菌种诱变方法
微生物诱变育种的方法
摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。
关键词:诱变; 微生物育种
微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。
1 物理诱变
1.1紫外照射
紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。
马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克
鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。
紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。
1.2电离辐射
γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使
水或有机分子产生自由基，这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化，导致DNA分缺失和损伤[2]。
张伟[5]等将较高产酒精酵母制备成原生质体，经Co60诱变后，采用四级筛选，得到高产酒精酵母菌株Co-158，其遗传性状稳定，其成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高了16.34%，比ADY提高了24.48%，残还原糖含量亦远远低于出发菌株和ADY。
除γ-射线外的电离辐射还有X-射线、β-射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性，操作要求较高，且有一定的危险性，通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。
1.3 离子注入
离子注入是20世纪80年代初兴起的一项高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986年以来逐渐用于农作物育种，近年来在微生物育种中逐渐引入该技术[6]。
离子注入时，生物分子吸收能量，并且引起复杂的物理和化学上的变化，这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由基，可以引起其它正常生物分子的损伤，可使细胞中的染色体突变，DNA 链断裂，也可使质粒DNA造成断裂[7,8,9]。由于离子注入射程具有可控性，随着微束技术和精确定位技术的发展，定位诱变将成为可能[7]。
向砥[10]等用10keVN+诱变产壮观霉素菌株Streptomycesspectabilisb，使产量提高102.3%。于广成等用10keVN+诱变产灰黄霉素菌株Penicellliunpatulum，使产量提高26.8%[11]。除此之外，糖化酶生产菌、不饱和脂肪酸生产菌、维生素生产菌的离子束诱变效果也得到充分肯定。这些表明，离子辐照处理是一种极有潜力的微生物药物的诱变育种新方法[12]。离子注入法进行微生物诱变育种，一般实验室条件难以达到，目前应用相对较少。
1.4 激光
激光是一种光量子流，又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用，直接或间接地影响有机体，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发
生变异。不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[13]。
胡卫红等[13]采用CO2激光辐照酿酒酵母(Saccharomycescereisiae)AS2.1189，筛选到乙醇产量有较大提高的变异株。鲍淑兰[14]以啤酒酵母(Saccharomycescer- evesea)为材料，用He- Ne 激光进行照射，发现随着照射时间的延长，致死率和突变率均明显增加，同时在选择培养基上筛选出多种氨基酸突变型。
激光作为一种育种方法，具有操作简单、使用安全等优点，近年来应用于微生物育种中取得不少进展。
1.5 微波
微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在
300MHz~300GHz，对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应[15,16]。因而，微波也被用于多个领域的诱变育种，如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等[17]和雷肇祖等[18]有所报道。
1.6 航天育种
航天育种，也称空间诱变育种，是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间，利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异，再返回地面进行选育，培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力，空间辐射，以及其它诱变因素如交变磁场，超真空环境等，这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤，使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。
我国在这方面取得不少进展，自1987年以来先后9次利用返回式卫星，4次利用高空气球搭载了70多种植物，500多个品种的40多公斤种子，涉及到粮食、棉花、油料、蔬菜、瓜果、花卉等作物，经国内20多个省、市、区的50多个研究单位育种工作者的地面种植试验，育成了高产、稳产、优质、多抗的青椒、番茄、水稻、小麦、莲子等作物新品种、新品系，从中还获得了一些有可能对产量和品质等经济性状有突破影响的罕见突变[19]。
航天育种较其它育种方法特殊，是航天技术与微生物育种技术的有机结合，技术含量高，成本高，个体研究者或一般研究单位都难以实现，只能与航天技术相结合，由国家来完成。
2 化学诱变
与物理诱变相比，化学诱变在某种程度上应用更为广泛，是指利用一些化学物质提高生物的自然突变率，这些化学物质就叫做化学诱变剂。化学诱变可操作性强，简单易行;特异性较强，能诱变定位到DNA上的某些碱基;后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定;应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。
化学诱变剂主要包括4类，他们的特点、机理和应用如下:
2.1 烷化剂
烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应，引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异，常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。
甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulphonate，EMS)是最常用的烷化剂，诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，首先是鸟嘌呤的O6位置被烷基化，在DNA 的复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基的替换，即G:C 变为A:T[20]。常用浓度为0.05~0.5mol/L，作用时间5~60min。该物质具有强烈致癌性和挥发性，可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。
N-甲基- N'-硝基- N-亚硝基胍( NTG)是一种超诱变剂，应用广泛，但有一定毒性，操作时应该注意。在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2)，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的[2]。周希贵等[21]用NTG对多粘类芽胞杆菌AS1.541 进行诱变，获得一株粘杆菌素发酵单位比出发菌株提高105%的菌株。
硫酸二乙酯( DMS) 也很常用，但由于毒性太强，目前很少使用。乙烯亚胺，生产的较少，很难买到。使用浓度0.0001%~0.1%，高度致癌性，使用时需要使用缓冲液配置。
2.2 碱基类似物
碱基类似物分子结构类似天然碱基，可以掺入到DNA分子中导致DNA复制时产生错配，mRNA转录紊乱，功能蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较
小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶( 5- FU)、5- 溴尿嘧啶( 5- BU)、6- 氯嘌呤等。程世清等[22]用5- BU 对产色素菌(分枝杆菌T17- 2- 39) 细胞进行诱变，生物量平均提高22.5%。
2.3 无机化合物
诱变效果一般，危险性较小。常用的有氯化锂，白色结晶，使用时配成
0.1%~0.5%的溶液，或者可以直接加到诱变固体培养基中，作用时间为30min～2d。
亚硝酸易分解，所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取，将亚硝酸钠配成0.01~0.1mol/L的浓度，使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。
2.4 其他
盐酸羟胺，一种还原剂，作用于C上，使G- C变为A- T。也较常用，使用浓度为0.1%～0.5%，作用时间60min～2h。此外，诱变时将两种或多种诱变因子复合使用，或者重复使用同一种诱变因子，效果更佳。顾正华等[23]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株，经DMS和NTG多次诱变处理，获得一株L-组氨酸产生菌。
常翠贤[24]等以产纤溶酶的根霉Y为出发菌株，通过亚硝基胍、紫外复合诱变，得到一株高产突变株C6，其产酶活性是出发菌株的4.73倍。杜娟[25]等以一株具有较高纤维素酶活性的野生菌株-灰绿曲霉XC9为出发菌株，经氯化锂、紫外、甲基磺酸乙酯等多重诱变处理，获得了抗葡萄糖阻遏的突变株，其CMC 酶活与出发菌株相比提高了2倍左右。
3 结束语
随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，许多新型复杂的技术被应用于菌种选育，如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等，但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。
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菌种活化保存法
附件： 新菌株（乳酸菌）斜面培养法 1.购买新菌株（安瓿瓶装冻干粉） 2.菌种管开启方法一：按购买菌种上的说明进行操作即可。 3.菌种管开启方法二（本次实验方法均在水平层流台进行）： 3.1水平层流台开启风机跟紫外灯，半个小时 3.2 用浸过75 ％酒精的脱脂棉擦净菌种管。 3.3将菌种管顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度。 3.4 将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂。 3.5 用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端。 4.用玻璃三角瓶121.0℃灭菌约10-30ml的生理盐水20分钟 5.将开封后的冻干粉倒入生理盐水中，摇匀 6.用接种环沾取生理盐水，转接与MRS培养基平板上，在36.5℃中恒温培养48-72小时 后，得到二代菌。 7.此时可以使用二代菌进行菌株扩大培养，或对其进行保存菌种。 注意事项： 1 菌种活化前，请将冻干菌种管冷藏保存在5 ℃-10 ℃环境下。 3 菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。 4 菌种活化及使用过程应做好安全防护工作。 第二代第2 代)观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一的纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态,并进一步做生化鉴定实验以确定菌种。第三代为工作用菌。 乳酸菌菌种保存法 方法一：斜面保存法（略） 方法二：20%甘油保存法 器材：冻存盒、冻存管(2ml装)、甘油（丙三醇）、MRS肉汤培养基、1ml移液器及枪头、酒精灯、水平层流台、高压灭菌锅 操作步骤： 1.在水平层流台中用接种环挑取所需保存的的菌株放于灭菌过的MRS肉汤培养液，进行 36.5℃恒温培养48小时 2.配制40%的甘油，用移液器移取0.5ml于冻存管中，放于冻存盒 3.用报纸将冻存盒包扎好，放于灭菌锅中灭菌（121.0℃、20Min） 4.在水平层流台中，用移液器移取0.5ml培养后的MRS肉汤培养液加入到冻存管中，拧 紧盖子，摇匀，标识。 5.在冻存盒外也做好操作人，日期，所保存的菌种等信息标记 6.将冻存盒放于保鲜袋中，放入冰箱的冷冻室层进行保存，一般可以保存至两三年。 7.若是需用，那一冻存管样进行培养即可。 实验室菌种激活方法
微生物的诱变育种
微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
菌种鉴定手段
菌种鉴定手段 （1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 （3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。（4）API细菌数值鉴定系统
API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 （5）功能性分析及功能基因 CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究，目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术 随着微生物菌种应用的进一步发展，在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加，微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。 CICC采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技
菌种活化_操作方法
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml 无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L 型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。 8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。
菌种活化-操作方法
菌种活化-操作方法-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
低温保存管（cryotube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryotube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环 （2）平板划线法
2018-大肠杆菌菌种活化步骤-推荐word版 (6页)
本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 大肠杆菌菌种活化步骤 篇一：抑菌实验步骤 抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌 菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布， 划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸 取进行划线！ 涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂 布法 1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h) 2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养） 3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h） 培养基 MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋 白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸 溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。 牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。 牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。 菌悬液的配制
将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养 箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于 5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10- 10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品 溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度， 使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。 抑菌作用初步筛选 将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培 养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液， 均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对 照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作 台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。 抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数 实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。 菌种活化：37℃培养；约24H 挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养 8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。 生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min 即可。 篇二：大肠杆菌电击转化流程 大肠杆菌感受态制备及电转化流程 1. 细菌电转化感受态细胞的制备 准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个 1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接 种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转 速控制在200rpm； 2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培 养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；
菌种保藏大全
菌种保藏 一、菌种的含义： 菌种：菌种是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝及其生长基质组成的繁殖材料。分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级，也可以理解为保存着的、具有活性的菌株。 微生物工业对菌种的要求 1.原料廉价，生长迅速、目标产物高。 2.易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.菌种遗传性能稳定，不易变化和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 5.对放大设备的适应强。 二、菌种保藏的重要意义： 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，都离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来，而不致向坏的方面转化。 菌种是一种极其重要和珍贵的生物资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。 菌种保藏的原理与方法 微生物菌种保藏的概念：收集实验室和生产用微生物（菌种、菌株、病毒毒株等，也包括动、植物的细胞株和微生物质粒），运用适当方法和措施使其长期存活并保持原种的生物学性状稳定不变，使之不死、不衰、不乱，以达到便于研究、交换和使用等目的的措施。 微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，很容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至死亡。因此根据实际情况选择合适的保藏方法十分重要。 一、菌种保藏的原理： 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创条件使其生长代谢处于最低或几乎停止的状态，以减少其变异和保持生物性状。 保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。 一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。 国内外主要菌种保藏机构介绍 国外 （1）ATCC 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市. （2）CSH 冷泉港研究室，美国. （3）IFO 日本大阪发酵研究所，日本大阪. （4）NRRL 美国北部地区研究实验会
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
菌种保存方法
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
微生物学复习资料整理汇总
一、解释下列名词 1．伴胞晶体：少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁边形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ内毒素,称为伴胞晶体（59） 2．菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，成为菌落。 3．选择培养基：用来将某种或某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，一直不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。（91） 4．革兰氏阳性菌：在革兰氏染色法里，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁厚度大和肽聚糖网层次多和交联致密，故遇乙醇或丙酮酸脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，在加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能吧结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。（49）革兰氏阳性菌细胞壁特点是厚度大、化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸，从而与层次多、厚度地、成分复杂的革兰氏阴性菌的细胞壁有明显的差别。革兰氏阴性菌因含有LPS外膜，故比革兰氏阳性菌更能抵抗毒物和抗生素对其毒害。（40） 5．LPS:脂多糖，位于革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一层较厚的类脂多糖类物质，由类脂、可信多糖和O-特异侧脸三部分组成。（43） 6．营养缺陷型：某些菌株发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株成为营养缺陷性（85）(218) 7．氨基酸异养型生物：不能合成某些必须的氨基酸，必须从外源提供这些氨基酸才能成长，动物和部分异养微生物为氨基酸异养型生物。如乳酸细菌需要谷氨酸、天门冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸和脯氨酸等外源氨基酸才能生长。（baidu) （氨基酸自养型：能以无机氮为唯一氮源，合成氨基酸，进而转化为蛋白质及其他含氮有机物。 8．芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或团圆性、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体（55） 9．鉴别培养基：用于鉴别微生物。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种带些产物，而这种带些产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可讲该种微生物与其他微生物区分开来（91） 10．PHB：聚-B-羟丁酸，直径为0.2~0.7um的小颗粒，是存在于许多细菌细胞质内属于类脂兴致的碳源类贮藏无。不溶于水，可溶于氯仿，可用尼罗蓝或苏丹黑染色。具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。（53） 11．糖被：包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。（60）
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
菌种保藏的主要方法
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法
菌种保存方法-
菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
微生物研究技术与方法 重点大全要点
第一章绪论 课程主要内容： 1、微生物学研究技术发展 2、微生物材料的准备 3、微生物研究中的物理化学方法基础 4、微生物的观察与微生物分析法 5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离 6、微生物育种技术 7、固相化技术与生物传感器 8、免疫学技术 9、微生物学研究的分子生物学技术 微生物学研究技术发展： 微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括： 1、显微镜术和制片染色技术 2、消毒灭菌技术和无菌操作技术 3、纯种分离和克隆化技术 4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术 5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术 6、菌种保藏技术 7、原生质体制备和融合技术 8、各种DNA重组技术等 第二章微生物材料的准备 第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作 掌握知识要点： 原理、方法、生物活性物质的除菌 无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存 一、几个基本概念 控制害菌的措施： 1）杀灭法： ○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物 ○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌 2）抑制法： ○1防腐：抑制霉腐微生物 ○2化疗：抑制宿主体内的病原菌 1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的 措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。 2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或 内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：
常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法 对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法 1）巴氏消毒法（pasteurization） 2）煮沸消毒法 采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。 3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。 防腐的方法： ①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、 生物制品或菌种等。 ②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食 等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。 除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。 ③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常 见的防止霉腐的方法； 在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。 ④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的 方法。 ⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜 蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。 ⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄 泥螺等产品，都是特色风味食品。 ⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂 或防霉剂来达到防霉腐的目的，如： 用苯甲酸来使酱油防腐； 用尼泊金作墨汁防腐剂； 用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂； 用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。 4、化疗——化学治疗 利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。 用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。 要点： 1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。 2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。 3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。
微生物一些大题汇总
第二章：名词解释 1、菌落：是指由单个或少数微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。 2、温和噬菌体：噬菌体侵入宿主细胞后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体上，并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制，一般情况下不进行增殖，不引起宿主细胞裂解的噬菌体，称温和噬菌体或溶源噬菌体。 3、L-型细菌：由于无细胞壁故细胞呈多种形态，革兰氏染色阴性，大小为0.05～50μm不等，相差悬殊，有的可以通过细菌滤器，故又称“滤过型菌” 4、菌丝体：菌丝在基质中或培养基上蔓延伸展，反复分枝网状成菌丝群，通称菌丝体。 5、病毒：病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA），必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。 6、芽孢：某些细菌（芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，少数球菌等）在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造，称为芽孢。 六、简答题。 1、简诉革兰氏染色的过程和机理 过程：革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难区别。经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。 染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。 2、细菌芽孢有何重要的实践性？ ．1、分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。 2．科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。 3．保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。 4．分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。 5．生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。蛋白质晶体的毒性是有高度专性的，对其他动物与植物完全没有毒性。因此，它们便成为一种理想的生物杀虫剂，这种杀虫剂的生产，并不需将蛋白质分离出来，只需培养大量细菌，在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥，做成粉剂即可。 3、简诉细菌细胞膜的结构和生理功能。 细胞膜又称质膜（plasmalemma），是位于原生质体外围、紧贴细胞壁的膜结构，作用是保护内部。组成质膜的主要物质是蛋白质和脂类，以及少量的多 糖、微量的核酸、金属离子和水。生理功能细胞膜有重要的生理功能，它既使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。细胞膜通过胞饮作用（pinocytosis）、吞噬作用（phagocytosis）或胞吐作用（exocytosis）吸收、消化和外排细胞膜外、内的物质。在细胞识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面，质膜也发挥重要作用。有些细胞间的信息交流并不是靠细胞膜上的受体来实现的，比如某些细胞分泌的甾醇类物质，这些物质可以作为信号，与其他细胞进行信息交流，但是这些物质并不是
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。