几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较

几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较

摘要试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P＞0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P＞0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P＜0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P＜0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P＞0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P＜0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。

关键词蛋白质饲料；体外消化率；测定方法中图分类号 S816.32

消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen 和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 饲料原料

酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。

1.1.2 主要试剂

硫酸（GB 625—77）、硫酸铜（GB 665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。

硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。

混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。

0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。

标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。

胃蛋白酶活性为1：10 000；胰蛋白复合酶活性为2 500IU/mg；鲈鱼消化道混合液；草鱼消化道混合液；双抗为青霉素G钾盐（150 IU/ml）和硫酸链霉素（150IU/ml）；14%磺基水杨酸钠。

1.1.3 主要仪器

实验用样品粉碎机、分析筛（孔径0.60mm）、分析天平（感量0.001g）、滴定管（酸式，100ml）、电炉、消化炉、电热式恒温烘箱、干燥器、凯氏蒸馏装置、过滤装置、磁力搅拌器、离心机、恒温水浴振荡器等。

1.2 试验方法

1.2.1 原料蛋白质测定

1.2.1.1 消化

称取0.6～0.7g（准确至0.001g）试样，无损失地放入消化瓶中，加入无水硫酸钠和硫酸铜的混合物[m（CuSO4·5H2O)：m(Na2SO4)=1：9]6g，与试样混合均匀，再加浓硫酸20ml，在消化炉上小心加热，起初电压调大，冒烟时调小电压，大量冒烟后再调大电压，加热至样品呈透明的浅蓝色或白色为止，关上电源，使消化瓶自然冷却。而后，用蒸馏水冲洗消化瓶，洗液注入100ml容量瓶内，定容。同时做一个空白对照试验。

1.2.1.2 蒸馏

连接好凯氏蒸馏装置，加热使之产生蒸汽。取20%硼酸溶液20ml置于150ml三角瓶内，并加混合指示剂1滴，然后将其置于冷凝管下。吸取消化稀释液10ml，由漏斗处加入反应室内，再加40% NaOH溶液10ml。使蒸汽进入反应室，加热蒸馏，直至三角瓶内硼酸溶液增加

1倍体积，移开三角瓶，停止加热。将空白对照的消化液做同样处理。

1.2.1.3 滴定

用0.05 mol/l盐酸标准溶液滴定，到接收液由绿色变为灰红色即是终点。同样滴定空白实验的接收液。

1.2.1.4 计算

式中：CB——含氮量；

NHCl——滴定所用盐酸的浓度；

V1——试样滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；

V2——空白滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；

m——试样的质量（g）。

1.2.2 消化液测定法

1.2.2.1 胃蛋白酶最适量的选择

分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，各加入含不同胃蛋白酶活性单位（100IU、160IU、200IU）的pH值为1.4的0.05mol/l HCl-KCl缓冲液30ml，在40℃台式恒温摇床上保温3h后过滤，多次冲洗残留物，用凯氏定氮法测定残留物的蛋白质含量。计算饲料蛋白质消化率，确定出胃蛋白酶的最适用量为160 IU（表1）。

1.2.2.2 胰蛋白酶最适用量的选择

分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，用含有胃蛋白酶浓度为0.05mol/l的HCl-KCl缓冲液做前处理，之后加0.2mol/l的氢氧化钠溶液处理消化液使之pH值等于6.8。再分别加入含不同胰蛋白酶活性（100IU、150IU、200IU）的0.05mol/l的KH2PO4-NaOH缓冲液。继续培养3h，测定饲料的蛋白质消化率，确定出胰蛋白酶的最适用量为150IU（表2

1.2.2.3 离体消化程序

①胃蛋白酶处理

a.称取0.5g饲料样品2份，分别置于250 ml带盖三角瓶中（每个样品测2个平行样）。

b.准确称取1.777g胃蛋白酶（准确到0.001g），置于体积100ml、pH值1.4的HCl-KCl 缓冲液中。

c.用移液管移取30ml上述混合液置于三角瓶中。

d.将三角瓶置于（40±0.1）℃台式恒温摇床中，以其温度达到40℃时开始计时，震荡

3h，频率为80次/min。

②胰蛋白酶处理

a.准确称取4mg胰蛋白酶（准确到0.001g），置于体积1 000ml、pH值6.8的KH2PO4-NaOH 缓冲液中，放入冰箱中备用（温度为4～6℃）。

b.从摇床中按顺序取下三角瓶，用0.2mol/ml NaOH溶液滴定消化液，使其pH值6.8，各量取15ml KH2PO4-NaOH缓冲液置于三角瓶中，然后再分别用移液管吸取15ml

KH2PO4-NaOH-胰蛋白酶混合液置于另一个三角瓶中。

c.继续在（40±0.1）℃下震荡培养3h。

d.用320目尼龙滤布和抽滤装置过滤消化液，并用温水反复冲洗培养用的三角瓶（3～4次），将洗液加入消化液中过滤，用洗瓶多次冲洗滤渣。

e.将滤渣放入65℃恒温烘箱中烘干1h。

f.用凯氏定氮法测定滤渣的含氮量，计算消化率。

③空白试验

按上述各步骤进行，但不加入样品，测定胃蛋白酶-胰蛋白酶复合处理空白试验的含氮量。

1.2.2.4 体外消化率计算方法

粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量

1.2.3 消化酶提取法

1.2.3.1 粗酶液的提取

按照常规方法解剖取出鱼的肠道和肝胰脏，去除脂肪和肠道内容物后，用0.2M、pH值7.4的磷酸缓冲液按W/V为1：20稀释，并用玻璃匀浆器匀浆后，在3 500r/min下离心20min，取上清液作为粗酶提取液，冷冻保存于冰箱中备用。

1.2.3.2 离体消化率的测定

准确称量过80目的样品各0.400g，放入100ml带塞三角瓶中，加0.02M、pH值7.4的磷酸缓冲液40ml，粗酶液10ml，加入双抗（青霉素150IU/ml、硫酸链霉素150IU/ml）。每隔

4h加双抗一次，置于（28±1）℃的恒温生化培养箱中，在以50次/min震荡的摇床上进行离体消化12h。每个样品分别作2个平行样。

1.2.3.3 离体消化率的计算

鱼类消化道的粗酶液离体消化12h后终止反应，用定量滤纸过滤，并用温水冲洗3～4次，取滤渣（含滤纸）在105℃下烘干至恒重并准确称重。凯氏定氮法测定饲料原料及其消化后相应滤渣的粗蛋白含量。

粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量

2 结果

2.1 饲料的粗蛋白含量

试验所用的饲料原料采用凯氏定氮法测得其粗蛋白含量（见表3）。

2.2 饲料粗蛋白的体外消化率

消化液测定法（即胃蛋白酶-胰酶两步消化法）、消化液提取法（提取鲈鱼和草鱼两种消化液）测得的蛋白质饲料消化率见表4。

3 分析与讨论

3.1 蛋白质饲料原料

由表4可知，两步法中酪蛋白的消化率最高，为96.9%；其次为棉籽粕和豆粕，其消化率分别为90.2%、89.9%；玉米蛋白粉、鱼粉的消化率分别为83.4%和80.7%；酵母粉、菜籽粕的蛋白质消化率均低于80%。试验测得的常用蛋白质消化率，与其他学者报道的有关体外消化率结果十分接近。酪蛋白、豆粕的消化率略低于pH值恒定法和体外消化法的测定值[4，5]。从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率来看，酪蛋白最高为86.2%，其次为鱼粉83.8%；在植物蛋白饲料中豆粕较高，接近于鱼粉的消化率，为81.8%，而菜籽粕和棉籽粕的消化率较低，均小于50%；酵母粉和玉米蛋白粉的消化率最低，分别只有38.4%、36.3%。草鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率数据显示，酪蛋白仍然是最高的，为90.4%；其次为豆粕、菜籽粕和鱼粉，分别为87.5%、 86.2%、 84.0%；玉米蛋白粉和棉籽粕的消化率为77.1%和75.2%；酵母粉的消化率最低，只有68.5%。值得注意的是，豆粕、菜籽粕的消化率均高于鱼粉，这主要是由其草食性鱼类的特点决定的，本试验与罗莉等（1997）测定的结果相一致[6]。饲料及其蛋白质在鱼体消化道中被消化的程度取决于消化酶（消化蛋白质的主要是蛋白酶）的作用时间，消化速度受消化酶的浓度、温度、底物和作用时间的影响[11]。由鲈鱼消化酶的试验结果可知，其对鱼粉具有很好的消化效果，而在3种植物蛋白饲料中，对豆粕的消化效果最好，其次为菜籽粕，对棉籽粕的消化效果最差。这与原料的种类和性质有关。

3.2 体外消化率测定方法

不同的消化方法测定的粗蛋白消化率存在显著差异（P<0.05）。用两步法测得的消化率普遍高于消化液提取法，前者的消化率在75.4%～96.9%之间变化，而后者用两种消化液测得的

消化率分别为36.3%～86.2%（鲈鱼消化液）和68.5%～90.4%（草鱼消化液）。在同一消化方法中，饲料的消化率之间也存在着显著差异（P<0.05）。酪蛋白、鱼粉、豆粕粗蛋白的消化率较高，均大于80%。两步法中粗蛋白消化率的变化辐度为21.5%，鲈鱼和草鱼消化率的变化辐度为49.9%和21.9%。对鲈鱼而言，植物蛋白饲料的消化率要远远小于动物蛋白饲料，这主要是由其肉食性的特点决定的。相反地，两步法和草鱼消化液的数据则比较接近。两步法消化体系得到的消化率值高于使用消化液的消化体系。目前体外消化率测定尚无统一方法，各种消化法中选用的酶的种类及酶活力都存在不同，消化条件（温度、pH值、消化时间）、消化产物的分解以及测定方法也不同，这些因素可能影响消化率的测定结果。本试验中的一些蛋白质消化率高于动物体内测得的结果，相应饲料的消化率高于印遇龙测得的猪回肠末端蛋白质表观消化率。体外消化率是以消化后所有可溶性氮作为可消化的蛋白质来计算的[7]，而表观消化率是以回肠末端食糜中所有氮作为不可消化蛋白质计算得出的，但并非回肠末端的食糜氮都是不可消化的饲料蛋白质[8]，两种消化方法涉及到内源氮的差别，这可能导致本试验测定值略高于印遇龙[7]的结果。Boisen研究认为，对体外消化率进行内源氮校正后，可以准确地预测回肠末端蛋白质表观消化率[2]，若对不同类别的饲料再考虑到灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维等成分，预测结果将会更准确[9]。目前，许多研究表明，两步消化法测得的蛋白质消化率与动物体内消化法测得的蛋白质真消化率高度相关

[8-10]。胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法可用于蛋白质的测定，测定值不受内源氮的影响。从草鱼消化酶的试验数据可知，作为草食性鱼类，其对豆粕、菜籽粕的消化率要高于对鱼粉的消化率，这主要是由鱼体消化道和消化酶的特性所决定的。因此，在配制草食性鱼类的人工养殖饲料中，可以适当地减少鱼粉的用量，增加豆粕等植物蛋白质饲料的用量，不仅节省成本，也符合草食性鱼类的消化规律。肉食性鲈鱼对豆粕有很好的消化作用，从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的体外消化率来看，豆粕的结果与鱼粉的结果较接近。因此，在配制肉食性鱼类的人工养殖饲料中，可以适当地增加豆粕的用量，而尽量减少鱼粉等动物蛋白质原料的用量，既有利于降低饲料成本，又能有效改善鱼体的品质、降低饲料物质对水域环境的污染（鱼粉的总磷很高、但利用率很低）。

4 结论

胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。

参考文献

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11 向枭，叶元土，周兴华，等.铜鱼肠道、肝胰脏对四种蛋白质饲料的离体消化率测定.饲料工业, 2003，24(1): 50～51

黄芪多糖对蛋鸡生产性能和饲料表观消化率的影响

黄芪多糖对蛋鸡生产性能和饲料表观消化率的影响杨秋霞，王洪芳，陈辉，王翠菊，高杨，吴鹏威，郭小虎，葛帅，黄仁录(1．河北农业大学动物科技学院，河北保定071001；2沧州职业技术学院，河北，沧州061001) 摘要：试验选取生产性能相近的380日龄海兰灰蛋鸡1440只，随机分为6组，每组4个重复，每个重复60只。以玉米-豆粕型日粮为基础日粮，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ组为试验组，分别在基础日粮中添加50mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg和250 mg/kg的黄芪多糖，研究黄芪多糖对蛋鸡生产性能和饲料表观消化率的影响，试验期8周。试验结果表明：(1)料蛋比，试验I组与试验Ⅳ 组相比差异极显著(P<0.01)，与试验II组相比差异显著(P<0.05)，试验II、Ⅳ、V组分别与试验Ⅵ组差异显著(P<0.05)；(2)每只鸡每天平均耗料，试验III、Ⅳ、V组极显著低于对照组(P<0.01)。试验II、Ⅵ组显著低于对照组(P<0.05)；(3)日粮中添加黄芪多糖对钙的表现消化率有显著性影响，试验V组钙表观消化率显著高于试验Ⅵ组(P<0.05)。综合评定认为100-200mg/kg为适宜添加量。 关键词：黄芪多糖；生产性能；表现消化率 The effect of Astragalus polysaccharides on the performance and Apparent digestibility of feed of laying hens Y ang Qiuxia, WangHongfang ,Chen Hui, Wang Cuiju, GaoY an, Wu Pengwei ,Guo Xiaohu, Ge Shuai，Huang Renlu Abstract：At the age of 380 days，1440 Hy-line were randomly divided into 6 groups，with 4 replications per group and 60 hens per replication．The control group fed with basal diets，the testing group fed with basal diets adding 50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg，200mg/kg，250mg/kg Astragalus Polysaccharide(APS) respectively. The experiment lasted 8 weeks. The main results were showed as follows:(1)The diets added with APS affect the rate of feed and with I Was egg，the experimental group IV compared group significantly different(P<0.01).The experimental group II compared with group 1 was significantly different(P<0.05). Compared with groups VI，Group II，IV，and V were significantly different，respectively(P<0.05).(2)The diets added with APS，the average daily feed consumption of group III,IV,V were significantly lower than the control group(P<0.01)，group II and groupⅥ were significantly lower than the control group(P<0.05).(3)The APS in diets significantly affected apparent digestibility of calcium, apparent digestibility of calcium of group V was significantly higher than group VI (P<0.05)．The appropriate amount is comprehensively assessed at 100-200mg/kg． Keywords：APS；production performance；apparent digestibility 黄芪的主要化学成分有多糖类、皂甙类、黄酮类物质及22种氨基酸和14种微量元素等营养物质。黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)是黄芪中含量最多、免疫活性较强的

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法

12-消化率和利用率

12 消化率和利用率 “消化率”或“利用率”是指食物中某一种或某一类营养素（如粗蛋白）在通过消化道时消失的量或比例，或者随废物排出的量或比例。因此，消化率首先是用来度量营养素消失的。被消化的营养素通常认为被机体生长和代谢所用，虽然事实常常并非如此。消化率还用来描述营养素的消化过程，比如蛋白质在被吸收之前先被水解成氨基酸。而营养素（比如氨基酸）的生物利用率则被定义为从某一特定原料中摄取的营养素可用于动物机体代谢的部分（Batterham, 1992; Ammerman et al., 1995; Lewis and Bayley, 1995）。营养素的生物利用率可以通过一系列方法学手段来评估。生物利用率可以揭示营养素的代谢利用，其具体内容将不在本章节详细讨论。 当食物被机体摄入后，在消化道中，食物混合物经过消化道的蠕动等物理作用被混合成更细小均一的食糜，并在此过程中以自由扩散、协助扩散和主动运输等方式被机体吸收。没有被吸收的部分则作为废物排出体外。所以在计算消化率时需要测量粪便中的营养素或能量的含量。以可消化能为例，可消化能事实上衡量了摄入的总能与粪便中总能的差异。关于完整的能量流向，将在第四章中详细叙述。 营养素被吸收后会在体内进行代谢，营养素中的能量会以含氮物质（如NH3+和尿素）的形式通过尿和鳃排泄掉。当这些物质中的能量被测定出来并从可消化能中减去，剩下的值便叫做代谢能（ME）。在前几版的《鱼虾营养需求》中，可消化能和代谢能的值都给了出来，但是在本版本中，只给出了可消化能值，这主要考虑到代谢能测量的难度及测定方法对其准确性的影响。还有，一般现在科研和商业饲料配方中大多也只给出可消化能值。 消化率测定方法 测定食物或饲料的消化率首先需要收集粪便。收集粪便的方法有直接法和间接法。不论直接法还是间接法都可以将被测物质单独投喂，也可以将被测物质加到饲料中作为饲料的一部分一起投喂，一般后者比较常用。在鱼类中使用直接法时，用一定量的饲料投喂实验鱼，然后收集所有的粪便。但是，收集水生动物的所有粪便难度较大，因为在水环境中很难将所有的粪便跟未吃完的饲料颗粒区分开，而且在水生环境中，粪便与通过尿和鳃排出的排泄物也混合在一起。Smith（1971, 1976）曾发明了一套限制饲喂系统来改进此方法。直接法最大的优点是粪便中所有的营养素和饲料组分都被

鸡饲料养分消化率的测定 (1)

鸡饲料养分消化率的测定 18动科3班第三组 组员：满建军、陈昭瑾、何延扬、刘敏敏、朱莉莉、陈静茹 摘要：饲料营养价值是指饲料本身所含营养成分及这些营养成分被动物利用后所产生的营养效果。评定饲料营养价值也就必须依据饲料中营养物质的含量和饲料中营养物质在动物体内的营养效果。本实验经过三日预饲期和三日正式测定期，严格记录鸡的采食量和排粪量并在实验室测定了饲料蛋白含量和鸡粪中蛋白含量，计算得到鸡的表观消化率和饲料中蛋白质的消化率，以此定量评价饲料的营养价值。 关键词：消化试验蛋白质消化率鸡 一.实验原理 动物食入的某养分减去粪便中排除的养分即可称为消化养分。计算某养分的消化率是指饲料中某养分的可消化养分占饲料中该养分总量的百分率。 二.实验仪器 普通天平（载量500g，感量0.01g）、分析天平（感量0.0001g）、台秤（5kg，感量0.1g）、烘箱、铝制饭盒、镊子、凯式定氮仪、研钵、刮刀、样品袋 三.实验药品 10%硫酸、2%硼酸、4%氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾 三.实验方法步骤 1.鸡的选择与饲养管理 试验用鸡必须健康、营养状况良好，品种、年龄、性别一致，体重相近，并已按免疫程序进行了正常的免疫接种。 鸡舍应符合卫生防疫要求，鸡舍温度在15℃~27℃，除喂料与清扫粪便依据试验设计的要求照办，其余管理措施应按常规操作规程进行，每日给予试验鸡充足清洁的饮水任其自由饮水。 2.饲料的准备 用于测试的饲料要一次备齐，放在干燥干净的地方。 3.测试程序 ○1预饲期 目的：让试验鸡适应试验饲料、规程和环境，排空消化道原有的内容物，掌握动物的排粪规律，了解采食量。 预饲期为三天，在预饲期间严格按照正式期的喂料时间进行。将选好的试验鸡饲养在代谢试验笼内，饲喂准备好的测定饲料，由于鸡的消化道较短，食入的饲料残渣在24h内即可排净，且鸡适应新饲料约需要48h。此外，在预饲期间，要摸清试验鸡采食和排粪尿规律，确定每日排泄物收集分界点与每次饲喂量，在

消化实验方法总结

《豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究》 采用胃蛋白酶-胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎力度。 平均粒径采用GB 6971-86 方法，体外试验采用Boisen和Fernandez等体外模拟消化方法。胃蛋白酶最适浓度的选择 1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸缓冲液（pH=6.0 0.01M）+10ml盐酸（0.2M）→温和搅拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鲜胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌剂（青霉素+链霉素）→39℃恒温水浴中震荡6h,消化后+20%黄基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤→干燥后残渣凯式定氮法测蛋白质含量→计算蛋白质和干物质消化率。确定最适胃蛋白酶浓度为75mg/ml. 胰酶最适浓度选择 在最适（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的产物中加入10ml磷酸缓冲液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氢钾缓冲液配制）pH=6.8→39℃恒温水浴中震荡18h→消化后+20%磺基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤，干燥后残渣按照凯式定氮法测其蛋白质含量，计算粗蛋白和干物质消化率，确定最适胰酶浓度为110mg/ml。 胃蛋白酶一胰酶两步法测定过程[1] 分别称取原样和过筛豆粕于三角瓶中，4个重复，使用最适浓度测定不同粒度豆粕蛋白和干物质含量，并通过氨基酸自动分析仪测其氨基酸含量，计算粗蛋白、干物质和氨基酸消化率。 《燕麦粉添加量对面包营养组分含量和淀粉体外消化性的影响》 淀粉体外水解动力学测定 1g样品+50ml磷酸缓冲液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min 后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴继续消化→每隔15min 分别取消化液0.2ml于25ml试管中+0.8ml蒸馏水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸馏水，摇匀→空白管调零，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。 采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液绘制标准曲表2 ，根据还原糖释放量的变化比较淀粉的体外消化性。 《苦荞芽粉馒头品质及体外模拟消化研究》 甲醇提取液的制备 参照Bojana(2011)提取样品的方法并稍作修改。准确称取5g待提取的苦荞馒头样品浸没于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均质机搅拌使样品破碎均质。样品液超声波提取15min，将悬浮液转移至离心管中。原样品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重复一次，合并提取液。2500r/min离心，取上清液于45℃水浴下蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，备用。

6种方法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材

蛋白质的测定方法比较

蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤： ①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

蛋白含量测定及western步骤

蛋白的提取和定量 肺组织用预冷1×TBS洗净后，加入含PMSF的RIPA buffer（冰上操作，310ul,决定未来的蛋白浓度和蛋白液体积）,50-60mg肺组织砸碎放入1.5ml离心管，冰上孵育1h，10000转4℃离心10min，转上清至新管。裂解液分装后保存于-70℃ 蛋白质定量：BCA蛋白测定法 ①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 ②完全溶解蛋白标准品(BCA试剂盒中，BSA原浓度2mg/mL),稀释到1mg/mL。 ③将标准品按0，2，5，10，15，20，25 ul标准品孔中，加蒸馏水稀释标准品的 ④加样品2uL加到96孔板的样品孔中，加蒸馏水23微升。 ⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。同时打开酶标仪预热。 注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。 ⑥测定A570的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。 ⑦计算调蛋白时所需TBS和RSB的体积（调所有样品浓度至3-5ug/ul）： 总体积=蛋白体积*蛋白浓度/3（ul） RSB=1/5*总体积（ul） TBS=总体积-RSB-蛋白体积（ul） 先加RSB（对蛋白有保护作用），后加TBS。最后放于-70℃保存。 Western Blot SDS-PAGE 1. 玻璃板：注意对齐、夹紧，防止漏出，短板朝前。 灌至距绿线1cm左右，用dd水封顶，放置30－40min。状况好时往往能观察到

蛋白质含量测定方法比较

蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋

白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），Folin —酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃），通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间 【关键词】：凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较

几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较 摘要：试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P>0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P>0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P<0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P>0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可替代鱼类消化液粗酶消化法，对其它蛋白质原料使用该方法应慎重。 关键词：蛋白质饲料；体外消化率；测定方法 消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 饲料原料 酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。 1.1.2 主要试剂 硫酸（GB 625—77）、硫酸铜（GB 665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。 硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。 混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。 标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。

蛋白含量测定方法

四种紫外吸收法: 1. 280nm的光吸收法 用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。 标准曲线的测定： 取6支试管，按下表编号并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用蒸馏水补体积至5.0 mL；测定A280 ：用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横坐标作图，标准曲线应为直线。 利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 2. 280 nm和260 nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260 nm 处的吸收更强，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍；而蛋白质则相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ＝1.8 纯核酸的光吸收比值：A280/A260＝0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280 －0.74×A260 (mg/mL) 3. 215 nm与225 nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收测定时，可用215nm与225 nm 吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白质溶液，分别测定215 nm和225 nm的吸光度值，并计算出吸收差: 吸收差D= A215 －A225 以吸收差D为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

利用DAISYII体外模拟培养法测定真消化率

利用DAISY II 体外模拟培养法测定真消化率 A. 试剂 a) 缓冲溶液A：g/L KH2PO4 10.0 MgSO4?7H2O 0.5 NaCl 0.5 CaCl2?2H2O 0.1 尿素(试剂级) 0.5 b) 缓冲溶液B：g/L Na2CO3 15.0 Na2S?9H2O 1.0 c) 瘤胃液接种物。 d) 30 g/L十二烷基硫酸钠（中性洗涤剂）溶液。 称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA,化学纯)和6.81g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)同放入1 000 mL烧杯中,加少量水加热溶解后,再加入30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚。称取4.65 g无水磷酸氢二钠，置于另一烧杯中， 加少量水，微微加热溶解后倾于第一个烧杯中，稀释至1 000 mL。此溶液pＨ在6.9~7.0左右（一般不需调整）。 (c) 无水亚硫酸钠（Na2SO3）。 (d) 丙酮：无色，并且蒸发后无残渣。 B.设备 a) DAISYII 体外模拟培养箱 b) 过滤装置- ANKOM F57滤袋 c) 封口机 d) 量筒– 1 L & 500 mL e) 热水瓶–2个 f) 过滤用奶酪布 g) ANKOM 220 纤维素分析仪

C. 步骤 a) 滤袋和样品准备 1)将F57 滤袋在丙酮中浸泡3-5 min，然后放在通风橱中自然干燥。用丙酮浸泡的目的是除掉表面剂，否则会影响微生物消化。对每个F57 滤袋称重，记录质量(m1)。将天平归零，并向滤袋中直接称取0.25 g 样品 (m) 注：进行48 h消化研究时，样品量也可以为0.5 g。然而，最近研究表明样品量为0.25 g 时测定结果更准确。 2) 将每个滤袋封口，并防入Daisy II体外模拟培养箱消化罐中(每个罐中最多可以放25 样品)。样品应平衡分布在消化罐分隔的两边。同时至少包括一个空白滤袋，用于确定测定结果校正因子(C1)。 b) 混合缓冲溶液准备(每个消化罐) 1) 将缓冲溶液A和B进行预热(39°C)。在容器中先加缓冲溶液A1330 ml，然后向其中加266 ml缓冲溶液B（比例为1:5)。缓冲溶液A和B的用量要准确，以确保39°C混合溶液的pH 为6.8。向每个装有样品滤袋的消化罐中加1600 ml 混合缓冲溶液。 2) 将装有样品和缓冲溶液的消化罐放入Daisy II 体外模拟培养箱，打开加热和搅拌(红色开关为电源)。让消化罐温度平衡至少20-30 min。同时收集准备瘤胃接种物。 c) 接种物准备与培养 所有的玻璃器皿要保持在 39°C。 1) 向2个热水瓶中加入39° C 水对其进行预热。在收集瘤胃液前将热水倒掉。采用适宜的 采集步骤，取至少2000 ml 瘤胃液，放入热水瓶中。 2) 将瘤胃液从热水瓶中倒出，放到混合器中。向混合器的容器中冲入CO2 气体并快速混合30。混合的目的是防止微生物黏附，确保用于体外消化微生物代表性。将混合好的瘤胃液用4层奶酪布过滤到5升容量瓶中(预热39° C)。 用四层新的奶酪布过滤将其他热水瓶中的瘤胃液过滤到同一个5升容量瓶中。容量瓶要持续充CO2。 3) 用量筒量取400 ml 瘤胃培养物。从Daisy II 体外模拟培养箱中取出一个消化罐，向缓冲溶液和样品中加入量取好的400ml 培养物。然后向消化罐中充CO2 气体30秒，然后盖好盖子。 4) 所有用到的消化罐都按照上述步骤重复操作。注意：不要让CO2气体通过缓冲后的