T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇全抗原的合成及鉴定
镰刀菌
几种罹病植物镰刀菌(Fusarium)种类鉴定 前言 镰刀菌无性时期在分类上原属于半知菌亚门，根据《菌物词典》2001年第9版现属于无性真菌类,有性时期为子囊菌门。镰刀菌因其在无性阶段产生的大型分生孢子形似镰刀而称之。镰刀菌属是在1809 年Link从锦葵科植物上发现第一株镰刀菌定名为粉红镰刀菌(Fusarium roseum Link)的基础上建立起来的[1]。镰刀菌种类多，迄今已发现44 种和7个变种[2]。它们分布极广，在地球上所能及的地方，几乎都能找到它的踪迹。镰刀菌历来是真菌学和植病学的主要研究对象之一。 镰刀菌对农业生产具有重要经济意义，其中的许多种是重要的植物病原菌，往往使农作物遭受重大病害，如麦类赤霉病、棉花枯萎病、水稻恶苗病、玉米青枯病、甘薯蔓割病、瓜类枯萎病等[4]，导致农业生产损失严重，甚至颗粒无收。人类栽培的各种作物如稻、麦、棉、麻、油、茶、果树和蔬菜等，均易受到镰刀菌的侵袭而发生各种病害[4 ~ 7]。许多重要的萎蔫病害曾在世界范围内造成许多毁灭性的植物病害。前苏联曾有报道，当种植的甘蓝为感病品种时，镰刀菌所引起的萎蔫病害可使产量降低50%-95%。在前苏联亚麻种植区亚麻萎蔫病发生也极为普遍，且有病的亚麻种子油是有毒的，会引起人畜中毒。花卉植物如紫苑、石竹等等也遭受萎蔫病的损害[8]，有时危害严重到需要停止栽培的地步。除上述病害外，镰刀菌也是根腐病和各种农作物及其他植物贮存期间腐烂病的重要病原，被污染的食品和饲料含有毒质，常使人类和家畜中毒[12]。此外，镰刀菌可引起动物病害，如镰刀菌产生的有毒代谢产物—镰刀菌毒素（Fusariotoxin）毒性很强，污染人类食品和禽畜的饲料，会造成雏鸡、鸭、鹅、鸽子、黄牛、水牛、猪、羊、马、驴等禽畜镰刀菌毒素中毒，是常见的病害。 镰刀菌作为病原微生物也能侵入人体，引起人类的真菌病。如茄病镰孢等镰刀菌可引致人足部溃疡、眼角膜溃疡和大骨节病等。镰刀菌产生的毒素物质可引起人和动物的急性或非急性中毒，甚至死亡。据报道串珠镰孢某些菌珠能产生腐马素，它与人类食管癌有关[6]。 同时，镰刀菌的可利用方面也是不容忽视的。在农业方面，一些镰刀菌在其生长发育过程中能分泌植物激素—赤霉素，可以促进植物的生长。许多镰刀菌是昆虫的病原真菌，还有一些镰刀菌可以寄生在真菌及线虫一类植物病原物上。近年来，人们利用弱致病性镰刀菌的交叉保护作用，来防治作物的镰刀菌病害。同时利用镰刀菌对寄生性植物杂草和其它病原微生物的寄生特性，应用于生物防治[12]。在工业生产上，镰刀菌可转化甾族化合物，又称类固醇，此类激素药物对机体起着非常重要的调节作用。因此在有机工业合成中应用镰刀菌发酵工艺使化工产品发生了工艺革新[11]。另外，利用禾谷镰孢（F.graminearum）生产真菌蛋白在英国已经注册，获准生产。 由此可见，镰刀菌是非常重要的真菌之一，而研究镰刀菌的各个方面都要以分类为 5
镰刀菌
镰刀菌在环境保护中的应用 作者 摘要：镰刀菌属于霉菌中的一种菌种，镰刀菌不仅在食品、医学、生物保护等领域中发挥着重要作用，更在环境保护中起着巨大的作用。特别是镰刀菌在生物脱除氮氧化物，生物降解酚类化合物、氰化物，吸收、蓄积、降解多环芳烃等方面的作用机理，指出了其在环境保护中的重要作用和巨大的应用前景。 关键词：镰刀菌；生物处理；环境保护 Abstract: Fusarium belonging to the mold of a species of Fusarium, not only in the food, medicine, biological protection plays an important role in environmental protection, it plays a great role. In particular the Fusarium in biological removal of nitrogen oxides,biodegradation of phenolic compounds, cyanides, absorption, accumulation, and degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and other aspects of the mechanism of action, pointed out its ' important role in environmental protection and great application prospect. 随着经济的发展，环境污染及生态破坏越来越严重，严重威胁着人类及其他生物的生存和发展，特别是氮氧化物、氰化物、苯酚、多环芳烃等，因此，对这些污染物的降解、去除，已成为当务之急。而传统的物理、化学方法，由于成本高、容易产生二次污染等弊端，其应用越来越受到限制。生物去除法能够有效的降解环境中的氮氧化物、氰化物等污染物，具有成本低、选择性好、高效、无二次污染物等优点，已经被广泛应用。例如，镰刀菌对废水中无机氰化物的去除能力达90%以上。 1.镰刀菌 镰刀菌属隶属半知菌纲，由于它产生的分生孢子呈长柱状或稍弯曲像镰刀而得名。镰刀菌在固体培养基上的菌落呈圆形、平坦、绒毛状。颜色有白色、粉红、红、紫和黄等。有些种类的颜色为水溶性的，可溶于培养基中。镰刀菌是真菌中一个常见且重要的种属，在环境中分布极为广泛，甚至存在于严寒的南北极和干燥炎热的沙漠中，易培养，对营养物质要求不高，且抗毒性强。 镰刀菌属中有许多对经济作物有害的种，例如，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）能引起油桐枯萎病；串珠、尖孢、木贼、黄色等镰刀菌能引起小麦赤霉病，而且，镰刀菌还能产生镰刀霉毒素，对人畜及其他生物产生危害。
乳酸菌的提取和鉴定
酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接
种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态
HPLC法同时检测猪盲肠中的DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)和脱环氧DON
食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食品安全与检测 · 287 ·2012年 第37卷 第10期收稿日期：2012-04-16 *通讯作者 基金项目：国家自然科学基金项目(30871750)；公益性行业(农业)科研专项(201203037)。 作者简介：崔莉(1983—)，女，山东聊城人，博士研究生，研究方向为食品质量与安全。 崔 莉，刘 阳* (中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室， 北京 100193) 摘要：以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol ，DON)及其代谢产物脱环氧DON(DeepDON)为检测对象，建立了一种同时检测猪盲肠内容物中2种毒素的高效液相色谱分析方法。样品经乙腈提取后，分别采用吸附剂：木炭粉末+氧化铝+硅藻土(7+5+3，w+w+w)和Bond Elut Mycotoxin 多功能净化柱对DON 和DeepDON 进行净化，HPLC 检测，采用C 18色谱柱，乙腈/甲醇/水(5/5/90，v/v/v)为流动相，流速1.0 mL/min ，检测波长220 nm 。结果显示DON 和DeepDON 在0.5~10 μg/mL 范围内线性关系良好(R 2=0.9999，0.9998)。 关键词：猪盲肠；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)；脱环氧DON 中图分类号：TS 207.5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0287-04 Detection of deoxynivalenol and de-epoxy DON in caecum of pig by HPLC CUI Li, LIU Yang * (Institute of Agro-products Processing Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-products Processing Comprehensive,Ministry of Agriculture, Beijing 100193) Abstract: The appropriate method of high performance liquid chromatography(HPLC) was built for detecting deoxynivalenol (DON) and de-epoxy metabolitesin in caecum of pig. The DON was extracted by acetonitrile, DON was cleaned up with mixture of charcoal power, alumina and celite (7+5+3, w+w+w), DeepDON was cleaned up by Varian Bond Elut Mycotoxin clean-up column, then detected by HPLC, adopting C 18 column and acetonitrile-methanol-water (5/5/90, v/v/v) mixture as mobile phase under the condition of flow rate 1.0 mL/min and detection wavelength 220 nm. The results showed that good linear correlations between the peak area and toxin concentration were found: the linear range for DON and DeepDON was 0.5~10 μg/mL(R2=0.9999, 0.9998).Key words: caecum of pig; deoxynivalenol(DON); deepoxy-DON HPLC法同时检测猪盲肠中的 DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)和 脱环氧DON
谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法
谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法 1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫测定法(ELISA)的基本要求。 本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。 第一法的最低检出浓度为0.1mg/kg。 第二法的最低检出浓度为0.1ng/kg。 第一篇薄层色谱测定法 2 原理 谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。 3 试剂 以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。 3.1 三氯甲烷。 3.2 无水乙醇。 3.3 甲醇。 3.4 石油醚(60～90℃或的30～60℃)。 3.5 乙酸乙酯。 3.6 乙腈。 3.7 丙酮。 3.8 异丙醇。 3.9 乙醚。 3.10 无水乙醚。 3.11 氯化铝(AlCl3·6H2O)：化学纯。 3.12 中性氧化铝：层析用，经300℃活化4h，置干燥器中备用。 3.13 活性炭：20g活性炭，用3mol/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。 3.14 硅胶G：薄层层析用。 3.15 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(以下简称DON)标准溶液，精密称取5.0mg DON，加乙酸乙酯－甲醇(19∶1)溶解。转入10m 容量瓶中，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至刻度，此标准溶液含DON0.5mg/mL。吸取此标准溶液0.5mL，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至10mL，此溶液每毫升含DON25?g。 4 仪器 4.1 小型粉碎机。 4.2 电动振荡器。 4.3 75mL玻璃蒸发皿。
PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用
PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用 王庭柱，高学军，杨振宇 东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030） E-mail：wangtingzhu1980@https://www.sodocs.net/doc/1018781041.html, 摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学 1. 引言 乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。 传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。 PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培
脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性研究进展
脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性研究进展 霍星华，赵宝玉，郭玺，万学攀，王建军 西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌（712100） 摘要：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）又名呕吐毒素（VT），是由镰刀菌产生的单端孢霉烯族污染性霉菌毒之一，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）在霉败的饲料、谷物及谷物制品中常能检测出。由于DON的在重要粮食发霉以后的常见性，引起了不少国内外的学者的关注，随着研究手段的不断改进，对DON的研究也不断深入。本文从脱氧雪腐镰刀菌烯醇对粮食的污染现状，其理化特性，，对动物及细胞的毒作用和免疫功能的影响，及检测方法进行了综述。 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇，毒性 霉菌毒素是各种霉菌高毒性的代谢产物，在适当的温度、湿度、基质时，霉菌毒素便被合成。曲霉、青霉和镰刀菌是产生毒素的最主要霉菌。至今人们已知道大约有300种不同的霉菌毒素，但仅有少数被认为与畜禽疾病有关系。霉菌毒素的高量摄取，经常造成急性病状，然而低量摄取，则造成非特定的临床现象，例如，食物摄取量降低、生长不良、增重缓慢、死亡率增加、免疫抑制等。而单端孢霉烯族毒素是粮食中最常见的一类污染性霉菌毒素，由镰刀菌产生，包括T－２毒素、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)、玉米赤霉烯酮(Zearalrnone)、伏马菌素(Fumonisin)、镰刀菌烯酮-X(Fusarenon-X，FX)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等。可对人、畜产生广泛的毒性效应，如食欲降低、体重减轻、代谢紊乱等。DON 是最常见的一种，在全世界范围内，是粮食、饲料和食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。它不仅可以污染农作物, 也可以污染粮食制品，对人和动物可以产生广泛的毒性效应。近年研究发现，脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人和动物的免疫功能产生明显的影响。根据 DON 的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激的毒性作用。目前国内外，对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究比较多，下文就DON的特性、污染现状、毒性作用、毒素对免疫功能的影响，以及毒素的检测进行了综述。 1. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的历史与理化特性 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalnol，DON）是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生[1]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是诸罔信一等[2]，在1970 年首先从日本香川县感染赤霉病的大麦中分离到的。1973年,Vesohder从美国俄亥俄州西北部导致母猪拒食和呕吐的被禾谷镰刀菌污染的玉米中分离得到该毒素；并根据它能引发动物呕吐的特征，将其定名为呕吐毒素(V omitoxin，VT)。国内1976年从上海市金山县赤霉病元麦中分离出能使鸽子口服的致吐的纯品。徐一纯等（1979）从田间感染禾谷镰刀菌的赤霉病大麦中分离得到一种新的呕吐毒素，定名CBD2[3]。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇为雪腐镰刀菌烯醇的脱氧衍生物，其化学名称为 3 ,7 ,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8 酮(3,7,15-trihydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-one)；是一种无色针状结晶, 熔点为151～153℃，可溶于水和极性溶剂，如含水甲醇、含水乙醇或乙酸乙酯等，具有较强的热抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可长期保存[2]。在 PH4.0 条件下，100℃和120℃加热60min均不被破坏，170℃加热 60min 仅少量被破坏；在 PH7.0条件下，100℃和120℃加热 60min 仍很稳定，170℃加热15min部分被破坏；在 PH10.0条件下，100℃加热60min 部分被破坏，120℃加热30min 和 170℃加热15min 完全被破坏[4]。
镰刀菌病,镰刀菌病的症状,镰刀菌病治疗【专业知识】
本文极具参考价值，如若有用请打赏支持我们！不胜感激！ 镰刀菌病,镰刀菌病的症状,镰刀菌病治疗【专业知识】 疾病简介 镰刀菌病又称镰孢霉病，是由镰刀菌引起的皮肤、角膜或系统性感染，属于无色丝孢霉病。镰刀菌(fusarium)是自然界分布极广的真菌，多为腐生，极易侵犯田间的谷物和仓库贮存的各种粮食。疾病病因 一、发病原因由镰刀菌引起的皮肤、角膜或系统性感染。 二、发病机制 镰刀菌为条件致病菌。皮肤损伤和人体免疫力下降易致病。病原菌常见的有串珠镰刀菌 (F.moniliforme)、茄病镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)等。镰刀菌是引起角膜炎、角膜溃疡最常见的病原菌之一，还可引起内眼炎、骨髓炎、关节炎、鼻窦感染、甲真菌病和足菌肿等。在烧伤皮肤上镰刀菌能在痂和组织碎屑上大量繁殖，但一般不侵入周围组织。偶可引起播散性感染。 症状体征 一、症状由镰刀霉毒素引起人和家畜中毒的主要症状为明显的乏力、头痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经系统的严重紊乱。还有另一种食物中毒性白细胞缺乏病，主要由拟枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌侵犯谷物后，在田间越冬而产生强烈的毒素所引起。三线镰刀菌可产生一种代谢产物，即T-2毒素，可导致骨髓造血组织的坏死和内脏器官的出血。镰刀菌还可引起系统性疾病，侵犯尿道、膀胱、脑、肾、肺、心、骨、胰腺等。播散性感染多见于中性粒细胞减少及骨髓移植者。 根据临床表现，取皮屑、脓液、甲屑、角膜溃疡刮取物、活体组织及尸体组织标本等，显微镜下可见分枝、分隔的菌丝，类似曲霉的镜下特征。在沙堡培养基上，气生菌丝丰富。镜下可见大、小分生孢子形态多样。诊断不难。 用药治疗
粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法编制说明
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》 编制说明 《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金 快速测试卡检测方法》 标准起草组 2011年11月
《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金 快速测试卡检测方法》 编制说明 1．任务来源及工作过程 国务院粮食管理流通条例和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检验控制，而我国标准体系中缺少呕吐毒素快速检测的方法及标准因此，该项研究迫在眉睫。 我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。时间短，收购量大，存在很多隐患。主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需要快速定性。另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。 传统上，真菌毒素的分析一般采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。这两种方法都不适合在收购原粮时进行快速定性检测。因此需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇快速检测方法的研究，从源头解决储备粮真菌毒素污染问题。 为了确保公民的饮食安全，进一步保证产品质量、规范生产、为市场监督提供依据，需要制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准，按照GB2760-2007的要求，对小麦粉及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量进行监督。 本行业标准的制定是根据国家粮食局标准质量中心下达的年国家标准制修订任务，由北京市粮油食品检验所负责起草。项目编号：
乳酸菌的分离、纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙； 0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
乳酸菌菌株鉴定
分子生物学实验作业 ——用分子生物学方法鉴定菌株 专业：生物化工 姓名：王晓娜 学号：1043111039
鉴定一株乳酸菌菌株 一、实验目的和方法 采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株 二、实验材料 2.1 菌株 实验给定的菌株 2.2 试剂 Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA
2.3 仪器 台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统 三、实验步骤 3.1 制备细菌DNA样品 收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。 3.2 PCR反应 扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察
乳酸菌的分离和初步鉴定
乳酸菌的分离和初步鉴定 刘海音张超 (长春师范学院生物系，长春，130032) 摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。 关键词：乳酸菌分离鉴定 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌 1.材料和方法 1.1材料 1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶 1.1.2 培养基 BCG牛乳培养基 A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml, 80 摄氏度灭菌20 min. B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。 乳酸菌培养基 牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8 121摄氏度湿热灭菌20 min 蛋白胨水培养基
乳酸菌的鉴定
乳酸菌的鉴定 吲哚试验 1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。 3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 糖发酵试验 1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。 3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。 1.2.3 乳酸的检测 选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。 1.结果和分析 2.1 乳酸菌的分离提纯 在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下 观察到了链球状和杆状两种形状（如图一 2.2乳酸菌的鉴定 该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。 说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证
分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用
分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用 近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。本文对目前的主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中 的应用做一综述。 标签： 乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术 随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平的鉴定就至关重要。传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。随着分子标记技术的发展,基因型鉴定法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内 外学者用于乳酸菌的鉴定。 1 乳酸菌 乳酸菌是存在于人体内的益身菌。按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种。目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
乳酸菌的分离及初步鉴定
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用
龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/1018781041.html, 分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用作者：何荣窦丽芳董玲 来源：《现代商贸工业》2010年第16期 摘要:近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。本文对目前的 主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中的应用做一综述。 关键词: 乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术 中图分类号:TQ 文献标识码:A 文章编号:1672-3198(2010)16-0321-02 随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平 的鉴定就至关重要。传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间 生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。随着分子标记技术的发展,基因型鉴定 法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内外学者用于乳酸菌的鉴定。 1 乳酸菌 乳酸菌是存在于人体内的益身菌。按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些 菌种还包括数个亚种。目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆 菌属(Bifidobacteria B)。乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌 (L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双
乳酸菌鉴定
都要求无菌操作 菌种的分离 取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C 恒温下培养48h。挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜检，茵体一致)。结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。再分别转移到试管斜面上进行保存。 分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2；保存用斜面培养基：酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH 7．0。 培养条件 将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，在30℃恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。 测定方法 菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性及含量测定依据食品检验技术 1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优良菌株一试管穿刺低温保存。 1．2 1．2 乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。生理生化特征鉴定：产乳酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应?、明胶水解反应、硫化氢反应、乳酸菌发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。 1．2．I．3 乳酸菌的保存?采用定期移植低温保藏法。培养基配方：葡萄糖1％、蛋白胨0 2％、 l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。c灭菌30min。将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。 1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验 1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度计上，用最大吸收光波长=6001RIifl测定。