UPLC-MS MS测定油蒿叶片中4种内源植物激素
Botanical Research 植物学研究, 2015, 4, 1-7
Published Online January 2015 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/198235529.html,/journal/br
https://www.sodocs.net/doc/198235529.html,/10.12677/br.2015.41001
Determination of Four Endogenous
Phytohormones in Artemisia
ordosica Leaves by Ultra-Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass
Spectrometry
Wenhong Deng, Junqi Zhang
Analysis and Testing Center, Beijing Forestry University, Beijing
Email: dengwh@https://www.sodocs.net/doc/198235529.html,
Received: Dec. 16th, 2014; accepted: Jan. 5th, 2015; published: Jan. 19th, 2015
Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
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Abstract
Four endogenous phytohormones, indole-3-acetic acid, abscisic acid, gibberellins and jasmonic acid in the leaves of Artemisia ordosica were examined by ultra performance liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) to provide effective and reliable methods for iden-tification of phytohormones in plants. The four analytes were extracted from A. ordosica leaves by isopropanol-water-hydrochloric acid (2:1:0.002, V/V/V), and partitioned by dichloromethane, and then separated by Agilent C18 column with gradient elution using acetonitrile and 0.1% acetic acid in water as mobile phases. Negative electrospray ionization with multiple reaction monitor mode was used in the detection. External standard method was used to quantify the analytes concentra-tions. The recoveries of this method were higher than 94.0%, and the relative standard deviations were 0.92% - 1.56%. The results showed that phytohormones was well separated, and the ideal quantitative data of phytohormones in A. ordosica leaves were obtained, and this method suited the purpose of the determination for phytohormones in plant material.
Keywords
Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, Phytohormones,
Artemisia ordosica
UPLC-MS/MS测定油蒿叶片中4种
内源植物激素
邓文红，张俊琦
北京林业大学公共分析测试中心，北京
Email: dengwh@https://www.sodocs.net/doc/198235529.html,
收稿日期：2014年12月16日；录用日期：2015年1月5日；发布日期：2015年1月19日
摘要
本文以菊科植物油蒿(Artemisia ordosica)为研究材料，采用超高效液相色谱串联质谱法对叶片中的植物激素进行分析，以探讨植物组织中的植物激素鉴定方法。油蒿叶片经异丙醇–水–盐酸(2:1:0.002, V/V/V)浸提，二氯甲烷萃取，反相C18柱分离，流动相为0.1%的乙酸水溶液和乙腈，梯度洗脱。多反应监测离子模式进行定性和定量分析，外标法定量。用该方法测定吲哚-3-乙酸、脱落酸、赤霉素和茉莉酸4种内源植物激素的回收率高于94.0%，精密度和重现性均较好(相对标准偏差为0.92%~1.56%)。对实际植物样品的分析也取得了较理想的结果，表明该方法完全适用于植物样品中植物激素含量的检测。关键词
超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)，植物激素，油蒿
1. 引言
植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养生长到生殖生长，以及成熟和衰老的整个生命过程[1]-[3]。既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境相互作用调节其对环境的适应性[4] [5]。植物激素在植物体内含量极低(一般ng/g，甚至pg/g水平)，而且与其共存的成分非常复杂[6] [7]，此外，植物激素性质不稳定，易被光解、热解和氧化[8]，因此，如何对微量植物激素进行简便、快速和准确的定量分析，一直是植物激素研究领域的难题之一。
目前，植物激素的测定方法主要有酶联免疫吸附法[9]、气相色谱法[10] [11]、液相色谱法[12] [13]和气相色谱–质谱法[14] [15]，上述方法存在着前处理复杂繁琐、耗费试剂多、处理过程易造成待测成分损失、检测时杂质成分干扰严重等缺点。超高效液相色谱–串联质谱具有高灵敏度和高选择性的优势，增加了定性和定量的可靠性[16] [17]。本研究以油蒿叶为材料，建立了超高效液相色谱–串联质谱(UPLC-MS/ MS)方法测定油蒿叶片中吲哚-3-乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和茉莉酸(JA)4种内源植物激素的检测方法。
2. 材料和方法
2.1. 植物材料
2013年6月，在宁夏盐池荒漠生态系统定位研究站采集当年生油蒿叶片，采样后立即放入液氮罐中，
真空冷冻干燥，研磨成粉末，过40目筛，混匀备用。
2.2. 仪器与试剂
2.2.1. 仪器
Agilent1260超高效液相色谱仪串联AB Qtrap5500质谱仪(美国)，配有电喷雾电离接口(ESI)及Analyst 数据处理系统；Thermo481恒温制冷摇床(美国)；Beckman Avanti J-26 XP高速离心机(美国)；Organomation 氮吹仪(美国)；上海亿倍冷冻干燥机。
2.2.2. 试剂
盐酸、异丙醇、二氯甲烷为分析纯(北京化工厂生产)；实验用水为美国Milli-Q plus超纯水机生产的超纯水；乙腈、甲醇、乙酸为色谱纯(美国Fisher公司生产)；吲哚-3-乙酸、脱落酸、赤霉素和茉莉酸标准品购自Sigma公司。
2.2.
3. 标准溶液的配制
分别准确称取吲哚-3-乙酸、脱落酸、赤霉素和茉莉酸标准品5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成0.5 mg·mL?1的储备液，密封储存于?20℃冰箱中。用时稀释成一系列质量浓度的标准溶液。
2.3. 试验条件
2.3.1. 色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18，4.6 mm × 50 mm，1.8 μm；柱温：30℃；进样体积：10 μL；流速：0.8 mL·min?1；流动相：乙腈(A)，0.1%乙酸–水溶液(B)；洗脱程序：0~0.5 min，90% B，0.5~5 min，90%~5% B，5~5.1 min，90% B，5.1~8 min，90% B。
2.3.2. 质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)；气帘气压力为30 PSi，温度为600℃，雾化器压力为40 PSi，辅助气压力50 PSi，离子化电压?4500 V。
2.4. 样品提取方法
准确称取50 mg油蒿鲜叶干粉，加入0.5 mL异丙醇/水/盐酸(体积比2:1:0.002)，4℃100 r.p.m震荡30 min，然后加入1 mL二氯甲烷4℃震荡30 min，4℃13,000 g离心5 min，取下层溶液，氮吹仪吹干，加入0.1 mL甲醇溶液溶解样品，?20℃冰箱保存备用。
2.5. 植物激素的定性和定量测定
根据植物激素标准品的保留时间和质谱定性离子对样品中的植物激素定性，外标曲线计算植物激素的含量。每种指标的测定重复3次，实验数据用Excel软件进行分析。
3. 结果与分析
3.1. 色谱条件的优化
当甲醇作流动相时，离子化程度受到抑制，丰度明显降低，导致灵敏度下降，而乙腈的离子化效率明显优于甲醇，因此采用乙腈作为流动相。在流动相中加入乙酸能增加酸性植物激素在ESI?模式下的离子化效率。分别配制0.05%、0.1%、0.2%的乙酸水溶液作为流动相，试验表明0.1%的乙酸水溶液能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高。图1为4种植物激素标准溶液(a)和沙蒿叶中植物激素(b)的MRM色谱图。
(a)
(b)
Figure 1.Multiple reaction monitor (MRM) chromatogram of four phytohormones of standard solution (a) and leaves of A. ordosica (b)
图1. 4种植物激素标准溶液(a)和沙蒿叶中植物激素(b)的MRM色谱图
3.2. 质谱条件的优化
分别取10 ng·mL?1IAA、ABA、GA3、JA标准溶液，以流动注射方式进行ESI源质谱分析。4种内源植物激素负离子信号比正离子信号明显，所以选择负离子监测模式进行检测。在此模式下，对质谱条件进行充分优化，选取经碰撞后所得丰度较高的离子作为定量离子，并确定其最佳碰撞能量、去簇电压以及碰撞池出口电压(表1)。在负离子监测模式下，各激素在Agilent SB-C18色谱柱上实现有效分离，各离子之间不会产生干扰。
3.3. 方法的线性范围和检出限
取质量浓度分别为1、5、20、50、200 ng·mL?1的IAA、ABA、GA3、JA混合标准溶液，在相同的色谱和质谱条件下测定其峰面积，以浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标得标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数。结果表明：4种内源植物激素在1~200 ng·mL?1的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均在0.9989以上。按3倍信噪比计算得到样品中4种植物激素的检出限(表2)，可见各植物激素线性关系良好，检出限均低于0.07 ng·mL?1，说明该方法对植物激素有很高的检测灵敏度。
3.4. 方法的精密度
在上述色质谱条件下，对10 ng·mL?1的IAA、ABA、GA3、JA混合标准溶液重复测定7次，IAA、ABA、GA3、JA峰面积相对标准偏差分别为0.92%、1.36%、1.25%、1.56%。结果表明，本法的精密度良好。
3.5. 方法的回收率
分别在已测知植物激素含量的油蒿叶样品中添加5、20、100 ng·g?1的IAA、ABA、GA3、JA混合标准溶液，按上述样品提取方法进行处理，UPLC-MS/MS进行测定，平均回收率94.0%~98.3%，回收率相对标准偏差小于4.2% (表3)，说明该方法重现性良好。
Table 1. MS/MS parameters for determination of phytohormones
表1.植物激素的质谱分析参数
植物激素母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量(eV) 碰撞池出口电压(V)
生长素174.1 130.2 ?14.2 ?13
脱落酸263.3 153.1 ?17 ?14
赤霉素3 345.0 143.2 ?33 ?10
茉莉酸209.0 59.0 ?40 ?16
Table 2. Linearity and detection limits of four phytohormones
表2. 4种植物激素的线性方程及方法检出限
植物激素线性范围/ng·mL?1线性方程相关系数/r2检出限/ng·mL?1
生长素1~200 Y = 35353x ? 43776 0.9997 0.02
脱落酸1~200 Y = 64457x ? 68265 0.9998 0.01
赤霉素1~200 Y = 49712x + 105131 0.9994 0.01
茉莉酸1~200 Y = 7812.4x + 18349 0.9989 0.07
Table 3. Recovery rates of four phytohormones by UPLC-MS/MS
表3.UPLC-MS/MS测定4种植物激素的回收率
植物激素添加水平/ng·g?1回收率/% 相对标准偏差/%，n = 3
生长素 5 94.0 4.2
20 95.7 1.5
100 97.7 2.2
脱落酸 5 95.2 1.8
20 97.5 3.3
100 98.3 3.7
赤霉素 5 94.4 3.5
20 98.1 1.5
100 96.8 3.1
茉莉酸 5 94.6 1.2
20 96.4 2.1
100 98.1 1.7
3.6. 实际样品的测定
按照本文所建立的分析方法，对油蒿叶片中的植物激素含量进行测定，生长素、脱落酸、赤霉素、茉莉酸含量分别为4.74 ng·g?1、11.67 ng·g?1、3.41 ng·g?1、77.00 ng·g?1。
4. 讨论
超高效液相色谱串联质谱法测定植物激素是近年来发展起来的一种新方法[18]，它结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度的特点，大幅度地提高了检测的灵敏度[19]，而且可以避免GC-MS分析中样品繁琐衍生化的处理过程[20]，此外，与传统的液相色谱和气相色谱检测方法相比，色谱质谱联用可以消除色谱由于工作原理而可能导致的定性错误，保证了定性和定量结果的可靠性[21]。能为同时测定多种植物激素提供简便，准确，快速的检测方法。
关于植物激素的提取方法，目前多采用有机溶剂浸提，固相微萃取小柱纯化后进样分析，此方法虽然具有节约溶剂，简单快速等优点。但是这种基于除杂的纯化方法往往有较大的基质效应，而且过程也较为繁琐、损失也大。而本文采用的二氯甲烷萃取后直接进样分析，可以达到理想的分离结果。
本文建立了超高效液相色谱–串联质谱法同时测定油蒿叶中多种植物激素的分析方法。该方法具有简单、灵敏度高、选择性好、分析时间短、回收率高等优点，完全适用于植物样品中植物激素含量的检测。
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常见五种内源激素的生理效应
常见五种内源激素的生理效应 一、生长素：代号为IAA。 生长素使最早被发现的植物激素，是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，包括吲哚乙酸（IAA）、4-氯-IAA、5-羟-IAA、萘乙酸等，习惯上常把吲哚乙酸作为生长素的同义词。 生长素具体的生理效应表现为： 第一、促进生长。生长素在较低的浓度下可促进生长，而高浓度时则抑制生长，甚至使植物死亡，这种抑制作用与其能否诱导乙烯的形成有关。另外，不同器官对生长素的敏感性不同。 第二、促进插条不定根的形成。用生长素类物质促进插条形成不定根的方法已在苗木的无性繁殖上广泛应用。 第三、对养分的调运作用。生长素具有很强的吸引与调运养分的效应，利用这一特性，用生长素处理，可促使子房及其周围组织膨大而获得无子果实。 第四、生长素的其他效应。例如促进菠萝开花、引起顶端优势（即顶芽对侧芽生长的抑制）、诱导雌花分化（但效果不如乙烯）、促进形成层细胞向木质部细胞分化、促进光合产物的运输、叶片的扩大和气孔的开放等。此外，生长素还可抑制花朵脱落、叶片老化和块根形成等。 二、赤霉素：代号为GA。 赤霉素（gibberellin）一类主要促进节间生长的植物激素，因发现其作用及分离提纯时所用的材料来自赤霉菌而得名。 赤霉素的生理效应为： 第一、促进茎的伸长生长。这主要是能促进细胞的伸长。用赤霉素处理，能显著促
进植株茎的伸长生长，特别是对矮生突变品种的效果特别明显；还能促进节间的伸长。 第二、诱导开花。某些高等植物花芽的分化是受日照长度和温度影响的。若对这些未经春化的植物施用赤霉素，则不经低温过程也能诱导开花，且效果很明显。对花芽已经分化的植物，赤霉素对其花的开放具有显著的促进效应。 第三、打破休眠。对于需光和需低温才能萌发的种子，赤霉素可代替光照和低温打破休眠。 第四、促进雄花分化。对于雌雄异花的植物，用赤霉素处理后，雄花的比例增加；对于雌雄异株植物的雌株，如用赤霉素处理，也会开出雄花。 第五、其他生理效应。赤霉素还可以加强生长素对养分的动员效应，促进某些植物坐果和单性结实、延缓叶片衰老等。 三、细胞分裂素：其代号为CTK。 细胞分裂素是一类具有腺嘌呤环结构的植物激素。它们的生理功能突出地表现在促进细胞分裂和诱导芽形成。 细胞分裂素有多种生理效应。其生理效应表现为： 第一、促进细胞分裂。细胞分裂素的主要生理功能就是促进细胞的分裂。细胞分裂素主要是对细胞质的分裂起作用。 第二、促进芽的分化。促进芽的分化是细胞分裂素重要的生理效应之一，有些离体叶细胞分裂素处理后主脉基部和叶缘都能产生芽。 第三、促进细胞扩大。这种扩大主要是因为促进了细胞的横向增粗。 第四、促进侧芽发育，消除顶端优势。细胞能解除由生长素所引起的顶端优势，促进侧芽生长发育。 第五、延缓叶片衰老。如果在离体叶片上局部涂以细胞分裂素，则叶片其余部位变
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA） 免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。 植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。 直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法的原理可用下式表示： Ab+H+HP=AbH+AbHP 其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。 材料、试剂及设备 1 材料 各种新鲜植物材料 2 仪器设备 研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂 (1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6. (2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。 (3) 样品稀释液：100 ml PBS中加0.1 ml Tween-20，0.1g明胶（稍加热溶解）。 (4) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，溶解定容至1 000ml，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。 (5) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (6) 终止液：2mol/L H2SO4。 （7）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的浓度))。 （8）激素包被抗原、各激素抗体和标准物。 （9）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体。
粮食中脂肪酸值含量的测定
GB 5510—85 本标准适用于商品粮食中脂肪酸值含量的测定。 1 仪器和用具 1.1 带塞锥形瓶：150 ml； 1.2 量筒； 1.3 移液管； 1.4 微量滴定管； 1.5 表面皿； 1.6 天平：感量0.01 g； 1.7 电动振荡器； 1.8 漏斗等。 2 试剂 2.1 0.01 N氢氧化钾（或氢氧化钠）乙醇（95％）溶液：先配制约0.5 N氢氧化钾水溶液，再取20 mL，用95％乙醇稀释至500 ml； 2.2 苯、95％乙醇； 2.3 0.04％酚酞乙醇溶液（0.2 g酚酞溶于500 ml 95％乙醇溶液中）。 3 操作方法 3.1 试样制备：从平均样品中分取样品约80 g，粉碎使90％以上试样通过40目筛。粉碎后试样加在20℃以上室温放置，脂肪酸值会很快增加，因此，必须及时进行测定。 3.2 浸出：称取试样20±0.01 g（脂肪酸值高于60 mgKOH/100 g时称试样10 g）于200 ml或250 ml锥形瓶中，加入50 ml苯，加塞摇动几秒钟后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置振荡器振荡30 min（或用手振荡 45 min），取出，将瓶倾斜静置数分钟，使滤液澄清。 3.3 过滤：用快速滤纸过滤，弃去最初几滴滤液后用25 ml比色管或量筒收集滤液25 ml立即准确调节至刻度。
3.4 滴定：将25 ml滤液移入锥形瓶中，再用原比色管或量筒取25 ml酚酞乙醇溶液加入锥形瓶中， 立即用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈现微红色半分钟内不消失为止。记下所耗用氢氧化钾乙醇溶液毫 升数（V1）。 3.5 空白试验：取25 ml酚酞乙醇溶液同3.4用氢氧化钾乙醇溶液滴定，记下耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数（V0）。 4 结果计算 脂肪酸值以中和100 g粮食试样中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示。 脂肪酸值按下列公式计算： 式中： V 1── 滴定试样用去的氢氧化钾乙醇溶液体积，ml； V ──滴定25 ml酚酞乙醇溶液用去氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml；50──浸泡试样用苯的体积，ml； 25──用于滴定的滤液体积，ml； N──氢氧化钾（或氢氧化钠）乙醇溶液的当量浓度； 56.1──氢氧化钾毫克当量； W──试样重量，g； M──试样水分百分率，％（测定面粉脂肪酸值时按湿基计算，不必减去水分）； 100──换算为100 g试样重量。 双试验结果允许差，脂肪酸值在51以上的不超过5 mg KOH/100 g；在50以下的，不超过3 mg KOH/ 100 g。求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后第一位。 注：浸出液色过深，滴定终点不好观察时，改用四折滤纸，在滤纸锥头内放入约0.5 g粉末活性碳，慢慢注入浸出液，边脱色边过滤。或改用0.1％麝香草酚酞乙醇溶液指示剂，滴定终点为绿色或蓝绿色。
植物激素 整理
植物激素的检测方法 1. 生物测试 生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。 优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性 缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复 杂此外重复性差工作量大 2. 免疫检测 免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。 优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。 缺点：抗体的制备较复杂。 3.物理化学方法 物理化学方法分光谱法和色谱法两种 1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法 优点：灵敏度高 缺点：专一性差 2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以
及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。 （1）纸上层析和TLC： 优点：设备简单易操作 缺点：分离效率和灵敏度有限制 （2）G C 和HPLC： 是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确 （3）GC 和HPLC 方法: 分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。 内源植物激素：植物体内产生的激素 主要有：、生长素（auxin）、赤霉素（GA3）、细胞分裂素（CTK）、 脱落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethyne，ETH） 和油菜素甾醇、吲哚乙酸（IAA）玉米素（Z）、
脂肪酸的测定
2.2.1.脂肪酸的变化分析 试剂：0.3％甲醛、6 mol/l HCl-CH3OH溶液、三氯甲烷 方法：GC—MS联用分析测定，步骤如下： （1）菌体的培养与收集 Ⅰ组实验菌株用YPD液体培养基培养，在培养基中添加一定量的抗冻保护剂，接种后放入30℃、150 r／min的摇床中培养24 h。细胞振荡培养至生长对数中期，移取适量细胞悬浮液至-30℃冰箱冷冻7d，取出30℃下解冻5-10min，用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。 空白样用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻24h，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。 Ⅱ组实验菌株用于面包冷冻面团的制备，添加抗冻保护剂，于-20℃冷冻30d 后取出解冻，取20g解冻后的面团，分散于180ml无菌水中，震荡30min，静置15min，离心并取上清液。用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心15 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。空白样则不添加抗冻保护剂，其余处理方法一样。 （2）脂肪酸的甲基化与提取 取50 mg冻干细胞加入6 mol/l HCl-CH3OH溶液2 ml，置100℃的条件下盐酸水解甲基化3 h，溶液呈现棕褐色(或黑褐色)，取出，置室温下冷却。加入正己烷1.5ml振荡。经4000 r／min离心10min，收集上清液再加入正己烷1.5ml 抽提一次，合并两次上清液，加入蒸馏水3ml，经4000 r／min离心10 min，收 吹干，加入10μl三氯甲烷制备脂肪酸酯化液。集上清液于离心管中。用流动N 2 （3）薄层层析 用玻璃毛细管取脂肪酸酯化液点在硅胶G-TLC薄层板上，以正己烷+无水乙醚(1+1)为展层系统，待层析液至硅胶板上缘后立即取出薄层板，风干。在UV254灯下检查制备的脂肪酸纯度与相对浓度。将脂肪酸甲酯带做好标记，轻轻刮下， 吹干后加入0.5ml无水甲醇振荡溶解，然后进行GC—用二乙醚抽提两次，经N 2 MS分析。（4）GC—MS操作条件程序升温：初温130℃，保持1 min；终温280℃，维持min，升温速度7．6℃／min。检测器温度250℃；载气(He)流速30 ml／min；分流比50：1；流速(He)49．9 ml／min；进样量1μl。（2）中质谱条件用电子轰击源(Ⅱ)分析，电子能量为70eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，质量扫描范围35—500。
油脂中脂肪酸含量测定
实验四油脂中脂肪酸含量测定 ―――气相色谱法测定大豆油中脂肪酸成分一、目的与要求 油脂是食品加工中重要的原料和辅料，也是食品的重要组分和营养成分。必需脂肪酸是维持人体生理活动的必要条件，人体所必需的脂肪酸一般取自食品用油，即食用油脂。气象色谱法测定油脂脂肪酸组分是现在最常用的方法，也是一些相关标准（如：GB/T17377）规定应用的检测方法。 甲酯化是分析动植物油脂脂肪酸成分的常用的前处理方法，也是常用的标准方法（GB/T 17376-1998）。 本实验要求了解气相色谱法测食用油脂肪酸组成的原理，掌握样品的前处理方法，学习食用油脂中脂肪酸组分的色谱分析技术。 二、原理 本实验甲酯化方法采用国标--GB/T 17376-1998，甘油酯皂化后，释出的脂肪酸在三氟化硼存在下进行酯化，萃取得到脂肪酸甲酯用于气象色谱分析。 样品中的脂肪酸（甘油酯）经过适当的前处理（甲酯化）后，进样，样品在汽化室被汽化，在一定的温度下，汽化的样品随载气通过色谱柱，由于样品中组分与固定相间相互用的强弱不同而被逐一分离，分离后的组分，到达检测器（detceter）时经检测口的相应处理（如FID的火焰离子化），产生可检测的信号。根据色谱峰的保留时间定性，归一法确定不同脂肪酸的百分含量。 三、仪器与试剂 （一）仪器 1．气相色谱仪：具氢火焰离子化检测器（FID）。 2．恒温水浴锅 3．移液管 4．胶头滴管 5．小圆底烧瓶 6．冷凝管 7. 样品瓶 （二）试剂 1.正己烷：分析纯，沸程60～90℃或30～60℃，重蒸。 2.氢氧化钾甲醇溶液
3.三氟化硼甲醇溶液 4.饱和食盐水 5.市售大豆油 四、实验步骤 （一）样品预处理 甲酯化： 取2~4滴大豆油样品于xml的圆底烧瓶中，加入3ml的KOH甲醇溶液，70℃水浴加热回流5min；取出冷却至室温（可用水冷），加入5ml三氟化硼溶液，70℃水浴加热回流5min；取出冷却至室温，加入3ml正己烷，70℃水浴加热回流5min；取出冷却至室温，加入适量饱和食盐水溶液，静止3~5min，取上层油样1ml于试样瓶中，进GC分析。 测定： （1）气相色谱条件 ①色谱柱：石英弹性毛细管柱，0.25mm（内径）×60m，内膜厚度0.32。 ②程序升温：150℃保持3min，5℃/min升温至220℃，保持10min；进样口温度250℃；检测器温度300℃。 ③气体流速：氮气：40mL/min，氢气：40mL/min，空气：450mL/min，分流比30﹕1。 ④柱前压：25kpa （2）色谱分析 自动进样，吸取1μL试样液注入气相色谱仪，记录色谱峰的保留时间和峰高。利用标准图谱确定每个色谱峰的性质（定性），利用软件自带的自动积分方法计算各脂肪酸组分的百分含量。 五、注意事项 1．本法检测灵敏度高，在分析时应注意防止由于色谱柱中高沸点固定液、样品净化不完全及载气不纯等带来的污染，使其灵敏度下降。 2．本方法采用极性色谱柱，样品处理时应尽力保证脱水彻底。 3．本实验采用自动进样，序列采集，工作站在序列运行之后不再允许更改序列采集方法，所以在运行某一序列之前应确认程序编辑无误。 4．为了保护毛细管柱，一定要确认升温程序在该型号色谱柱的温度允许范围内。 七、思考题 1.气象色谱的原理，适用范围
植物激素检测方法
植物激素检测方法 一、什么是植物激素？ 植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。 植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等。 二、检测方法 科标生物检测中心可以提供各种植物样品检测服务，中心是通过权威认证的第三方机构，检测后出具权威检测报告。 三、主要分析技术 1、生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。 2、免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。 3、气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。 4、高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效
植物油中脂肪酸的测定
植物油中脂肪酸的测定 1.原理：将脂肪酸甘油酯转化为脂肪酸甲酯后，进行气相色谱测定。用归一法确定各脂肪酸的组成比例。 1.脂肪酸甲酯的制备 2.1 试剂：石油醚—乙醚溶液：1：1（V/V） 氢氧化钾-甲醇溶液0.4（mol/L）：称取2.3克氢氧化钾溶 于100毫升无水甲醇中，储入具塞瓶中备用，使用期不得 超过2周。 甲醇钠溶液：含1%钠的无水乙醇溶液。从试剂罐的溶剂 中取出约1克钠，用滤纸除去上面附着的溶剂，溶于100 毫升无水甲醇中，等气泡放完并冷却后，储入棕色瓶中备 用，瓶塞上最好装有硅胶干燥管。 盐酸-甲醇溶液：0.4（mol/L）. 2.2 制备方法： (a ) FFA≤10% 称取100—250毫克油样，精确至1毫克，装入25毫升具 塞容量瓶中，加入石油醚—乙醚溶液约2毫升，稍事振摇， 待油样溶解后，再加入氢氧化钾-甲醇溶液约1毫升，混 匀，在室温下放置约30分钟，再沿瓶塞加入水，静置， 待分层。（上层以甲酯，溶剂为主，下层以脂肪醇，水为 主）吸取上清液0.5—2微升进样。 (b) FFA≥10%
称取100—250毫克油样，精确至1毫克，防入酯化瓶中 加入5毫升甲醇钠溶液及沸石数里粒，接上冷凝管加热 回流约15分钟，直至油珠消失，再由冷凝管加入约6 毫升盐酸-甲醇溶液继续加热回流约10分钟，停止加热， 冷却后，取下冷凝管，将酯化瓶中的溶液倒入分液漏斗 中，加入10毫升水和10毫升正庚烷，猛烈振摇2分钟， 分层后，弃去水相，将上层正庚烷过滤，（通过铺有无 水硫酸钠的脱脂棉）吸取0.5—2微升正庚烷溶液进行 测定。 2.分析方法： 气相色谱条件：FFAP柱0.3mm*30M IN=DE=230—240度OV—220度灵敏 度1000，衰减1，载气0.1Mpa.
人教版必修3 第3章 植物的激素调节章节检测
必修三第3章植物的激素调节 一、单项选择题 1、向光性实验中在纸盒上打一个小孔的目的是 A．便于观察胚芽鞘生长 B．通风 C．形成单侧光 D．测量胚芽鞘的高度 2、植物产生向光性的原因是 A．茎的向光一侧生长素分布多，生长快 B．茎的背光一侧生长素分布多，生长快 C．茎的向光一侧温度高，生长快 D．茎的背光一侧温度高，生长快 3、正确反映一株白玉兰树上各部分生长素浓度大小的是 A．顶芽＞侧芽老根＞分生区B．顶芽＜侧芽老根＜分生区 C．顶芽＜侧芽老根＞分生区D．顶芽＞侧芽老根＜分生区 4、用燕麦胚芽鞘做向光性实验，发现植物生长素产生的部位、感光刺激的部位、向光弯 曲的部位分别是 A．胚芽鞘尖端；尖端下面一段；向光一面 B．胚芽鞘；胚芽鞘尖端；尖端下面一段C．胚芽鞘尖端；胚芽鞘尖端；尖端下面一段 D．胚芽鞘尖端；胚芽鞘；尖端下面一段5、飞行于太空中的宇宙飞船里，放置一株水平方向的幼苗，培养若干天后，根茎生长方 向是 A．根向下生长，茎向上生长 B．根向上生长，茎向下生长 C．根水平方向生长，茎向上生长 D．根和茎都向水平方向生长 6、关于植物激素的叙述，正确的是 A．植物激素是由植物体内的内分泌腺合成、分泌的微量有机物 B．植物的向光性可以说明生长素能促进植物的生长 C．乙烯能促进果实的成熟，所以在幼嫩的果实中含量较多 D．细胞分裂素能促进细胞的分裂和细胞的伸长，所以在茎尖、根尖含量较多 7、如右图所示，用燕麦胚芽鞘进行实验，一段 时间后，会引起弯曲现象的是 A．④⑤ B．①②③ C．①③④ D．①④ 8、将植物横放，测量根和茎生长素浓度与其生长状况的关系如甲图所示，则曲线上P点最可能对应于乙图中的位置是 A．a B．b C．c D．d
食品中脂肪酸的测定
食品中脂肪酸的测定 基础知识： 油脂是食品的重要组分和营养成分。油脂中脂肪酸组分的测定最常用的方法是气相色谱法。样品前处理采用酯交换法(甲酯化法)，图谱解析采用归一化法。 气相色谱（GC）是一种把混合物分离成单个组分的实验技术它被用来对样品组分进行鉴定和定量测定。 一个气相色谱系统包括： ?可控而纯净的载气源能将样品带入GC系统 ?进样口同时还作为液体样品的气化室 ?色谱柱实现随时间的分离 ?检测器当组分通过时检测器电信号的输出值改变从而对组分做出响应 ?某种数据处理装置 氢火焰离子化检测器（ＦID）:氢气和空气燃烧所生成的火焰产生很少的离子。在氢火焰中，含碳有机物燃烧产生CHO+离子，该离子强度与含量成正比。该检测器检出的是有机化合物,无机气体及氧化物在该检测器无响应。 当纯净的载气(没有待分离组分)流经检测器时产生稳定的电信号就是基线。
1——载气(氮气）; 2--氢气； 3——压缩空气； 4——减压阀(若采用气体发生器就可不用减压阀)； 5—-气体净化器（若采用钢瓶高纯气体也可不用净化器)； 6-—稳压阀及压力表； 7——三通连接头； 8-—分流/不分流进样口柱前压调节阀及压力表； 10——尾吹气调节阀； １1——氢气调节阀; 12——空气调节阀； 13-—流量计（有些仪器不安装流量计)； 14——分流／不分流进样口； 1５—-分流器; 16—-隔垫吹扫气调节阀； 17-—隔垫吹扫放空口； 1８——分流流量控制阀; 19—-分流气放空口; 20—-毛细管柱； 21——FＩD检测器； 2２-—检测器放空出口； ?方法来源： GB 500９。16８－2016 食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定
五大植物内源激素2
植物的五大生长激素： 吲哚乙酸（IAA）的生理作用： 生长素的生理效应表现在两个层次上： 1.在细胞水平上，生长素可刺激形成层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。 2.在器官和整株水平上，生长素从幼苗到果实成熟都起作用。生长素控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制；当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性；当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性；吲哚乙酸造成顶端优势；延缓叶片衰老；施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落；生长素促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。 二.赤霉素（GA）的生理作用： 1.促进麦芽糖的转化（诱导α—淀粉酶形成）；促进营养生长（对根的生长无促进作用，但显著促进茎叶的生长），防止器官脱落和打破休眠等。 2.赤霉素最突出的作用是加速细胞的伸长（赤霉素可以提高植物体内生长素的含量，而生长素直接调节细胞的伸长），对细胞的分裂也有促进作用，它可以促进细胞的扩大（但不引起细胞壁的酸化） 三.细胞分裂素（CTK）的生理作用 1.促进细胞分裂及其横向增粗。 2.诱导器官分化。 3.解除顶端优势，促进侧芽生长。 4.延缓叶片衰老。 四.脱落酸（ABA）的生理作用： 1. 抑制与促进生长。外施脱落酸浓度大时抑制茎、下胚轴、根、胚芽鞘或叶片的生长。浓度低时却促进离体黄瓜子叶生根与下胚轴伸长，加速浮萍的繁殖，刺激单性结实种子发育。 2. 维持芽与种子休眠。休眠与体内赤霉素与脱落酸的平衡有关。 3. 促进果实与叶的脱落。 4. 促进气孔关闭。脱落酸可使气孔快速关闭，对植物又无毒害，是一种很好的抗蒸腾剂。检验脱落酸浓度的一种生物试法即是将离体叶片表皮漂浮于各种浓度脱落酸溶液表面，在一定范围内，其气孔开闭程度与脱落酸浓度呈反比。
植物激素
生长素 生长素是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，包括吲哚乙酸（IAA）、4-氯-IAA、5-羟-IAA、萘乙酸等。1872年波兰园艺学家谢连斯基对根尖控制根伸长区生长作了研究；后来达尔文父子对?草胚芽鞘向光性进行了研究。1928年温特首次分离出这种引起胚芽鞘弯曲的化学信使物质，命名为生长素。1934年，凯格等确定它为吲哚乙酸，因而习惯上常把吲哚乙酸作为生长素的同义词。 生长素在扩展的幼嫩叶片和顶端分生组织中合成，通过韧皮部的长距离运输，自上而下地向基部积累。植物体内的生长素是由色氨酸通过一系列中间产物而形成的。其主要途径是通过吲哚乙醛。吲哚乙醛可以由色氨酸先氧化脱氨成为吲哚丙酮酸后脱羧而成，也可以由色氨酸先脱羧成为色胺后氧化脱氨而形成。然后吲哚乙醛再氧化成吲哚乙酸。另一条可能的合成途径是色氨酸通过吲哚乙腈转变为吲哚乙酸。 在植物体内吲哚乙酸可与其它物质结合而失去活性，如与天冬氨酸结合为吲哚乙酰天冬氨酸，与肌醇结合成吲哚乙酸肌醇，与葡萄糖结合成葡萄糖苷，与蛋白质结合成吲哚乙酸-蛋白质络合物等。结合态吲哚乙酸常可占植物体内吲哚乙酸的50~90%，可能是生长素在植物组织中的一种储藏形式，它们经水解可以产生游离吲哚乙酸。 植物组织中普遍存在的吲哚乙酸氧化酶可将吲哚乙酸氧化分解。 生长素有多方面的生理效应，这与其浓度有关。低浓度时可以促进生长，高浓度时则会抑制生长，甚至使植物死亡，这种抑制作用与其能否诱导乙烯的形成有关。生长素的生理效应表现在两个层次上。 在细胞水平上，生长素可刺激形成层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。 在器官和整株水平上，生长素从幼苗到果实成熟都起作用。生长素控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制；当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性；当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性；吲哚乙酸造成顶端优势；延缓叶片衰老；施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落；生长素促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。 近年来提出激素受体的概念。激素受体是一个大分子细胞组分，能与相应的激素特异地结合，尔后发动一系列反应。吲哚乙酸与受体的复合物有两方面的效应：一是作用于膜蛋白，影响介质酸化、离子泵运输和紧张度变化，属于快反应（〈10分钟〉；二是作用于核酸，引起细胞壁变化和蛋白质合成，属于慢反应（）10分钟）。介质酸化是细胞生长的重要条件。吲哚乙酸能活化质膜上ATP（腺苷三磷酸）酶，刺激氢离子流出细胞，降低介质pH值，于是有关的酶被活化，水解细胞壁的多糖，使细胞壁软化而细胞得以扩伸。 施用吲哚乙酸后导致特定信使核糖核酸（mRNA）序列的出现，从而改变了蛋白质的合成。吲哚乙酸处理还改变了细胞壁的弹性，使细胞生长得以进行。 赤霉素 赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素。1926年日本病理学家黑泽在水稻恶苗病的研究中发现水稻植株发生徒长是由赤霉菌的分泌物所引起的。1935年日本薮田从水稻赤霉菌中分离出一种活性制品，并得到结晶，定名为赤霉素（GA）。第一种被分离鉴定的赤霉素称为赤霉酸（GA3），现已从高等植物和微生物中分离出70余种赤霉素。因为赤霉素都含有羧基，故呈酸性。内源赤霉素以游离和结合型两种形态存在，可以互相转化。 赤霉素pH值3~4的溶液中最稳定，pH值过高或过低都会使赤霉素变成无生理活性的伪赤霉素或赤霉烯酸。赤霉素的前体是贝壳杉烯。某些生长延缓剂，如阿莫-1618和矮壮素等能抑制贝壳杉烯的形成，福斯方-D能抑制贝壳杉烯转变为赤霉素。赤霉素在植物体内的形成部位一般是嫩叶、芽、幼根以及未成熟的种子等幼嫩组织。不同的赤霉素存在于各种植物不同的器官内。幼叶和嫩枝顶端形成的赤霉素通过韧皮部输出，根中生成的赤霉素通过木质部向上运输。 赤霉素中生理活性最强、研究最多的是GA3，它能显著地促进植物茎、叶生长，特别是对遗传型和生
植物激素测定方法述评_鲁哲
植物激素测定方法述评 鲁 哲,邹振华,路 婧,王若仲* (湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室,长沙410128) 摘 要:分析了传统植物激素测定的方法,提出了新的技术发展下,对植物激素快速、原位实时、高灵敏、高通量检测的必要性,对植物激素测定方法的前沿技术做出分析,并初步探讨了植物激素测定技术的未来趋势。 关键词:植物激素;测定方法;原位实时;生物传感器 中图分类号:Q94-331 文献标识码:A 文章编号:1001-5280(2011)05-0531-04 DOI:10.3969/j.issn.1001-5280.2011.05.28 Research Progress on Determination of Phytohormones LU Zhe,ZOU Zhen-hua,LU Jing,WAN G Ruo-zhong* (Hunan Pr ov incial Key L abo rat or y o f Phyt ohor mo nes and G r ow th Develo pment, Hunan A g ricultural U niv ersit y,Chang sha,Hunan410128,China) Abstract:In this ar ticle,the tr aditional methods for deter mination o f phy toho rmo nes w er e analy zed,and the necessity of rapid,in situ real-t ime,hig h sensitivit y and hig h thro ughput detectio n of phy to ho rmo nes w as put fo rw ar ded under co nditio n of the development of new techniques.A t the sam e time,the fr ontier techniques fo r det erminat ion of phy toho rmo nes w er e a nalyzed,and t he developmental trend of determinatio n techniques o f phyt ohor mo nes w as discussed. Key words:P hyto hor mones;Det erminat ion metho d;Situ and r eal-time;Biosensor 植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量物质。目前,植物激素有六大类,即生长素类(Auxins)、赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(CTKs)、脱落酸(abscisicacid,A BA)、乙烯(ethyne, ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。植物激素作为植物体内的微量信号分子,调节植物几乎所有的生长发育过程。长期以来,植物激素与植物生长调节剂一直是生物学和农学领域的研究热点,其成果为农业科技进步做出了巨大的贡献。例如,各种植物生长调节剂的广泛使用,已成为实现农作物高产优质的重要措施之一,在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用[2]。由于植物激素在植物体内含量极低(一般每克植物组织鲜样中的含量为1～100ng),易被光解、热解和氧化,因此,如何对微量植物激素进行简便、快速和准确的定量分析,一直是植物激素研究领域的难题之一。近年 收稿日期:2011-03-23 作者简介:鲁 哲(1984-),男,内蒙古赤峰人,硕士研究生。*通讯作者。 基金项目:湖南省科研条件创新专项重点项目(2010T Y1004);教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-10-0143)。来,随着功能基因组学、代谢组学(m etabolom ics)等整体性“组学”方法的提出以及生物学研究对活细胞单分子行为测定的日益关注,对植物激素等重要代谢调节物的测定技术提出了更高的要求。同时植物激素的生理功能具有时空特异性,植物激素作用机理和信号转导等前沿领域更是迫切需要对微量植物样品的超微量植物激素进行高灵敏、原位、实时测定。研究植物激素在植物组织或细胞中的分布特点及消长规律,目前常采用化学手段对内源激素水平进行检测,但测定结果的准确性较差[3],而且无法对激素进行定位研究,因为许多激素引起的很多生理反应常发生在激素受体分布的细胞器内[2],因此对植物激素的高灵敏、高通量、原位实时测定新技术提出了迫切要求。 传统植物激素和植物生长调节剂测定方法主要有以早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法为代表的生物测定法[4]、以气相色谱法[5](Gas Chro matography,GC)和高效液相色谱法[6](Hig h Performance Liquid Chr omatogr aphy,HPLC)为代表的理化测定法,及以酶联免疫吸附法[7](Enzy me Linked Immune sorbent Assays,ELISA)为代表的免疫测定法。传统植物激素和植物生长调节剂测定方法各有优缺点,下面分别进行评述。
手打整理植物内源激素种类及应用
植物调节剂的现状、发展方向及安全性根据农业部农药信息网统计，我国常用的植物生长调节剂登记数据有800余项。其中，登记数量比较多的原药有10余种，包括赤霉素、多效唑、萘乙酸、氯吡脲、芸苔素内酯、乙烯利、噻苯隆、苄氨基嘌呤、复硝酚钠、单氰胺等。从登记作物来看，水果中葡萄、柑橘、苹果、香蕉、菠萝登记的植物生长调节剂最多；农作物上主要登记的有棉花、水稻、小麦、玉米、油菜、花生；蔬菜上登记的主要有番茄、芹菜、菠菜、黄瓜、马铃薯和白菜；其他植物生长调节剂登记的农产品有花卉、人参、茶叶、杨树等。 植物生长调节剂的种类可分为生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、乙烯、脱落酸和其他类（包括芸苔素内酯、水杨酸、多胺、茉莉酸、植物多肽激素、寡糖素等），其中，生长素、赤霉素、细胞分裂素、芸苔素內酯属于生长促进剂，脱落酸、乙烯属于生长抑制剂。适当使用植物生长调节剂对提高产量、改善品质、提高抗性、延长保质期等有明显的作用[1]。下文将分类介绍各类植物生长调节剂的性质、文献报道的使用方法，以及一些在国内（国光公司）未使用的植物生长调节剂。 1生长素（IAA）类 生长素（IAA）是最早被发现、生理作用最重要的一种物质。1926年温特利用燕麦胚芽鞘实验证明其尖端有一种能促进生长的化学物质，称为生长素。1934年科戈从麦芽、人尿和根霉中分离出一种促进生长的物质，称为吲哚乙酸。之后科学家还陆续发现了萘乙酸（NAA）、苯乙酸（PAA）吲哚丁酸（IBA）等类似生长素的生理活性物质。由于吲哚乙酸性质不稳定，易在体内分解，于是人工合成了吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸等，这些外源生长素性质稳定，活性较强，在各种作物上进行了大面积使用。 生长素大多集中在根尖、茎尖、嫩叶、正在发育的种子和果实等植物体内分裂和生长代谢旺盛的组织。生长素只能由植物顶部向基部运输，这种单方向的运输形式称为及极性运输。生长素的主要生理作用有：促进侧根和不定根的形成；促进胚芽鞘和茎的生长，抑制根的生长，促进顶端优势；推迟叶片的衰老脱落；诱导雌花分化和单性果实成熟；促进叶片扩大；诱导维管细胞分化，低浓度诱导韧皮部分化，高浓度诱导木质部分化。生长素在生产实践中被广泛用于番茄和茄
五大植物内源激素
一、生长素类 增加雌花，单性结实，子房壁生长，细胞分裂，维管束分化，光合产物分配，叶片扩大，茎伸长，偏上性，乙烯产生，叶片脱落，形成层活性，伤口愈合，不定根的形成，种子发芽，侧根形成，根瘤形成，种子和果实生长，座果，顶端优势。 但是必须指出，生长素对细胞伸长的促进作用，与生长素浓度、细胞年龄和植物器官种类有关。一般生长素在低浓度时可以促进生长，浓度较高则会抑制生长，如果浓度更高则会使植物受伤。细胞年龄不同对生长素的敏感程度不同。一般来说，幼嫩细胞对生长素反应非常敏感，老细胞则比较迟钝。不同器官对生长素的反应敏感也不一样，根最敏感，其最适浓度是10-10mol/L左右；茎最不敏感，最适浓度是10-4mol/L左右；芽居中，最适浓度是10-8mol/L左右。 二、赤霉素类 （一）促进茎的生长 1、促进整株植物的生长 尤其是对矮生突变品种的效果特别明显，但GA对离体茎切段的伸长没有明显的促进作用， 而IAA对整株植物的生长影响较小，却对离体茎切段的伸长有明显的促进作用。GA促进矮生 植株伸长的原因是由于矮生种内源GA生物合成受阻，使得体内GA含量比正常品种低的缘故。 2、促进节间的伸长 GA主要作用于已有的节间伸长，而不是促进节数的增加。 3、不存在超最适浓度的抑制作用 即使GA浓度很高，仍可表现出最大的促进效应，这与生长素促进植物生长具有最适浓度显著 不同。 （二）诱导开花 某些高等植物化芽的分化是受日照长度（即光周期）和温度影响的。例如，对于二年生植物，需要一定日数的低温处理（即春化）才能开花，否则表现出莲座状生长而不能抽薹开花。若对这些未经春化的植物施用GA，则不经低温过程也能诱导开花，且效果很明显。此外，GA也能代替长日照诱导某些长日植物开花，但GA对短日植物的化芽分化无促进作用。 对于花芽已经分化的植物，GA对其花的开放具有显著的促进效应。 （三）打破休眠 GA可以代替光照和低温打破休眠，这是因为GA可诱导α-淀粉酶、蛋白酶和其他水解酶的合成，催化种子内贮藏物质的降解，以供胚的生长发育所需。 在啤酒制造业中，用GA处理萌动而未发芽的大麦种子，可诱导α-淀粉酶的产生，加速酿造时的糖化过程，并降低萌芽的呼吸消耗，从而降低成本。 （四）促进雄花分化 对于雌雄异花同株的植物，用GA处理后，雄花的比例增加；对于雌雄异株植物的雌株，如用GA处理，也会开出雄花。GA在这方面的作用与生长素和乙烯相反。 （五）其他生理效应 GA还可以加强IAA对养分的动员效应，促进某些植物坐果和单性结实、延缓叶片的衰老等。此外，GA也可以促进细胞的分裂和分化，GA促进细胞分裂是由于缩短了G1期和S 期。但GA对不定根的形成却起抑制作用，这与生长素的作用又有所不同。
植物激素检测技术研究进展
生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 第22卷 第1期2010年1月 Vol. 22, No. 1 Jan., 2010 文章编号 ：1004-0374(2010)01-0036-09 收稿日期：2009-08-03 基金项目：国家自然科学基金项目(90717002; 20805001)*通讯作者： E-mail: yu.bai@https://www.sodocs.net/doc/198235529.html, 植物激素检测技术研究进展 白 玉，杜甫佑，白 玉*，刘虎威 (北京大学化学与分子工程学院，北京 100871) 摘 要：植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它们在植物的生长发育和环境应答过程中 具有非常重要的作用，其超微定量及原位测定技术仍是制约植物激素研究的瓶颈问题之一。该文着重介绍了近年来茉莉酸及其甲酯、脱落酸、生长素、赤霉素和多肽激素等植物激素分析检测技术的最新研究进展，并对植物激素超微量、高灵敏检测技术研究中存在的问题和发展前景进行了简要的讨论。关键词：植物激素；分析检测；进展 中图分类号：Q946.855；Q94-334 文献标识码：A Recent development in determination of plant hormones BAI Yu, DU Fu-you, BAI Yu*, LIU Hu-wei (College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, China) Abstract: Phytohormones, a series of trace organic compounds synthesized in plants, play important roles in plant growth, development and environmental response. The ultrasensitive and in-situ detection of phytohormones has been a crucial issue in the plant research. This paper mainly presents the recent development in determina-tion of jasmonic acid, methyl jasmonate, abscisic acid, auxin, gibberellin and peptide hormones, and discusses the challenges and prospects in this topic. Key words: phytohormones; determination; progress 植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应[1, 2]。通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质[3,4]。因此，国家自然科学基金委员会按照国家粮食发展需要、中长期科学和技术发展规划以及我国在植物激素研究方面所具有的知识积累和坚实的工作基础，在1997年启动了“植物激素作用的分子机理”重大研究计划，其中“植物激素成分分析、超微定量检测和原位检测”成为该重大研究计划中的六个核 心科学问题之一[5]。 植物激素主要包括生长素(a u x i n )、赤霉素(gibberellin, GA)、细胞分裂素(cytokinin, CTK)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids,BRs)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids, SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等，它们在植物体内的含量极低(通常在ng/g ，甚至pg/g 水平上)，且周围共存的基体成分非常复杂，几乎不可能同时分析所有植物激素[6, 7]。此外，多数植物激素的性质不稳定，对温度等外界条件敏感，在各器官中呈现一定的动态分布。因此，如何精确可靠地对超微量的植物激