒｅｇｉｏｎ?ｉｔｉｓｍｕｃｈｓｉｍｐｌｅ?ｍｏｒｅｅｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｈａｎｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ａｎｄｉｔｓｔａｒｇｅｔａｒｅａｃｏｖｅｒａｇｅｉｓｈｉｇｈｅｒ?ｗｈｉｃｈｉｓｅａｓｙｔｏｄｅｔｅｃｔ.Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ?ＷＥＳｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｇｅｎｅｓａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｍｐｌｅｘｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈａｓｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ?ＴｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆＷＥＳｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｔｒｅａｍｅｎｔｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｂｅｅｎｒｅｖｉｅｗｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ?ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇｇｅｎｅｓ?ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ 一一外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和?它是基因行使其功能最直接的体现?人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的１％?但大约包含８５％的致病突变?全外显子组测序(ｗｈｏｌｅｅｘｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ＷＥＳ)是一种高效的基因 组分析法?基于捕获技术的准确性和测序技术的高 通量性?将基因组中全部的外显子区域捕获富集并 进行测序?外显子组测序是一种特异性测序?单纯 针对基因组编码区域及其侧翼序列?其基本流程包 括外显子区域序列的富集二高通量测序及测序数据

200X有效深度肿瘤全外显子组测序

诺禾重磅 200X有效深度全外显子组测序 肿瘤基因组研究新标准 惊爆价 货真价实Agilent SureSelect V5 捕获平台 唯一一款单样本捕获的液相杂交捕获平台，50M目标区域的捕获效率可以达到60%以上，性价比远高于自合成探针及PCR富集平台。 PE150 测序读长及覆盖深度更进一步 测序读长由PE125升级至PE150，测序数据量直线升级至20Gb，保证200X有效深度，高灵敏扫描瘤内低频突变，精准解析瘤内异质性。 基本信息分析，低价特惠 基于模拟数据及真实数据进行检出率及一致性评估，诺禾信息分析团队搭建了最佳的Somatic变异检测分析流程。我们不创造变异，我们是准确基因组变异的搬运工。 肿瘤异质性与克隆进化专项分析工具 EXP ANDS等利用Somatic SNVs及CNAs作为亚克隆区分标记，不仅可以静态绘制单个样本瘤内亚克隆结构全景，还可以记录转移及复发灶相比原发灶的亚克隆动态进化过程。 样本数量：单个项目≥20个样本 活动价格：￥9900 /样本（建库及测序），￥100/G（基本分析）项目数量：100个（中国大陆范围） 活动要求 Agilent ￥100/Gb 200X EXP ANDS 9900 Agilent SureSelect 单样本捕获 ￥

参考文献 1）Andor N. EXPANDS: expanding ploidy and allele frequency on nested subpopulations. Bioinformatics, 2013, 30(1):50-60.2）Ding L, Ley T J, Larson D E, et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome seq－ uencing. Nature, 2012, 481(7382):506-510. 3）Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multireg－ ion sequencing. Science, 2014, 346(6206):256-259. 应用方向 图3.高深度测序描绘肿瘤复发亚克隆进化路线

全外显子组检测技术参数要求

附件：全外显子组检测技术参数要求 样本量：500个样本 一、公司资质： 1.拥有先进的高通量二代测序平台和高性能计算平台； 2.具有短期处理大量样本，进行全外显子组和全基因组测序的经验； 3.实验室具有国内或国外权威机构的资质认证； 4.*应标的公司必须通过医学遗传中心选送的样本测试（三个以上生物学重复），并且需交 付原始下机数据，以中心提供的标准化流程统一进行质量评估。 二、技术参数： 1)污染防控 具有独立的实验方法进行样本身份鉴定，可追溯样本间发生的错误 2)测序质量 1.Q20平均比例在90%以上。 2.Q30平均比例在85%以上。 3.GC content 分布无明显偏移。 3)测序深度、覆盖度统计 下文涉及的数据均为经过去接头、比对、排序和去重后的有效数据。数据统计涉及的相关软件除特别说明外，应使用默认参数。 1.数据质量要求：

1)Mapped unique reads相对总reads的比例（PCT_PF_UQ_READS_ALIGNED）不得低于 99% 2)有效数据总量（PF_UQ_BASES_ALIGNED）不得低于10G 3)On targeted bases相对总bases的比例（PCT_USABLE_BASES_ON_BAIT）不得低于50% 4)On and near targeted bases相对总bases的比例（PCT_SELECTED_BASES）不得低于 80% 5)全外显子碱基10X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_10X）不得低于95% 6)全外显子碱基30X覆盖率（PCT_TARGET_BASES_30X）不得低于80% 7)全外显子组各区域覆盖的一致性统计要求：80%以上的target region的normalized coverage值不得低于0.3

外显子组测序技术的原理及应用概述

生物学教学"01B年(第43卷)第"期+ 77 +外显子组测序技术的原理及应用概述 李法君（山东省潍坊科技学院2627〇〇) 摘要外显子组测序是利用序列捕获技术将基因组外显子区域捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。近年来，该技 术被广泛应用于单基因遗传病和肿瘤等复杂疾病的检测以及动植物等领域的研究。本文综述了外显子组测序技术的基本原理及 其在相关领域研究中的应用。 关键词外显子组测序技术基因组单基因疾病肿瘤 随着社会生活水平的提高，健康问题越来越多地 受到关注。传统遗传疾病的鉴定多采用染色体显带分 析、核型分析和遗传标记等方法来寻找与疾病相关的 DNA变异。这些方法虽然各有特点，但都存在效率低 下、工作量大和分辨率低等问题。21世纪初，随着人 类基因组计划和国际人类基因组单体型图计划的相继 完成以及高通量生物芯片技术的快速发展，研究人员 得以利用全基因组关联研究（genome-wideassociation study，GWAS)的方法来筛选复杂疾病的易感基因，并 取得了举世瞩目的成就，掀起了人类基因组研究的第 三次浪潮[1]。但GWAS技术也存在自身的局限性，如 对稀有的变异和结构变异不敏感，易出现假阳性结果 等[2,3]。与此同时，研究人员还意识到对疾病及性状表 型起着关键作用的变异主要来源于编码区，即外显子 的差异[4’5]，而前期的研究则多聚焦于非编码区的变 异，对外显子变异的关注度较欠缺。由于全基因组测 序费用高昂，因此在研究可用的财力资源一定的条件 下，外显子组测序技术更适合探索高深度测序数据的 大批量样本研究。基于上述原因，众多研究者开始优 先关注编码区的信息，从而加速了外显子组测序技术 的出现。 外显子是蛋白质的编码区，是真核生物基因组的 一部分，含有合成蛋白质所需的遗传信息，基因组中的 全部外显子称为外显子组。如人类基因组大约有1.8X105个外显子，总长30 Mb，尽管只占人类基因组 的1%，但存在与个体表型相关的大量功能变异。研 究表明，人类85%以上的致病基因都是由外显子碱基 突变造成的[4]。2009年8月，外显子组测序技术第一 次成功应用于疾病致病基因的鉴定，Ng等[']对4名无 亲缘关系的弗里曼谢尔登综合征患者[已知该病的致 病基因为肌球蛋白重链3基因（FFH?)]及8名对照组 的DNA样本进行外显子组测序，通过对12个样本的 测序数据进行比较分析，准确找出了位于FFH?中的 致病突变，这也预示了其作为遗传学研究的重要工具，具有广阔的应用前景。 1外显子组测序技术的原理 外显子组测序主要包括外显子序列的捕获富集、DNA测序和数据统计分析三个主要步骤。 1.1外显子组的捕获富集目前，主要通过罗氏(NimbleGen)[7]和安捷伦（Agilent)[8]两种捕获芯片对 外显子序列进行富集。其基本原理是：首先将基因组 DNA随机打断成200 ~ 300 bP左右的片段，随后进行 DNA片段平末端修复，5'端加磷酸基团，3'端加P1+A 尾，通过T A连接将接头序列加到片段两端，经过一轮 PCR*增后成为完整的片段文库;然后将这些DNA片 段与捕获芯片进行杂交，从而得到富集的目标片段;随 机把目的片段连接成长链DNA片段，然后再次随机打 断并在其两端连接上测序接头，然后用与接头相匹配 的序列为引物进行PCR扩增，经质量检测合格后的外 显子组文库即可上机测序。 1.2 DNA测序外显子组的测序以二代测序技术为主，其中大部分报道的外显子组测序技术确定的致病 基因使用的平台是Illumma测序仪。其测序的基本原 理是边合成边测序，用不同颜色的荧光标记四种不同 的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并 经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序 列信息。随着测序技术的发展，第三代测序技术也用 在外显子组的测序方面。第三代单分子测序仪不需要 扩增建立DNA文库，而是边合成边测序将随机打断后 的片段3'末端加上P+yA，通过合成互补链技术对数百 万个DNA片段进行测序。第三代测序仪测序通量高，测序读长较长，可达到10kb，更加有利于基因组的拼 接，但其错误率也相对较高，需要进行高覆盖度测序以 确保较高的测序精度。 1.3数据统计分析虽然外显子组测序得到的数据较全基因组测序要少许多，但仍会产生大量的数据。在如此庞大的数据中发掘出有意义的信号依然是一个 巨大的挑战。数据分析主要包括常规的图像信息数据 分析和生物信息学分析。图像信息数据分析主要包括 图像的去噪音、锐化、定位和偏移校正、依据光强度获 得碱基等;生物信息学分析的目的是挖掘变异位点，包 括单核昔酸多态性（single nucleotidepolymorphisms，SNP)和短的插入/缺失片段（short insertion/deletions ，