技术五：MACS(磁珠分选)小鼠细胞分选与分析试剂
技术五：MACS(磁珠分选)小鼠细胞分选与分析试剂
流式细胞分选技术介绍2
流式细胞分选技术介绍 流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter, FACS），其实FACS并不是流式细胞仪的通称，它是BD公司的注册商标。 细胞分选的原理 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 流式细胞分选的特点 1. 少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高（99%以上），速度快。目前，先进的流式细胞仪的分选速度可达25 000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上，分选后细胞的活力会受到很大的影响， 2. 可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。 3. 不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度（如细胞
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞技术临床应用及研究
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 流式细胞技术临床应用及研究 1 流式细胞技术临床应用及研究流式细胞技术是激光为光源，集流力学技术，电子物理技术，光电测量技术，计算机技术以及细胞荧光化学技术，单克隆抗体技术为一体的新型技术仪，应用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒经行快速的，多参数的，定量分析和分选技术称为流式细胞技术（FCM）［1］。 其中生物颗粒包括大的免疫复合物，DNA，RNA，蛋白质，病毒颗粒，脂质体，细胞器，细菌，染色体，真核细胞，杂交细胞，聚集细胞等，所检测的生物颗粒理化性质包括大小，细胞形态，胞浆颗粒化程度，DNA 含量，总蛋白含量，细胞膜的完整性和酶活性学。 由于融合了单克隆抗体技术，定量细胞化学和定量荧光化学，流式细胞技术作为一门生物检测技术已经日臻完善，流式细胞或在生物学，免疫学，胞瘤学，血液学，病理性，遗传学，临床检验等学科中都得到广泛的应用，并将为医学科学研究发挥更大的作用。 1 生物分析原理将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管，在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品在喷嘴附近组成一个圆 2 柱流束自喷嘴的圆形孔喷出，于水平方向的激光束垂直相交，相交点成为测量区。 染色的细胞经激光照射后发出荧光，同时产生光散射。 1 / 6
自己总结：流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞仪分选技术的好处
流式细胞仪分选技术的好处 流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度。那么流式细胞仪分选技术的好处有哪些?给大家详细的讲解一下。 流式细胞仪分选技术特点 1. 少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高(99%不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为10个细胞。如果细胞量超过10个，则需要耗费10小时以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两路分选。仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。 3. 不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光
度(如细胞体积)或荧光(如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原)散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态，那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。 4. 如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式分选还是比较划算的，只需要准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费即可，不需要购买配套的设备。 流式细胞仪分选技术应用 1、干细胞组织工程在研究。 2、细胞增值、活性和凋亡研究。 3、疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究。
4、基因表达和表达调控研究。 5、细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究。 6、各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究。 7、药理药效和药物开发研究。 8、移植和细胞治疗研究。 9、生物材料对细胞结构、活性和功能的影响等。利用仪器的分选功能分选得到高纯度、高活性的稀有细胞，通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化和移植等进行更深一步的细胞功能和细胞治疗探索，还可以在此基础上逆向进行基因组合蛋白质组相关研究，寻找致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式。
干细胞分选技术(综述)
干细胞分选技术（综述） 引言 干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。新近研究表明干细胞可以为临床细胞替代治疗和移植治疗提供新的细胞来源，有广阔应用前景。 背景资料 干细胞的概念 干细胞是指那些具有自我更新能力，在一定的条件下又能产生各种高度分化的子代细胞的增殖性细胞。目前公认的干细胞所应具备的几点主要的细胞生物学特点： （1）具有自我更新能力与自我维持能力，也就是说它可以分裂，分裂后的子细胞与母细胞一样不但能保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地分裂下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些具有有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义。 （2）具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。 （3）具有高度增殖能力，在体内干细胞的高度扩增具有非常重要的意义，如造血干细胞通过高度扩增补充由于细胞正常衰老而丧失的细胞；同时由于干细胞虽具有多能性但数量不多，因而只有通过体外扩增才能对其进行研究。因此干细胞高度扩增不但对机体正常功能的维持起着非常重要的作用，而且对干细胞的研究和应用也有着非常重要的作用。 （4）既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等。 （5）干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，即nitches，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。 干细胞的分类 根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势将它们分为两大类：ES细胞和成体干细胞（或称之为特定组织干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等）。 ES细胞 ES细胞是从附置前早期胚胎内细胞团或附置后胚胎原始生殖细胞分离克隆的一类具有自我 更新能力和发育全能性的，并能产生分化后代能力的早期胚胎细胞，包括畸胎瘤干细胞(EC细胞)，ES 细胞,胚胎生殖细胞(EG细胞)。它们的基本特性是具有发育的全能性，能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。 EC细胞具有恶性生长并显示出类似于胚胎细胞发育全能性或多能性的双重性质，早在20世纪七八十年代，EC细胞常常被用来作为研究哺乳动物发育和遗传的模型，以及作为诱导细胞分化的模型，并且已经成功地诱导出了神经细胞，肌细胞,软骨细胞及上皮细胞等包括( 个胚层在内的各种类型分化细胞。但是EC 细胞具有核型异常等恶性肿瘤的特性，难以参与嵌合体胚胎的发育，用它们作为研究正常人体细胞分化的模型并不合适。故在20世纪90年代初期，科学家们从小鼠的早期胚胎的桑葚胚中分离并建立了ES细胞系，并逐渐趋向以大动物如猪,狨等为研究对象，力图解决哺乳动物的细胞分化的模型难题。终于在1998年，人们迎来了梦寐以求的喜讯：美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料,不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的ES细胞系和EC细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。EG细胞是从人和小鼠的生殖脊分离培养出来的类似于ES细胞的一类具有发育全能性的细胞系。它具有与来自IEM的ES细胞相同的特征，包括细胞的体外分化和产生生殖系嵌合体后代，但它们并非完全一样：首先EG细胞的培养与建系较ES细胞困难，EG细胞所需的培养条件特别是饲养层细胞的培养较ES细胞的培养苛刻得多；其次EG细胞与ES 细胞在形态特征上也不同。 成体干细胞成体干细胞也称为特定组织干细胞，是指成体组织中所存在的具有自我更新与产生本系统后继续分化能力的那类细胞，它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细
流式细胞分选原理与应用
流式细胞分选原理与应用 北京大学医药卫生分析中心 吴后男 2010. 04. 26 教学邮箱：cell-2009@https://www.sodocs.net/doc/1a11467070.html, 密码：82802389 Tel : 8280 5034 or 2437 第一部分分选仪结构与原理 ●流式细胞分选技术（Flow Cytometry，FCM） 利用分选仪检测单细胞或生物颗粒的多种特异性荧光信号，并针对同样荧光信号特性的细胞亚群从总细胞群体中分离和富集的高科技细胞分析技术。 ●高速分选特点 1. 检测对象：荧光素标记单个细胞悬液 2. 分选速度快：5万个细胞/秒 3. 分选纯度高：99%以上 4. 回收率高：＞80% 5. 同时检测单细胞(single)内多种信息：膜、浆、核 ●分选仪主要厂商 1. 美国BD公司(Beckton Dickinson) ▲1973年第一台问世：FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter） ▲1980年中国第一台：FACS II ▲市场占有率：全球75%，中国70% 2. 贝克曼库尔特公司（Beckman Coulte） 中国30%，目前呈逐年上升趋势 ●分选仪内部结构 一、光学系统 1.激发光源：激光器 ▲气体：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子 （647nm）、氪氩（568nm） ▲染料：如氩离子激光泵浦的Rhodamin 6G水溶液染料，激 发出550-650nm可变波长激光 ▲半导体：价格低、结构简单、寿命长，但功率较低。现 已广泛应用。如：BD的FACS Calibur、Aria已 采用固体激光器 2.光收集系统 滤光片 Trigons and Octagon 二、液流系统 1.流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交 2.液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器 FACS Aria 液流系统流程图 三、电子系统 1.光电转换器:将光信号转换为电信号
细胞分选介绍
BD FACSAria高速流式细胞分选仪 自从1974年BD公司与美国斯坦福大学合作研制出全球第一台流式细胞分选仪，BD公司就不断推陈出新，在流式细胞技术领域里始终保持领先地位。BD公司最新推出的革命性的流式细胞高速分选仪FACSAria，更是划时代的流式细胞仪。这一新型仪器是BD公司25年的流式细胞仪研制经验的集体智慧的结晶。 BD FACSAria流式细胞分选仪的名字来自音乐名词Aria, 取意引人注目的独奏，因为它不需要特殊的房间设备，也不要求使用者有多年的技术经验，就可以独立完成工作。BD FACSAria 的高速细胞分选和多色分析的性能极佳，而操作却非常简便。 BD FACSAria流式细胞分选仪为高性能流式细胞仪建立了更高的新标准。由于使用了全新的设计，BD FACSAria流式细胞仪成为世界上第一台使用石英杯流动池固定校准的，可以完成高速细胞分选的台式流式细胞仪。BD FACSAria流式细胞分选仪使用了许多先进技术，大大降低了高速分选的成本，易于使用，分选与分析性能无与伦比，是科学研究的一大进步。BD FACSAria流式细胞分选仪的核心技术 BD FACSAria流式细胞分选仪的核心是石英杯流动检测池。仪器使用了全新设计，实现了完全的固定光路系统。这一设计使用户从繁琐的仪器优化调整工作中解放出来，将主要精力集中在科学研究上。 使用这种新型石英杯流动检测池，可以在低功率激光器的条件下，获得非常高的检测灵敏度。因此，仪器可以使用空气制冷的固态激光光源，这样一来，BD FACSAria流式细胞分选仪就不再使用与高功率激光器配套的特殊电源和冷却设备了。 BD FACSAria使用光导纤维系统，将激光器发射出的激光束精确、稳定地聚焦在样本流轴心位置。光导纤维将三根激光束（波长分别为488 nm、633 nm和407 nm）精确汇聚在棱镜上，再通过棱镜，激光束聚焦在石英杯流动检测池的中间（图1）。由于样本轴流位于石英杯流动检测池的中心，而激光束聚焦的位置也固定在中心，所以每日开机不再需要做仪器的优化调整。 图1 488 nm、633nm和407 nm激发光束聚焦光路 使用石英杯流动检测池的设计有两个突出的优点：一是提高了激光的激发效率，二是增强了发射光信号的收集效率。在BD FACSAria流式细胞分选仪上，细胞受激光激发时，与空气中液流受激光激发的流式细胞分选仪不同，在BD FACSAria流式细胞仪上，细胞通过激光照射区的流速更慢，激光照射时间更长，液流只是从喷嘴进入空气时才被加速，然后振荡断裂为液滴，细胞被分选收集。 BD FACSAria流式细胞分选仪的另一优点是它的光信号收集系统。提高激发效率可以提高检测性能，但是，当大部分荧光素已经被饱和时，就只有使用更佳的收集系统设计，才能提高检测灵敏度了。BD FACSAria的石英杯流动检测池使用了光胶耦合的方法，光信号收集效率至少是液流空气激发的流式细胞分选仪的4倍。使用光胶耦合的石英杯流动检测池是BD FACSAria高速流式细胞分选仪的专利技术，大大提高了仪器的信号检测灵敏度（<125 MESF）。全新的光学系统 石英杯流动检测池被光胶耦合在荧光接收物镜上，光学接收系统收集到最大量的光信号（图2）。来自三个激光光源的荧光信号被荧光物镜收集，分别聚焦到三根光导纤维上，信号接收光导纤维再将检测产生的光信号传输到各自激光的信号收集系统上。光学接收系统的特殊设计可以保证最大程度地收集每根激光产生的荧光信号。首先，通过一组长通二分镜，荧光信号中波长最长的被传输到第一个光电倍增管（PMT）上，而其余较短波长的荧光信号则向下一个PMT方向反射。每一个PMT前都有带通滤光片收集特定波长的光信号，这样可以严格限制所接收荧光信号的波长。反射比透射的效率更高，因此，这种设计极大地提高了仪器在
(完整版)流式细胞分选技术
流式细胞分选技术 一、定义 流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。【晶莱生物】 二、实验原理 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 三、实验流程（以分选有核红细胞为例） 1.采抗凝血10 ml。 2.密度梯度分离单个核细胞层 （1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 （2）取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20分钟。 （3）离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。 （4）用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 3.免疫荧光染色 将上一步得到的单个核细胞层按1×10/1的比例加入异硫氰酸(FITC)标记的CD71单克隆抗体(鼠IgM)，孵育30 min后重悬于0.5 ml PBS 液中进行荧光染色。 4.FACS分选CD71阳性细胞。[晶莱生物]
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围 2008-11-01 10:30 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开
流式细胞术简介
流式细胞术简介 一、流式细胞术发展简史 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； ②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。 近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。 二、流式细胞计的基本结构和工作原理 流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在
流式细胞术分离法
流式细胞术分离法 一实验目的 掌握流式细胞术分离T、B细胞的原理与方法。 二实验原理 流式细胞术（FCM）是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入从外周血液中分离的单个核细胞悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，即可很快的得到T、B细胞及亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞（18×106个细胞/h）的速度分离收集无菌的淋巴细胞，纯度可以达到90％~99％，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。 流式细胞仪由激光光源系统、气控单细胞层流系统、光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 工作原理为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下同时进入流室，形成鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下（1000~5000个细胞/s），与垂直而来的激光束交汇。在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗粒多少及DNA含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受；细胞上着染的荧光燃料在激光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接收，所有信号自动传送入电子计算机分析处理，迅速获得细胞类群及其数量的信息。由高频超声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同细胞类群的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收集于不同的容器内。 三实验器材 1器具 恒温培养箱、流式细胞仪、水浴锅、水平式离心机、离心管、冰箱、烘箱、吸管、滴管、微量加样器等。 2 材料 RPMI-1640、FITC-抗CD3单克隆抗体（FITC为异硫氰酸荧光素）、CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）、分离单个核细胞所需试剂。 四实验方法 1用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×
流式细胞仪(检验仪器)
流式细胞仪 flow cytometer;FCM 定义： 将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算 机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。 通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分 析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速 分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数， 进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。 流式细胞仪 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。 多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节分辨率为零。 查看精彩图册
目录 基本结构 工作原理 技术参数 调试和使用 应用 展开 基本结构 工作原理 技术参数 调试和使用 应用 展开 基本结构 组成 流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。上图为其结构示意图。 流动室和液流系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般
限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。 激光源和光学系统 经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收 集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许
细胞分选的具体步骤及注意事项
细胞分选的具体步骤及注意事项 一、技术简介 细胞分选是据细胞的属性，将混合细胞分为具有不同特性的几个不同类群的方法。细胞分选常用的方法是流式细胞仪分选和免疫磁珠细胞分选。此技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学和神经生物学中。 流式细胞分选是利用流式细胞分选仪，对细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，对复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离。免疫磁珠细胞分选是把细胞用超级顺磁性的 MACS MicroBeads （MACS微型磁珠）特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。 二、实验流程 A．流式细胞分选 1. 取1×105个待检测的细胞，加5 ml DPBS洗涤，室温2000 r/min离心5 min，弃上清，然后用200 μl 0.5% BSA-DPBS重悬细胞。 2. 想细胞悬液中加入荧光染料标记的抗体，4℃孵育30 min。 3. 将染好的细胞用0.5% BSA-DPBS 洗涤两次，然后用500 μl 0.5% BSA-DPBS 重悬，流式细胞仪检测。 4. 结果统计分析。 B．磁珠细胞分选方法 1. 离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液（0.5%BSA、0.08%EDTA， PH7.2），真空抽滤除菌及液体内气体，充分混悬细胞（0.5 ml/1×108细胞），加入一抗（10-20 μg/ml终浓度），4℃孵育30 min。 2. 用20倍体积PBE洗细胞一次，再加PBE（0.3 ml/1×108细胞）充分混悬细 胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8~15℃孵育10~15 min。 3. 将分离柱安装入磁场中，加入0.5 ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预 处理分离柱。
流式细胞分选术的应用进展
流式细胞分选术的应用进展 【摘要】流式细胞分选技术具有检测速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点，因而应用广泛。本文简要概述了流式细胞术的概念及流式细胞分选的原理，并对其在肿瘤干细胞分选、外周血细胞分选、染色体分离、稳定细胞转染株筛选等方面的应用进展作一综述。 【关键词】流式细胞；分选；应用 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术，它不仅可以对细胞、微生物等进行检测分析，而且还可以根据颗粒特性进行分选，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大等特点，因而被广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学、药物开发、环境检测、食品卫生防疫等科学研究和工作中[1]。 1 流式细胞术的概念 流式细胞术是20世纪60年代末开始发展起来的技术，它是集激光技术、光电测量技术、电子生物技术、电子计算机技术、流体力学以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。流式细胞仪是应用流式细胞术的有效工具，它使细胞或微粒在鞘液包裹下流动，逐个通过激光聚焦区，并用高灵敏度的光学系统收集各散射光及荧光信号，再经过计算机系统对采集的信号进行存储、显示，从而得以对粒子进行多参数分析，包括诸如粒子颗粒度和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、多分子复合体排列、多价反应动力学等[2]。分选型流式细胞仪一般还有筛分的作用，可以根据所检测颗粒的某种性质进行分选和回收，用于后续功能实验。并且，如果整个分选的过程是在无菌条件下进行的，分选下来的细胞还可以用来继续培养。在我国，20世纪90年代初已开始研发应用流式无菌分选的技术[3]。 2 流式细胞分选的原理 分选型流式细胞仪一般由液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统4部分组成。流式的分选功能是通过鞘液流形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装有一个高速振荡器，该装置在充电后以每秒几万次的振动频率，使鞘液流成为上万个液滴；目前，先进的分选型流式细胞仪震荡速度可以达到10万/s。此时，细胞的荧光和散射光信号已被测量（即判断液滴是否该被分选），这时给鞘液流一个充电脉冲信号，待分选的液滴就全部带上了电荷。流式细胞分选仪的检测分析系统通过分选设门特性迅速判定其是否为靶细胞。当充以不同电荷的含细胞的鞘液滴流经带有正负几千伏恒定静电电场的偏转板时，就根据自身所带的电荷性质产生偏转而落入各自的收集管中，不带电荷的液滴就进入废液槽中，从而实现了细胞的流式分选[4]。 现代高端型流式细胞分选仪每秒可以实时检测定量分析、分选数万个细胞，
干细胞分选技术
干细胞分选技术 干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。新近研究表明干细胞可以为临床细胞替代治疗和移植治疗提供新的细胞来源，有广阔应用前景。 干细胞的分类 根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势将它们分为两大类：ES细胞和成体干细胞（或称之为特定组织干细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等）。 ES细胞：ES细胞是从附置前早期胚胎内细胞团或附置后胚胎原始生殖细胞分离克隆的一类具有自我更新能力和发育全能性的，并能产生分化后代能力的早期胚胎细胞，包括畸胎瘤干细胞(EC细胞)，ES 细胞,胚胎生殖细胞(EG细胞)。它们的基本特性是具有发育的全能性，能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。 成体干细胞：成体干细胞也称为特定组织干细胞，是指成体组织中所存在的具有自我更新与产生本系统后继续分化能力的那类细胞，它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地分裂成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化成与器官保持生长和衰退的动态平衡。 干细胞的应用 随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段，利用干细胞在体外扩增培养并诱导成所需要的细胞后移植入患者体内，用于组织损伤的修复、退行性器官的替代及改善遗传性缺陷组织器官的功能。而成体干细胞可塑性分化的发现，为细胞替代治疗提供了新的种子细胞。 干细胞的分离纯化 所谓细胞分离（cell isolation）,指的是将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。而所谓细胞纯化更进一步强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，使培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系。分离和纯化两个概念之间没有截然的界限，许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主的程度，所以也成称为富集(enrichment)。分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养和继代培养的过程中，甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。