当前位置：搜档网 › 福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

姓名：XXX 学号：201100XXXX 年级：2011级生物基地班

学院：生命科学学院实验日期：2013年3月11日同组者：XXX 一、实验目的

熟悉并掌握福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质浓度的原理和方法二、实验原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。三、实验器材

标准酪蛋白：200ug/mg 分光光度计试管移液枪水浴保温锅

四、实验试剂

1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液

A液：取4%的Na2CO3和0.2mol/L的氢氧化钠溶液按1:1溶合

B液：取1%的CuSO4和2%的酒石酸钾钠按1:1溶合。

临用时按A：B=50：1混合使用。

2.Folin-酚试剂乙：

按原液：水=1:1配好，这个实验前老师已配好。

3.样品：

血清，已稀释200倍。

五、实验步骤

1.标准曲线的绘制

取6支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

2.样品测定

在做第一步的同时，准确吸取样液0.2ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。六．实验结果

试剂

管号

1 2 3 4 5 6 样品

1 2 3

标准酪

蛋白0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

样品液0.2 0.2 0.2

水 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8

甲液分别加入5mL酚甲液混匀，30℃水浴10min

乙液分别加入乙液0.5mL混匀，30℃水浴30min

640nm比

色OD值0 0.08

0.13

0.22

0.28

0.32

0.22

6 0.229

样品评均OD值：0.228

标准曲线

管号1 2 34 5 6

蛋白质浓

度ug/mg

0 40 80 120 160 200

640nm比

色OD值

0 0.0850.1380.2250.2800.329

标准曲线

样品浓度：121ug/mg

七．实验结果分析及思考

1、试说明Folin-酚法的优缺点

该方法较双缩脲法反应灵敏，与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。

2、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚乙试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

Folin—酚试剂由A试剂和B试剂组成。A试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。B试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的

酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。

由此可见是它们的显色灵敏度不同造成的。

3、Folin 酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？

第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物(呈蓝色反应)，因此需要快速混匀, 继续实验

八．注意事项

1.一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如果时间超过了30分钟，则测得的光密度值就不准确了

2.由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的时候要尽量做到准确；

3.在使用分光光度计时，那比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污是测量值不准确；

4.在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦；

5.在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材 1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定（一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％；操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h，试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2 双缩脲比色法 2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。二、实验仪器分光光度计,试管,移液管,容量瓶，分析天平，烧杯三、实验试剂 1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml。临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2.Folin-酚试剂乙：将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml

四、实验步骤 1.标准曲线的绘制取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在500nm 处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线 2.样品测定准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀，放置15分钟，在500nm 处测定光密度值。五、实验结果管号试剂 1 2 样液（ml ） 1.0 1.0 Folin-酚试剂甲 5.0 5.0 （ml ）

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法（一）蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1．标准曲线的绘制：按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大中小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（biuret 法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较【摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），Folin —酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃），通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间【关键词】：凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法一、凯氏定氮法 1.1原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

福林酚法测蛋白浓度

87 ...“It is flattering to be ‘most cited author,’but I am afraid it does not signify great scientific accomplishment. The truth is that I have written a fair number of methods papers, or at least papers with new methods included. Although method development is usually a pretty pedestrian affair, others doing more creative work have to use methods and feel constrained to give credit for same 1.... Nevertheless, although I really know it is not a great paper (I am much better pleased with a lot of others from our lab), I secretly get a kick out of the response.... “Perhaps you would be interested in a little about the history of the method. Back in 1922, Wu, who worked with Folin,applied the reagent to proteins, without CU 2+, so it was based on the tyrosine and tryptophane contents of the protein. This procedure was used sporadically for some time and had a reputation for erratic results,probably because traces of contaminating CU 2+ would increase the readings. Herriot, in a 1935 footnote to another paper,mentioned that CU 2+ enhanced readings with protein, and in 1941 published a short communication describing the CU 2+ enhancing effect for 7 proteins, and giving convincing evidence that the enhancement was attributable to reaction with peptide bonds. “Before I came to St. Louis we had need of a micro method for protein, studied the reaction some more, and came up with a revised procedure which we felt was an improvement, particularly in regard to application to a variety of situations.Actually, however, we had made few fundamental changes from the method of Herriot, and had never really intended to publish it. “When I came to St. Louis in 1947 Earl Sutherland, who was here then, adopted our procedure, but for several years complained that he had to cite it as ‘personal communication,’ and, he inquired, why didn’t we write it up? So we finally went to work and did the necessary things: studied the reaction more thoroughly, tested it a lot of ways,described its virtues and disadvantages,compared the results with a Kjeldahl procedure, investigated what interfered, etc.“This was a lot of work and the three co-authors helped in various ways. The greatest help was from Miss Nira Rosebrough (now Mrs. Nira R. Roberts) who became one of the best technicians I have ever had. She left us in 1957, worked for awhile with Dr. Rosen in Buffalo, and then quit science to raise a family. Dr. A. Lewis Farr (M.D.) was a post-doctoral student who had an outstanding record in medical school but decided after a year or so to go into private practice in his hometown in Greenville, Mississippi. Mrs.Randall was a technician who stayed at most a year, then left with her husband, and I don’t believe has been in science since, but I have lost track of her. “I...am puzzled why the paper is so often cited, and cited as such. I would like to think it is partly because we studied it pretty thoroughly and it is still applicable in most cases without modification, whereas the original Kjeldahl method, for example, has had innumerable major modifications and microfications, and people cite the particular modification they use. Another reason why our method isn’t simply referred to by name is that it’s quite a mouthful to say ‘Lowry,Rosebrough, Farr, and Randall.’ The method apparently filled a need in the beginning—and a lot of people measure proteins in their work.Once it became established by people like Sutherland and Kornberg, other people may have thought it was the method to use, or at least checked the procedure they were using against it.”2 1.Lowry O H. Personal communication to D.J.D. Price, November 11, 1969. 2.Lowry O H. Personal communication to E. Garfield, August 5, 1976. ...The authors assert that the use of the Folin phenol reagent for the measurement of proteins “has not found great favor for general biochemical purposes.” This study is concerned with modifying the Folin phenol reagent procedure by treating protein solutions “with copper in alkali.” By recording the color change after the copper treatment, and measuring the quantity of protein present with a Beckman spectrophotometer, the authors determined that “measurement of protein with copper and the Folin reagent” is more sensitive and simpler than other procedures. Professor Oliver H. Lowry: Number 1 January 3, 1977 Citation Classics Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L & Randall R J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265, 1951.

BCA法测蛋白含量

THE BICINCHONINIC ACID (BCA) ASSAY FOR DETERMINATION OFTOTAL PROTEIN Principle原理 Smith et al. (1985) introduced the bicinchoninic acid (BCA) protein assay reagent. Inone sense, it is a modification of the Lowry protein assay reagent. The mechanism ofcolor formation with protein for the BCA protein assay reagent is similar to that ofthe Lowry reagent, but there are several significant differences. The BCA protein assayreagent combines the reduction of Cu2+ to Cu+ by protein in an alkaline medium (i.e., thebiuret reaction) with the highly sensitive and selective colorimetricdetection of the cuprous cation (Cu+) by bicinchoninic acid.The purple-colored reactionproduct of this method is formed by the chelation of two molecules of BCA with onecuprous ion (Fig. A.3H.3). The BCA/copper complex is water-soluble and exhibits astrong linear absorbance at 562 nm with increasing protein concentrations. The primaryadvantageoftheBCAproteinassayreagentisthatmostsurfactants,evenifpresentinthesample at concentrations up to 5% (v/v), are compatible with this method. Table A.3H.2is a brief troubleshooting guide for this technique. 二喹啉甲酸（BCA）法是在福林酚法的基础上改善而来的，即在碱性条件下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，然后与BCA试剂反应生成紫色化合物，在562 nm处检测。

实验一蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定姓名：mangogola 一．实验原理生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。 Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高，但较费时。对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。二．实验过程（Lowry法） 1.溶液配制 A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确） B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。 C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。 D液：Folin试剂标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液 2.标准曲线测定按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋

蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH |+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 170

2NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2) (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下： 171

食物中蛋白质含量的测定

一、实验摘要：蛋白质是含一定量氮的有机化合物。其测定方法也有很多种。不同的方法都有其优点和缺点，以及它们的适用范围不同。紫外吸收法（方便快捷，0.2-2mg/ml）凯氏定氮法（粗蛋白测定，0.2 – 2.0mg /ml) 双缩脲法（1-10mg /ml) 福林酚法（0.005-0.10mg /ml) G250 （0.025-0.20mg /ml) （考马氏亮蓝法） BCA法（0.010-1.2mg/ml；0.0005-0.001mg/ml）此次实验采用牛奶样品在凯氏烧瓶中经浓硫酸和催化剂消化后，使蛋白质分解，产成的氨与硫酸结合生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，并用硼酸吸收，以标准盐酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量。此次实验中使用的是乳制品，系数F=6.38.这种测定方法即为凯氏定氮法。因为食品中除蛋白质外，还含有其他含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白质。此次实验后，我们组的最终得率为2.77%。二、实验目的： 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理，蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等 3、侧面了解测定食品中蛋白质含量的多种方法和优劣三、基本原理：利用浓硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H 形成CO 2、H 2 O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液用NaOH碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。 1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4 反应式为：H2SO4==SO2↑+ H2O +[O] R-CH2-COOH+[O]==R-CO-COOH+ NH3↑

蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法，也可以通过酚试剂的方法，所以大家觉得哪种方法比较方便，我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。紫外吸收法较为灵敏50～100mg快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶; Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高～5mg慢速40～60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5mg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液; SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。硫酸铜法：称取0.2g硫酸铜，6g硫酸钾，把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中，加20ml硫酸，

(瓶口上放一个小漏斗，防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化，等没有碳化颗粒，并处于澄清状态时，拿下来凉一会。再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止，再消化30分钟。拿下来，等凉。通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍，我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的，希望你们可以采纳文章介绍的方法。

福林酚测定法

福林酚测定法试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g,加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。临用前，合并两液，并加水至500ml。操作法⑴对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3ml的溶液。 ⑵供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。 ⑶标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液（取福林试液中的贮备液1→16）4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。以吸收度作为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。 ⑷测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。二）试剂与器材 1.试剂（1）试剂甲：（A）10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2 MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或γ—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250μg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。 2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支

蛋白质含量测定方法比较

. 蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。凯氏定氮法蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法双缩脲（NHCONHCONH）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的

缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。紫外吸收定氮法双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收