神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对PC12细胞NF-kappaB活性的影响
神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶表达的多样性和相应亚型对
PC12细胞NF-kappa B活性的影响
（华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉430030）
金小高罗爱林王金韬张广雄王贤裕李亚文
[摘要]目的：研究神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶亚型的表达变化，检测相应亚型对NF-kappa B转录活性，探讨神经型一氧化氮合酶各亚型的表达变化在致痛机制中的意义。方法：雌性SD大鼠20只，体重150～200g，随机分为2组（n=10），对照组和SNI组。 SNI组于左肢制备坐骨神经保留性神经损伤模型（SNI），对照组实施假手术。手术前后测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。术后11d痛觉测定后，每组取3只大鼠用于灌注，应用免疫组织化
脊髓，提取其中3只学方法检测脊髓nNOS的表达。7只大鼠断头处死后分离L
4-6
大鼠脊髓的蛋白质，应用抗nNOS羧基端抗体和Western Blot方法检测nNOS的表达，提取其中4只大鼠脊髓的RNA，1只大鼠脊髓RNA进行RACE-PCR和Southern Blot实验检测nNOS不同的mRNA；余下3只大鼠脊髓的RNA用于检测nNOS的mRNA 变化。将携带nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒通过脂质体转染PC12细胞后，提取经筛选PC12细胞的核蛋白，采用EMSA凝胶电泳阻滞实验检测细胞核NF-kappa B转录活性。结果：SNI组术后3d机械刺激术侧后爪引起缩腿反应的次数高于对照组（P<0.05）。nNOS主要表达于脊髓背角的Ⅰ～Ⅳ层和Ⅹ层。Western Blot结果显示有三种分子量的nNOS表达，分别位于155、135和125KD 左右，155KD的nNOS表达的相对灰度SNI组高于对照组（P<0.05）；135KD的nNOS 表达的相对灰度SNI组高于对照组（P<0.05）；而125KD的nNOS表达的相对灰度两组差异无统计学意义（P>0.05）。RACE-PCR和Southern Blot实验证实有三种nNOS（nNOSα、β和γ）的mRNA表达。PCR结果显示存在nNOSα、nNOSβ的mRNA。PC12细胞转染nNOSα后增加NF-kappa B转录活性（P<0.05），而nNOSβ降低NF-kappa B转录活性（P<0.05）；结论：大鼠脊髓背角有三种神经型一氧化氮合酶（nNOSα、β和γ）表达；神经病理性疼痛时nNOSα表达升高，而nNOSβ降低；由于结构不同，nNOSα增加PC12细胞NF-kappa B转录活性，nNOSβ则降低其活性；可能与疼痛的机制有关。因此可以认为神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOSα和nNOSβ的表达变化可能是致痛机制之一。
关键词：神经病理性疼痛；脊髓；神经型一氧化氮合酶；核因子kappa B
The diversities of neural nitric oxide synthase expression in spinal cord of rats with neuropathic pain and their effects on NF-kappa B activity in PC12 cells Xiaogao Jin, Ailin luo*, Ping wang# , Guangxiong Zhang, Jintao Wang, Yawen Li . *Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, P.R.China, 430030; #Department of Anesthesiology, The people’s hospital of Enshi state，Enshi, P.R.China.
[Abstracts]Objective To observe the diversity and changes of nNOS expression in spinal cord in rat with neuropathic pain, and To determine effects of overexpression of nNOSα or nNOSβ on NF-kappa B activity and apoptosis in PC12 cells. Methods 20 female SD rats (weight ranged from 150 to 200g) were randomized into two groups，control group and Group SNI. No any injury was taken in control group. Surgery was performed for SNI neuropathic pain model in Group SNI. Foot-lift response frequency to mechanical stimulation for ipsilateral hindpaw was assessed by 12g and 2g touch stimulator. On the 11th day after operation, 3 rats from each group were fixed by perfusion for immunohistochemistry to analyse the expression of nNOS. Protein from L4-6 spinal cord from other 3 rats in each group were detected with an antibody specific for COOH-terminal domain of nNOS using Western blot. Total RNA were extracted from ipsilateral L4-6 spinal cord in other 4 rats in each group. Rapid amplifica tion of 5’-RACE-PCR was performed to identify the diversity of 5’terminus of nNOS, then southern blot confirmed them. RT-PCR devised for different 5’terminus of nNOS were amplified to further confirm presence of the diversity of nNOS in mRNA level. PC12 cell was transfected with pcDNA3-nNOSα or pcDNA3-nNOSβ respectively.Then the nuclear translocation of NF-kappa B of PC12 cell was assayed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA).
Results: Since the 5th day after operation, all rats in Group SNI developed a relative unchangeable mechanical allodynia. The expression of nNOS was mainly distributed in neurons in Ⅰ-Ⅳand Ⅹ lemanie in dorsal horn. Western Blot analysis indicated three kinds of nNOS at 155, 135 and 120 KDa were present in rat spinal cord. The nNOS at 155 KDa in SNI group increased significantly when compared with control group (P<0.05), but vice versa for the nNOS at 135 KDa (P<0.05). Rapid
amplification of 5’cDNA ends-PCR revealed the presence of three different 5’-end splices variants of nNOS. RT-PCR confirmed two variants encoded for the nNOS at 155 KDa, one for the nNOS at 135 KDa. PC12 cell Transfected with nNOSα gene increased nuclear translocation of NF-kappa B comparing with null transfectants PC12 cells. But overexpression of nNOSβ in PC12 cell decreased nuclear translocation of NF-kappa B when compared with null transfectants cells. Conclusion: There are at least two kinds of nNOS protein (weighted at 155 and 135 KDa, e.g. nNOSαand nNOSβ) expressed in rat spinal cord. The expression of nNOSαincreased in spinal cord in rats with neuropathic pain, but nNOSβ decreased. nNOSα increase nuclear translocation of NF-kappa B in PC12 cells, but nNOSβ decreased it. The changes of nNOSαand nNOSβexpression in spinal cord may concern with the mechanism leading to neuropathic pain.
Key words: neuropathic pain; spinal cord; neural nitric oxide synthase;nuclear factor kappaB
外周神经损伤可导致神经病理性疼痛，神经型一氧化氮合酶（nNOS）在脊髓中发挥着重要的致痛作用。研究表明[1]，神经病理性疼痛时，痛觉传人神经元末梢在脊髓中释放大量的谷氨酸，谷氨酸通过激活NMDA受体提高痛觉转递神经元的兴奋性，与此同时，经NMDA受体内流的Ca2+激活临近的nNOS，nNOS 合成的NO透过细胞膜弥散致突触前膜加速谷氨酸的释放，促进疼痛产生。
NMDA受体和nNOS在功能上之所以能够相互促进，是因为NMDA受体亚单位NR2B和nNOS均具有PDZ结构域[2]；PSD95（PSD95是一种骨架蛋白，它具有3个PDZ结构域）通过PDZ与PDZ的相互作用将含有PDZ结构域的NR2B 和nNOS联系在一起[2]，这是nNOS与NMDA受体在功能上具有相互促进作用的结构基础。
近来在小鼠的脑组织中发现三种不同氨基端的神经型一氧化氮合酶，分别为nNOSα、β和γ[2-5]。nNOSα是全长的nNOS，其分子量为155kDa，其氨基端包含一个PDZ结构域，可以与突触后致密物质（PSD95）的PDZ结构域相互结合，使得nNOSα可以位于细胞膜上；而nNOSβ和γ的分子量分别为136、125 kDa，它们均不具有氨基端的PDZ结构域，不能锚定在细胞膜上与NMDA受体形成复
合物，不能充分利用经NMDA受体内流的钙，它们合成NO的能力分别是nNOS α的80％和3％。如上所述，神经病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS对疼痛产生如此重要，并且大鼠和小鼠组织一样存在多种nNOS亚型[2-7]，但大鼠脊髓中nNOS 表达的亚型类别以及各类型的表达变化尚不清楚，因此，本研究的目的之一在于明确神经病理性疼痛大鼠脊髓神经型一氧化氮合酶表达的亚型及变化。
由于缺乏PDZ结构域，部分nNOS亚型处于细胞浆中，合成NO的能力显著下降。PDZ结构域不仅对nNOS亚型合成NO的能力有重要影响，而且可能对NMDA受体的功能有重要的调节作用。研究表明nNOS生产的NO可以亚硝基化NMDA受体的巯基，改变NMDA受体的结构，减少钙离子的内流[8]；也有研究表明：在肌萎缩性侧束硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的运动神经元中神经丝相互聚集，聚集的神经丝将nNOS包裹在胞浆中，nNOS不能对细胞膜上的NMDA受体产生反馈性抑制作用，NMDA受体活性增强，导致运动神经元受损[9]。由此可以推测，如果nNOS亚型缺乏PDZ结构域而位于细胞浆，那么将失去对NMDA受体的调节功能。介于PDZ结构域对nNOS亚型的功能有如此重要影响，本实验在明确nNOS各亚型表达及变化的基础上，将选择相应的亚型研究它们在功能上的差异。研究表明，组成型NOS（nNOS和eNOS）合成的NO通过亚硝基化NF-kappa B的巯基，破坏其构形，可以抑制NF-kappa B的转录活性[8]；但研究也显示NO具有促进NF-kappa B转录活性的作用[8]；由此可以推测，不同亚型的nNOS可能对NF-kappa B转录活性产生不同的影响。研究还显示神经病理性疼痛脊髓中NF-kappa B转录活性加强，增加nNOS和COX-2的表达，提高了痛觉传递神经元的兴奋性，促进疼痛产生[10-11]。所以，本实验的另一目的在于选择NF-kappa B转录活性来研究nNOS亚型功能的差异，探讨不同nNOS亚型在神经病理性疼痛大鼠脊髓中的致痛机制。
1 材料与方法
1.1 分组和模型制备雌性SD大鼠20只，体重150～200g，月龄2个月（华中科技大学同济医学院动物饲养中心），随机分为2组(n=6)，对照组于大鼠左肢暴露坐骨神经后，随即缝合切口；SNI组用于制备坐骨神经保留性神经损伤模型（SNI），暴露大鼠左后肢坐骨神经主干及其分支（胫神经、腓肠神经、腓总神经），结扎并切断胫神经、腓总神经，保留腓肠神经，缝合手术切口。
1.2 痛觉测定使用动态足底触觉测量仪（Ugo basile公司生产，意大利）测定大鼠对机械刺激的反应，12g和2g力度的接触刺激分别代表痛觉过敏和痛觉异常，每个力度共刺激大鼠术侧后爪足底外侧30次，分三次实验，每次刺激10次，间隔10min后再重复实验，计算总的缩腿反应次数。分别于术前3d、术后即刻、术后1、3、5、7、9、11d测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。1.3 免疫荧光双标方法测定脊髓nNOS和NeuN的表达术后11d测痛后，两组各取大鼠3只，10%水合氯醛600mg/kg麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分离脊髓，截取L
4-6
脊髓，经多聚甲醛后固定，蔗糖脱水后，冰冻冠状切片（30μm），收集切片于0.01mmol/L的PBS中，应用漂片法进行免疫荧光组化实验，使用抗nNOS 梭基端抗体（北京中山公司）检测nNOS的表达。切片经0.01 mol?L-1 PBS漂洗10min后滴加羊血清孵育30min,勿洗，加兔抗 nNOS (1: 300, R&D),4oc过夜；PBS冲洗，3minx3次，滴加TRITC标记山羊抗兔IgG荧光二抗，室温孵育1h, PBS 冲洗，3minx3次；再用羊血清孵育30min, 滴加鼠抗NeuN(1: 500, Santa Cruz), 4oc过夜；PBS冲洗，3minx3次，滴加FITC标记山羊抗鼠IgG荧光二抗，室温孵育1h, PBS冲洗，3minx3次。甘油封片，荧光显微镜观察双标结果。
1.4 Western Blot方法检测脊髓nNOS的表达术后11d测痛后，两组各取大鼠
3只，断头处死，迅速分离L
4-6脊髓，加入2倍L
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脊髓体积的悬浮缓冲液（0.1mol/L
NaCl、0.01mol/L Tris.Cl、0.001mol/L EDTA、1μg/ml Aprotinin、100μg/ml 苯甲基磺酰氟），4℃匀浆器中匀浆。匀浆后于4℃低温离心机12000转/min离心45min，吸取上清液，采用考马斯亮蓝G250法蛋白定量。灌制8％SDS-PAGE凝胶，每孔上样量50μg，在65V稳压电场中电泳。电泳后应用380mA电流将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素滤膜。硝酸纤维素滤膜经5％脱脂奶粉封闭后，依次与兔抗鼠nNOS抗体、羊抗兔二抗孵育后，DAB显色。
1.5 5’-RACE-PCR和Southern Blot方法测定脊髓nNOSmRNA的多样性术后11d 测痛后，两组各取大鼠3只，断头处死，迅速分离L
4-6
脊髓，使用Trizol（北京中山公司）提取总RNA。5’-RACE-PCR的试剂和方法均来自BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD公司，美国)。取2μg总RNA42℃1.5h合成第一条cDNA 链。合成第一条cDNA链 2.5μl、nNOS特异性反义引物5’-TCTCCTTGTTTCANCTCCTCC-3’（上海生物工程有限公司合成）1pmol、通用混合
引物（5’-CTAATACGACTCTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’和5’- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）5μl按照试剂盒说明采用降度PCR技术快速扩增5’ cDNA端，PCR具体方法为94℃50s、62℃45s、72℃3min、循环5次，每次降低退火温度2℃，然后94℃45s、56℃45s、72℃3min、循环32次。PCR产物于1.25%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下拍照保存[6]。
利用毛细管的抽吸作用将琼脂糖凝胶中的PCR产物转移至尼龙膜上， DNA 5’ END-Labeling System（Promega公司，美国）标记 [γ32]ATP（北京福瑞生物公司）于5’-TCTGGCTTCCGCGTGTGC-3’，将尼龙膜与1pmol标记[γ32]P的nNOS引物38℃共孵育12h。尼龙膜漂洗干燥后，与X光片一起置于－70℃下12h 以获得放射性自显影影像。
1.6 RT-PCR法检测nNOSa、nNOSb的转录。两组取另外3只大鼠，断头处死，提
段脊髓RNA。每一个样品取4μg RNA进行逆转录后，各取2μl进行PCR 取左侧L
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反应。nNOSα-a与nNOSβ的上游引物为5’-ggt gag cca ggt tgt gc -3’，下游引物为5’-ctt ctc tga ata cgg gtt gtt a -3’（上海生物工程有限公司合成），合成的DNA片段分别为1478bp和392bp；nNOSα-b的上游引物为5’- gactgagggcgacactaccatgc -3’，下游引物为5’- tcgggggcagcaacgggatgtgtc -3’，合成的DNA片段为208bp；β-actin上游引物为5’- AAGATTTGGC ACCACACTTTCTAC -3’，下游引物为5’- ACACTTCATGATGGAATTGAATGT -3’，合成的DNA片段为605bp。PCR的条件为94℃3min预变性，94℃30s、50℃45s、72℃2min，循环次数为38次，PCR产物于1.25%琼脂糖凝胶中电泳，检测电泳条带的灰度。
1.7 PC12细胞转染nNOS亚型后NF-kappa B的活性变化PC12细胞采用DMEM/F12培养基、150g/L胎牛血清于多聚赖氨酸包被的培养瓶中培养。在PC12细胞覆盖培养瓶达到90％左右时，使用脂质体将携带nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒（德国Saur教授赠送[7]）转染PC12细胞，培养1～2天后，经G418筛选2～3wk，得到高表达nNOSα或nNOSβ的PC12细胞，Western Blot 检测细胞浆nNOS的表达效率。收集未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因的PC12细胞，1500r/min离心后，使用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒提取细胞核蛋白，考马斯亮蓝G250法蛋白定量，－80℃储存备
用。分别取未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因的PC12细胞细胞核蛋白20μg，分别与[γ32]P标记的NF-kappa B结合系列5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’(双链)共孵育1h。灌制20g/L SDS-PAGE凝胶，分别加入上述混合物，在溴酚蓝指示下150V电泳。电泳完成后，应用同样大小的滤纸贴附在凝胶上，小心剥离凝胶，将滤纸和凝胶一同干燥，让滤纸完全干在滤纸上，把滤纸和X 光片一起置于－70℃下12h以获得放射性自显影影像。
1.8 统计学处理用SPSS11.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间采用独立样本t检验；P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 痛觉测定12和2g力度的接触刺激引起SNI组缩腿反应的次数在术后3日后各时点均高于对照组（P<0.05）；两种力度的刺激引起SNI组缩腿反应的次数在术后5日后各时点差异无统计学意义（P>0.05），对照组手术前后各时点比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1，2。
与对照组比较，*P<0.05
图1 12g力度刺激术侧后爪30次引起两组大鼠不同时点缩腿反应次数的比较
与对照组比较，*P<0.05
图2 2g 力度刺激术侧后爪30次引起两组大鼠不同时点缩腿反应次数的比较
2.2 免疫组化nNOS主要表达在脊髓背角Ⅰ-Ⅳ层和Ⅹ层；在背角Ⅱ层nNOS的表达呈带状分布,细胞形态不清楚，Ⅲ、Ⅳ和Ⅹ层表达nNOS的细胞形态清楚，呈散在分布；表达nNOS的细胞与神经元（表达神经元标记物Neuro）基本重
合（图3），但对照组与SNI组nNOS表达灰度差异没有差异无统计学意义。
图3 大鼠脊髓表达nNOS和Neuro的状况（100倍）
（A、B和C均为同一脊髓背角，分别为表达nNOS、NeuN和重合的情况；D、E和F均为同一中央孔附近区域，分别为表达nNOS、NeuN和重合的情况）
2.3 脊髓中nNOS表达Western Blot结果对照组和SNI组有三种不同分子量的
nNOS表达，分子量分别为155、135和120KDa(图4)；SNI 组155 KDa nNOS的相对表达量（nNOS与β-actin表达灰度的比值）高于对照组（P<0.05），而135KDa nNOS相对表达量低于对照组（P<0.05），差异均具有统计学意义；120KDa nNOS 的相对表达量在两组中无统计学意义（P>0.05）。
图4 对照组和SNI组脊髓表达nNOS的Western Blot结果
2.4 RACE-PCR和Southern Blot结果针对nNOS氨基端的RACE-PCR结果电泳条带不清楚；电泳条带的Southern Blot结果显示对照组和SNI组脊髓中均有三种不同分子量的DNA条带，分别大约为300、750和1250bp(图5)。
图5 对照组和SNI组脊髓中nNOS的RACE-PCR和Southern Blot结果
（A为RACE-PCR，B为Southern Blot结果）
2.5 PCR结果对照组和SNI组脊髓中β-actin的PCR结果显示β-actin片段位于大约600bp处；针对nNOSα-a的PCR结果显示于450bp和1500bp处各有一种片段，分别定为nNOSα-a和其剪结体nNOSβ；关于nNOSα-b的PCR结果显示nNOSβ片段大约位于150bp处（图6）。
图6 对照组和SNI组脊髓中针对β-actin、nNOSα-a和nNOSα-b PCR产物电泳结果
（A为β-actin，B为nNOSα-a，C为nNOSα-b）
2.6 Western Blot结果未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞有三种不同分子量的nNOS表达，分子量分别为155000、135000和120000；PC12细胞未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因后分子量为155000的nNOS相对表达量（nNOS与β-actin表达灰度的比值）分别为0.58±0.06、1.50±0.23和0.91±0.08, 细胞转染nNOSα后分子量为155000的nNOS相对表达量高于未转染和转染nNOSβ基因（P<0.05）；PC12细胞未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因后分子量为135000的nNOS相对表达量分别为0.49±0.04、0.52±0.14和0.87±0.09,转染nNOSβ基因后分子量为135000的nNOS相对表达量高于未转染和转染nNOSα基因的PC12细胞（P<0.05）；分子量为120000的nNOS相对表达量在未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞分别为0.59±0.02、0.70±0.12和0.68±0.06
（P>0.05）。见图7。
图7 PC12细胞未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因后nNOS表达的Western Blot结果
（1、2和3分别为未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因的PC12细胞）
2.7 凝胶电泳阻滞实验（EMSA）结果EMSA获得放射性自显影影像的灰度表
示细胞核内NF-kappa B的量，间接显示NF-kappa B的转录活性，具体见图8。未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因的PC12核内NF-kappa B的EMSA灰度分别为18.30±1.4、26.4±5.0和8.9±0.7（104INT），转染nNOSα基因的PC12细胞NF-kappa B的转录活性高于未转染基因的PC12细胞（P<0.05），而转染nNOSβ基因的PC12细胞NF-kappa B的转录活性低于未转染基因的PC12细胞（P<0.05）。
图8 PC12细胞未转染、转染nNOSα、nNOSβ基因后检测细胞核NF-kappa B的EMSA结果（1、2和3分别为未转染、转染nNOSα或nNOSβ基因的PC12细胞）
3 讨论
神经损伤所导致的痛觉异常或痛觉过敏称为神经病理性疼痛，神经病理性疼痛的机制尚不清楚。研究神经病理性疼痛的机制有多种模型供选择，本研究之所以选择坐骨神经保留性神经损伤模型（SNI），是因为该模型相对于CCI或SNL 模型操作简单、产生疼痛需要的时间短、疼痛程度的个体差异性小。
本研究SNI模型大鼠术后3d就可以在术侧后爪产生明显的痛觉异常和痛觉过敏，术后5d痛觉的改变趋于稳定；在11d取材，大鼠痛觉稳定，脊髓中基因转录、蛋白表达产生明显而稳定的变化，便于比较它们的变化。
制作SNI模型是在暴露大鼠左后肢坐骨神经主干及其分支（胫神经、腓肠神经、腓总神经）后，结扎并切断胫神经、腓总神经，保留腓肠神经；坐骨神经在
脊髓对应的节段为L
4～6，所以本研究取材选择L
4～6
段脊髓，能够反应外周神经损
伤导致痛觉过敏后脊髓中nNOS表达变化。
衡量机械刺激诱导大鼠疼痛反应程度最常用的方法是测定50％缩爪阈值，但测定50％缩爪阈值的过程复杂、计算繁琐，不能直观地反应疼痛的变化。本研究采用12g和2g力度的接触刺激分别代表痛觉过敏和痛觉异常，每个力度共刺激大鼠术侧后爪足底外侧30次，计算总的缩腿反应次数，该方法操作简单，不需要计算，容易理解。
免疫组织化学结果显示nNOS主要分布于脊髓背角，神经病理性疼痛时脊髓背角的nNOS升高，在神经元中nNOS位于细胞膜和细胞浆。免疫组织化学可以清楚地显示nNOS表达的位置变化，但反应nNOS表达的数量变化不如Western Blot。Western Blot结果发现有三种不同分子量的nNOS的表达，其分子量分别为155、130和125KD左右。其中最有意义的就是155和130KD的nNOS，它们在神经病理性疼痛中不仅发生了显著变化，而且它们的变化方向恰恰相反。这三种分子量的nNOS与文献报道的nNOSα、β和γ的分子量大致相同，单单从Western Blot不能推断它们是否一一对应。
为了进一步验证是由不同mRNA翻译而来还是由同一种蛋白降解而来，本研究在Western Blot实验之后进行了关于nNOS的5’RACE-PCR实验。5’RACE-PCR 结果发现SNI组和对照组大鼠均有数种不同的mRNA表达，但条带不甚清楚。为了准确显示mRNA表达的不同，本研究在5’RACE-PCR结果的基础上，应用[P32]标记的nNOS特异性DNA序列与5’RACE-PCR电泳产物杂交，放射性自显影成像后清晰显示有三种不同的条带，分别处于300、750和1250bp的位置上。这三种不同的mRNA能否均翻译成三种不同的蛋白质，并与Western Blot结果中的三种不同分子量的nNOS相对应，至此尚不能确定。因为文献报道nNOS有多种不同的mRNA，能够翻译为的nNOSα有三种mRNA，分别为nNOSα-a、nNOSα-b和nNOSα-c，它们的第一个外显子exon1不同，分别为exon1a、exon1b和exon1c，但这三种mRNA只翻译为一种蛋白质nNOSα,但可能对翻译的效率有影响[4]。本研究显示RACE-PCR的三条带可能分别为nNOSα-a、nNOSα-b和nNOSβ三种mRNA。
为了确定脊髓的中有无nNOSa、nNOSb和nNOSβ三种mRNA，本研究根据nNOSα-a、nNOSα-b和nNOSβ设计了相应引物进行PCR实验，见图7。结合Western Blot结果，本研究可以推断脊髓中至少有三种不同mRNA的nNOS转录，按核苷
酸数目大小依次为nNOSa、nNOSb和nNOSβ，nNOSa、nNOSb翻译后对应Western Blot 条带155KD的nNOSα，nNOSβ翻译后对应Western Blot结果135KD的nNOSβ。而Western Blot结果125KD在本研究中没有发现相对应的mRNA，这有两种可能，其一：5’RACE-PCR实验中设计的nNOS引物过于靠近5’mRNA端，没有扩增到较短的nNOSγ；其二：125KD的nNOS或nNOSγ由nNOSα或nNOSβ降解得到。所幸的是，125KD的nNOS在神经病理性疼痛时变化不大，而最有意义是nNOSα和nNOSβ在转录和翻译水平均发生了相反的变化。
nNOSβ是nNOSα-b转录后通过剪切拼结而来。相对于nNOSα，nNOSβ缺少exon2, exon2编码nNOS氨基端的PDZ结构域[2]，nNOS、细胞骨架蛋白PSD95、NMDA受体的PDZ结构域通过相互作用在结构上联合在一起[9]，nNOS与NMDA受体进而在功能上具有相互调节作用[2-7]。通过PSD95，NMDA受体可以促进nNOSα合成NO的功能，nNOSα反过来可以调节NMDA受体活性；而nNOSβ由于缺失PDZ 结构域对NMDA受体依存性和调节功能减低。研究显示，NMDA受体与n NOS在脊髓中可以相互促进神经病理性疼痛的产生；本研究也显示与NMDA受体联系紧密的nNOSα表达升高；所以，nNOSα可能在神经病理性疼痛大鼠脊髓起到促进疼痛的作用。而nNOSβ没有PDZ结构域，不能在细胞膜上与NMDA受体相联系，处于细胞浆的nNOSβ表达减少，这种变化是促进还是抑制疼痛的产生尚不得而知。
本研究为了探讨脊髓nNOSα和nNOSβ在表达变化相反、分子结构不同上对神经病理性疼痛的影响，选择从功能上研究它们的差异性，NF-kappa B成为最合适的研究对象。为证明nNOS对PC12细胞NF-kappa B转录活性的影响，本研究提取了细胞核内的蛋白用于NF-kappa B的EMSA检测，因为只有细胞核内的NF-kappa B才能够与DNA特异系列结合，发挥转录活性。EMSA测定NF-kappa B转录活性的原理是利用NF-kappa B与DNA特异系列结合后，分子量增加，在凝胶上电泳速度减慢，通过[P32]标记的DNA特异系列得到放射性自显影。本研究结果显示nNOSα促进NF-kappa B转录活性，而nNOSβ降低NF-kappa B转录活性。
nNOSα可能利用通过NMDA受体内流的钙离子迅速激活，弥散致突触前促进谷氨酸释放，进一步激活nNOSα，大量内流的钙离子进而得以激活NF-kappa B
向核内转移，增加其转录活性。而位于细胞浆[12]中的nNOSβ则可以与NF-kappa B接近，合成的NO得以作用于NF-kappa B。有研究表明NO可以亚硝基化NF-kappa B的巯基，改变其构像，降低NF-kappa B的转录活性。本研究nNOSβ降低NF-kappa B转录活性可能与此有关。
神经病理性疼痛脊髓中NF-kappa B转录活性加强，增加nNOS和COX-2的表达，提高了痛觉传递神经元的兴奋性，促进疼痛产生。本研究显示，神经病理性疼痛大鼠脊髓中nNOSα表达升高，nNOSβ表达减少；nNOSα促进NF-kappa B 转录活性，而nNOSβ由于结构缺失而降低NF-kappa B转录活性；所以，初步推测神经病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS亚型nNOSα和nNOSβ的表达变化可能促进了疼痛的产生。
综上所述，神经病理性疼痛时大鼠脊髓nNOSα表达升高，nNOSβ表达减少；nNOSα是全长的nNOS，位于细胞膜，而nNOSβ由于缺乏PDZ结构域不能和NMDA 受体衔接，处于细胞浆；由于结构不同，nNOSα促进NF-kappa B转录活性，而nNOSβ降低其活性；介于NF-kappa B在神经病理性疼痛中发挥的重要作用，因此，可以推断nNOSα表达升高、而nNOSβ降低是神经病理性疼痛的机制之一。n NOSα与nNOSβ都属于nNOS，但由于结构差异导致功能截然相反，研究针对它们的药物来治疗神经病理性疼痛是一个值得探讨的方向。
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神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化
神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化 厉彩霞林海王均炉△ 温州医学院附属第一医院麻醉科 [摘要] 目的：观察大鼠坐骨神经结扎后神经病理性疼痛行为学以及生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的变化。方法：采用坐骨神经结扎损伤（CCI）模型，75只SD大鼠，随机分为三组（n=25）。对照组（con组）：不接受任何手术操作；假手术组（sham组）：只分离坐骨神经，不予以结扎；CCI组：结扎坐骨神经。于术前2d，术后1、3、5、7、10、14、21、28d测定各组大鼠热缩足反射潜伏期（TWL），机械缩足反应阈值（MWT），并于术后3、7、14、21、28天各组随机抽取5只大鼠杀死，采用免疫组织化学方法测定脊髓背根节GAP-43表达的变化。结果：与sham组和比较，CCI组术后各日TWL，MWT明显降低(P<0.01或<0.05)，sham组和con组行为学无显著差异(P>0.05)。CCI组较其它组GAP-43表达增高，且此蛋白在CCI组中术后第三天表达开始增高，第七至十四天达最高峰，以后逐渐下降。结论：CCI造模成功后大鼠痛觉及机械痛觉均过敏，且GAP-43表达增高。 [关键词] 神经病理性疼痛行为学改变GAP-43 Behaviorl observation and changes of the expression of growth associated protein-43 in dorsal root ganglion of rats following ligaion of sciatic nerve Li cai-xia, Lin-hai, Wang jun-lu Department of Anesthesiology,First Affiliated Hospital,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China [Abstract] Objective To investigate the behaviorl observation and changes of growth associated protein-43 in dorsal root ganglion of rats with ligaion of sciatic nerve.Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into 3 groups :Control group(Con),Sham operation group (Sham),Chronic constriction injury group(CCI).CCI model was adopted ,thermal withdrawal latency (TWL) and mechanical withdrawal threshold (MWT) of rats were measured on1,2 pre-operative and 1,3,5,7,10,14,21,28 post-operative days.Five rats were randomly picked from each group on 3,7,14,21,28 post-operative days and the immunochemistry was adopted to detect the change of GAP-43 expression on spinal dorsalhom .Results TWL and MWT in CCI were significant lower than Sham group on every post-operative day (P<0.01or<0.05);There was no significant difference in MWT and TWL between Sham and Con groups (P>0.05).The expression of GAP-43 was higher in CCI than other groups,and in this group the expression of GAP-43 was increased in the third day ,from the seventh day to the fourth day the expression arrived to the highest,then it began to decline.Conclusion The success of CCI appeared rats thermal and mechanical hyperalgesia and the expression of GAP-43 was increased. [Key words]Neuropathic pain; Change of behavior; GAP-43 神经系统物理损伤、代谢异常、缺血、病毒感染引起神经病理性疼痛，其特征为自发痛、触诱发痛及痛觉过敏。它是人类较常见的疼痛性疾病，但其发病机制复杂而使临床缺乏有效的治疗手段。神经病理性疼痛机制存在多种学说,其中以中枢敏化学说研究较多,张德仁等[1]研究认为GAP-43可以阻断神经病理性疼痛中枢敏化的形成，且刘光久等[2]在大鼠的坐骨神经再生的研究中发现，当轴索受△通讯作者
神经病理性疼痛诊疗专家共识_神经病理性疼痛诊疗专家组
? 指南与规范? 神经病理性疼痛诊疗专家共识 神经病理性疼痛诊疗专家组 doi:10.3969/j.issn.1006-9852.2013.12.001 △ 通讯作者 樊碧发（卫生部中日友好医院疼痛科，北京 100029）Email ：fbf1616@https://www.sodocs.net/doc/2d7354140.html, 一、定义及分类 国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain ，IASP) 于1994年将神经病理性疼痛（Neuropathic Pain ，NP ）定义为：“由神经系统的原发损害或功能障碍所引发或导致的疼痛（Pain initiated or caused by a primary lesion or dysfunction in the nervous system ）。 2008年，IASP 神经病理性疼痛特别兴趣小组（NeuPSIG ）将该定义更新为：“由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛”(neuropathic pain is de ?ned as pain caused by a lesion or disease of the somatosensory system)[1]。 新定义发生了如下重要变化：①用“损害”或“疾病”取代了“功能障碍”。 ②用“躯体感觉系统”取代了“神经系统”，使其定位更加明确[1]。 以往中文名称有神经源性疼痛、神经性疼痛、神经病性疼痛等，为了确切反映以上定义并兼顾中文语言习惯，建议将其统一称为“神经病理性疼痛”。神经病理性疼痛分为周围性和中枢性两种类型，不同类型的疼痛具有相似或共同的发病机制[2]。常见的神经病理性疼痛类型见表1。 以上表内疾病的定义和分类并非毫无争议， 例如，交感相关性疼痛如复杂性区域疼痛综合征I 型（CRPS-I ）、纤维肌痛症（FMS ）、内脏痛等，按新定义不属于神经病理性疼痛范畴，但在临床上仍然参照神经病理性疼痛来治疗。 二、流行病学和疾病负担 NeuPSIG 认为神经病理性疼痛患病率约为3.3%～8.2%[3]。 另一项来自欧洲的研究资料显示，一般人群的神经病理性疼痛患病率高达8.0%[4]。以此数据推算，我国目前神经病理性疼痛的患者约有9000万。尽管国内尚无针对神经病理性疼痛患者生存质量的系统性研究数据，但神经病理性疼痛对患者的生活质量的影响是显而易见的。长期疼痛不但会影响患者的睡眠、工作和生活能力，还会增加抑郁、焦虑等情感障碍的发病率。有研究表明：带状疱疹后神经痛患者的生活质量得分约为正常人群的1/2。 三、病因 神经病理性疼痛的产生有很多原因，包括从物理、化学损伤到代谢性复合性神经病变。 尽管患者的临床症状相似，但其病因却各不相同。外伤、代谢紊乱、感染、中毒、血管病变、营养障碍、肿瘤、神经压迫、免疫与遗传等多种病因均可导致神经损伤[5]。常见病因包括：糖尿病、带状疱疹、脊髓损伤、脑卒中、多发性硬化、癌症、HIV 感染，腰或颈神经根性神经病变和创伤或术后神经损害等[6]。 四、机制 神经病理性疼痛的发病机制复杂，包括解剖结构改变和功能受损，常由多种机制引起。包括外周敏化、中枢敏化、下行抑制系统的失能、脊髓胶质细胞的活化、离子通道的改变等[7]。可能涉及的病理变化包括：神经损伤、神经源性炎症、末梢神经兴奋性异常、交感神经系统异常和神经可塑性的变化。 1. 外周敏化与中枢敏化 外周敏化是指伤害性感受神经元对传入信号的 周围性神经病理性疼痛中枢性神经病理性疼痛带状疱疹后神经痛 糖尿病性周围神经病变三叉神经痛舌咽神经痛 根性神经病变(颈、胸或腰骶)嵌压性神经病变(如腕管综合征等)创伤后神经痛手术后慢性疼痛化疗后神经病变放疗后神经病变残肢痛 肿瘤压迫或浸润引起的神经病变酒精性多发神经病变梅毒性神经病变HIV 性神经病变营养障碍性神经病变毒物接触性神经病变免疫性神经病变 脑卒中后疼痛脊髓空洞症疼痛缺血性脊髓病疼痛 压迫性脊髓病（如脊髓型颈椎病、肿瘤）疼痛放射后脊髓病疼痛脊髓损伤性疼痛多发性硬化性疼痛帕金森病性疼痛幻肢痛脊髓炎疼痛 表1 神经病理性疼痛的常见类型
脊髓NG2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用和机制研究
华中科技大学博士学位论文 中文摘要 脊髓NG2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用及机制研究 博士研究生王萍 博士生导师田玉科教授 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 研究背景 神经病理性疼痛(Neuropathic pain)是神经系统损伤引起的一种难以治疗的慢性状态，国际疼痛研究协会( IASP,1994)称之为“由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱引起的疼痛”。感染、创伤、代谢性疾病、肿瘤化疗、手术、射线、神经毒性药物、神经受压缺血、炎症和肿瘤的侵袭都可引起神经病理性(中枢性和周围性) 疼痛。急性疼痛对机体具有警示和“保护”作用，而神经病理性疼痛与之不同，它可以持续存在，对机体无益，甚至会严重影响生活质量。神经病理性疼痛的产生机制十分复杂，从神经损伤（伤害性刺激）到疼痛产生，会在神经系统发生一系列的变化。脊髓是疼痛信息传递和整合的初级中枢，脊髓背角汇聚着来自外周的不同传入神经与来自脑干和大脑皮质的下行投射神经，加上背角局部中间神经元，组成十分复杂的神经网络，并含有非常丰富的生物活性物质，因此，脊髓在神经病理性疼痛的发生发展中起到重要的作用。 传统观点认为神经元是中枢神经系统中重要的信号细胞，而胶质细胞仅仅是起绝缘、营养与支持作用，因此，以往在对疼痛的研究中大量的实验关注于神经元的功能。但近年来发现，胶质细胞在疼痛的产生与发展过程中起重要的作用。Colburn等首次提出小胶质细胞的活化出现在疼痛的起始阶段,而星型胶质细胞在疼痛的发展和持续阶 段有很强的活化反应。外周神经损伤后初级传入神经纤维中枢端释放P物质（substance P, SP）、兴奋性氨基酸（Excitatory amino acids,EAAs）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,
益赛普对神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏的影响
第21卷 第4期河南医学研究Vol．21No．42012年12月HENAN MEDICAL RESEARCH December 2012 收稿日期：2012- 11-20；修订日期：2012-12-09作者简介：马婕妤（1983－），女，河南新乡人，硕士，医师，主要 从事临床麻醉工作。 文章编号：1004-437X （2012）04-0392-04·基础研究· 益赛普对神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏的影响 马婕妤1，陈彦青2，李保林 1（1．郑州市中心医院麻醉科 河南郑州450007；2．福建医科大学省立医学院麻醉科福建福州 350001）摘要：目的:观察重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（益赛普）对神经病理性疼痛（CCI ）大鼠痛 觉过敏的影响。方法:选择成年雄性SD 大鼠32只， 随机分为假手术组、慢性坐骨神经损伤（CCI ）组、0．4mg /kg 益赛普组和0．8mg /kg 益赛普组，CCI 组和益赛普组按Bennett 法建立CCI 模型，益赛普组于术后即刻开始至取材点每天给予皮下注射益赛普0．4mg /kg 或0．8mg /kg ，假手术组和CCI 组皮下注射生理盐水，容积与益赛普组相同，分别测定术前1d 、术后1d 、术后3d 、术后7d 大鼠的机械性痛觉阈值（MWT ）、热痛觉 阈值（TWL ）和运动功能评分。结果:与假手术组相比， CCI 组术后1d 、3d 、7d 机械痛和热痛阈值都有明显下降（P ＜0．05），益赛普组在术后各时间点机械痛和热痛阈值较CCI 组都有明显的升高（P ＜0．05），且高剂量组较低剂量组升高更明显（P ＜0．05）。结论:益赛普能够抑制CCI 引起的痛觉过敏反应，且高剂量比低剂量更有效。 关键词：益赛普；神经病理性疼痛；大鼠 中图分类号：R-332文献标识码：B doi ：10．3969/j．issn．1004-437X2012．04．003 The effect of etanercept on hyperalgesia in neuropathic pain rats MA Jie-yu 1，CHEN Yan-qing 2，LI Bao-lin 1 （1．Anaesthesia Staff Room of Zhengzhou Central Hospital ，Zhengzhou 450007，China ；2．Anaesthesia Staff Room of Fujian Provin-cial Hospital ，Fuzhou 350001，China ） Abstract ：Objective ：To investigate the effect of recombinant human tumor necrosis factor receptor type Ⅱ-antibody fusion protein （etanercept ）on hyperalgesia in neuropathic pain （CCI ）rats．Methods ：Thirty-two adult male SD rats were selected and randomly divided into four groups ，which included sham-operation group ，chronic constriction injury （CCI ）group ，0．4mg /kg etan-ercept group and 0．8mg /kg etanercept group．CCI group and etanercept groups were establish CCI model according to the method of Bennett．Etanercept groups given daily subcutaneous injec-tion of 0．4mg /kg or 0．8mg /kg etanercept from the immediate postoperative to sampling point ，and sham-operation group and CCI group given subcutaneous injection of saline at same volume．Measure the mechanical withdrawal threshold （MWT ），the thermal withdrawal latency （TWL ）and the motor function score in preoperative 1d ，postoperative 1d ，postoperative 3d ，postoperative 7d respectively．Results ：Compared with sham-operation group ，the postoperative 1d ，postoperative 3d ，postoperative 7d of MWT and TWL in CCI group have significantly decreased （P ＜0．05）．Compared with CCI group ，at each time point after operation ，the MWT and TWL of etanercept group have significantly elevated （P ＜0．05），and the high-dose group increased more significantly ·293·
2020周围神经病理性疼痛诊疗中国专家共识(完整版)
2020周围神经病理性疼痛诊疗中国专家共识（完整版） 神经病理性疼痛(n eu ro path ic pai n,NP)是由躯体感觉系统损伤或疾病导致的疼痛，分为周围神经病理性疼痛和中枢神经病理性疼痛，临床上周围神经病理性疼痛较常见。NP不是单一疾病，而是由许多不同疾病和损害引起的综合征，表现为一系列症状和体征，涵盖了100多种临床疾病，严重影响病人生活质量。由于神经病理性疼痛的机制复杂，导致临床上慢性NP病人的治疗不充分，甚至出现不恰当的治疗。 为规范周围神经病理性疼痛的诊断和治疗，中国医师协会疼痛科医师分会、国家临床重点专科·中日医院疼痛专科医联体和北京市疼痛治疗质量控制改进中心组织国内专家多次研讨，在参考借鉴国外最新指南、广泛收集临床证据的同时，结合临床经验和中国国情，制定了《周围神经病理性疼痛诊疗中国专家共识》。由于在临床实践中N P病人存在独特性和差异性，未必完全与共识建议的情况一致，故医务人员在实际工作中可将本共识建议作为参考，根据病人个体情况进行独立判断和诊疗。 一、定义及分类 国际疼痛学会(IA S P) 将神经病理性疼痛(NP) 定义为：“由躯体感觉系统的损伤或者疾病而导致的疼痛。基于损伤或者疾
病的解剖位置可以分为周围神经病理性疼痛(pNP)和中枢神经病理性疼痛。周围神经病理性疼痛在临床中较常见，由周围神经损害而导致pN P的常见病因及综合征见表。 二、流行病学和卫生经济学数据 随着人口老龄化，pN P的发病率逐年增加。不同疾病导致的pN P的发病率各不相同。 痛性糖尿病周围神经病变(pai n fu l d i abe ti c peri ph e r al n e ur o pat h y, P DPN) 是糖尿病最常见的慢性并发症。16%的糖尿病病人受其影响，许多病人未被诊断(12.5%) 和未经治疗(39%)。2013年，我国2型糖尿病患病率高达10.4%，据此推算，约2200万病人受P DP N困扰。 带状疱疹后神经痛(po st h er petic ne ur algi a, P HN)也是常见的一种pNP，年发病率为3.9～42.0/10万。9%～34%的带状疱疹病人会发生P HN。我国城市医院皮肤科、神经科和疼痛科就诊≥40岁病人中，带状疱疹的总体患病率为7.7%，P HN 的总体患病率为2.3%，两者患病率均有随年龄增加而逐渐升高的趋势。 三叉神经痛是临床常见的颅神经疾病，患病率为182人/10万，年发病率为3～5/10万，多发生于成年及老年人，高峰年龄在48～59岁。 化疗诱发的周围神经病变(CI PN) 是一种常见的治疗相关并
神经病理性疼痛诊疗规范
神经病理性疼痛诊疗规范 概述 神经病理性疼痛（NP）是十分常见的一类慢性疼痛，与许多影响周围和中枢神经系统的疾病有关，除了熟知的三叉神经痛、带状疱疹后神经痛（PHN）、糖尿病痛性神经病（DPN）、酒精性神经痛外，也可见于脑卒中后、各类脊髓病变、各类周围神经病、帕金森病（PD）及多发性硬化（MS）等疾病。法国2008 年对 23 000 余例普通人群进行的流行病学调查发现，约31.70% 存在慢性疼痛，6.90% 具有符合神经病理性疼痛特点的慢性疼痛 1994年国际疼痛学会定义神经源性疼痛为“起源于外周或中枢神经系统的病变或功能障碍或短暂的脏器损伤所致的疼痛”，而其中去除“短暂的脏器损伤”一条即为神经病理性疼痛这一亚型。2001年，神经病理性疼痛重新简化定义为“来自外周或中枢神经系统的病变或功能紊乱所引起的疼痛”。 最近，国际疼痛学会（IASP）神经病理性疼痛学组对神经病理性疼痛疾病进行了重新定义：“神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接造成的疼痛。” 一、神经病理性疼痛的病因 神经病理性疼痛原因众多，包括从物理损伤到代谢性的复合性神经病变。它与临床症状之间关系复杂，大多数患者存在神经损伤时并无病理性疼痛，少部分患者却会在发生中枢或者外周神经损伤后出现极为严重的疼痛，并且长期存在。神经
病理性疼痛可因神经系统受无伤害的或有伤害的刺激及许多疾病所诱发，包括：①末梢或中枢神经系统损伤，如神经受压，截肢，碾碎伤及脊髓损伤；②带状疱疹感染后或有关HIV（human immunodeficiency virus人免疫缺陷病毒）的神经疼痛；③神经受压，如肿瘤压迫，腕管综合征；④代谢紊乱，如糖尿病性神经痛或尿毒症所致；⑤缺血，如血管梗死，脑卒中。神经病理性疼痛是由一组病因和表现不尽相同的疾病混合形成。表1-1为神经病理性疼痛的常见原因；表1-2为常见的导致神经病理性疼痛的一些病症。目前对于神经损伤后神经病理性疼痛个体敏感性的认识还不够，很难预测何种神经损伤的患者会发生异常的神经病理性疼痛。因此也无法清楚解释为何临床症状相似的患者，其疼痛程度和性质却各有差异。 二、神经病理性疼痛的分类 不论病因和病灶局部解剖如何，许多患者神经病理性疼痛的临床表现极为相似，主要的特征有：①继续存在的自发性疼痛；②疼痛出现于感觉神经病灶所破坏的区域；③阈下（温柔）刺激引起疼痛；④呈高兴奋性，对超阈刺激反应增强；⑤可有牵涉痛和刺激停止后持久
常见SD大鼠神经病理性疼痛模型研究
常见SD大鼠神经病理性疼痛模型研究 本文旨在总结常见SD大鼠神经病理性疼痛模型优缺点，为NP研究者提供模型选择参考。目前主流NP模型主要可分CCI、SNI、SNL、CCD模型四大类。四大类根据不同疾病的研究需要分不同小类，具体文中细述。 Abstract：This article aims to summarize the advantages and disadvantages of the common neuropathic pain model of SD rats and to provide a reference for NP researchers to choose the model.The current mainstream NP model can be divided into CCI，SNI，SNL，CCD model four categories.Four major categories according to different diseases need to be divided into different sub-categories，specific details of the article. Key words：NP；CCI；SNI；SNL；CCD 2011年国际疼痛研究学会对神经病理性疼痛定义：神经病理性疼痛是由于躯体感觉系统的损伤或疾病所引起的疼痛[1]。这病变原因可是创伤、压迫、感染、肿瘤、药物毒性或自身免疫性疾病等。SD大鼠坐骨神经病理性疼痛模型主要有CCI、SNI、SNL、CCD四大类，CCI衍生出bCCI、iCCI、分级坐骨神经缩窄模型，SNI衍生出mSNI，与SNL类似有pSNL和L5 VRT，CCD模型暂只有一种。 1 NP模型分类 1.1 CCI 慢性坐骨神经缩窄性损伤CCI模型[2]：备皮暴露神经，松扎坐骨神经主干4处，逐层缝合。成功标志：术后大鼠跛行，足呈轻度外翻状，出现舔舐、悬空等痛行为学表现，并呈现持续的疼痛状态。参考Bennett的CCI造模的文献约20篇，此处不一一列举。CCI在发展过程中衍生出bCCI、iCCI以及分级坐骨神經缩窄模型。 1.1.1 bCCI 薛照静等[3]与CCI模型不同的是双侧均需结扎。 1.1.2 iCCI 林露等[4]结扎坐骨神经前，用多孔胶片包裹结扎部位神经。 1.1.3分级坐骨神经缩窄模型陈晔凌等[5]大鼠分C、N0、N1、N2和N4组，参考Grace PM[6]方法。麻醉消毒后，暴露神经，距神经主干上端约8 mm环绕打疏松的、恰恰能沿神经上下滑动的单结。按组别排列N0、N1、N2和N4组对应着打0、1、2、4个互相间隔为1 mm的单结，再逐层缝合，在缝合过程中，根据单结个数在切口周围皮下对应置入5 mm 4、3、2、0段4-0铬制羊肠线，确保手术大腿羊肠线数量一致。余操作同CCI模型。 1.1.4 CCI、bCCI、iCCI 分级坐骨神经缩窄模型比较机理上，CCI类被认为结扎神经远侧端出现脱髓鞘病变，退化的Schwann细胞产生刺激神经的细胞因
神经病理性疼痛发病机制研究进展.
神经病理性疼痛发病机制研究进展 袁维秀解放军总医院麻醉科解剖学病因神经病理性疼痛起源于神经系统的损伤，其本质是一种伤害感受，包括骨关节炎和炎性疼痛等。病因包括自身免疫性疾病（如多发性硬化）、代谢性疾病（如糖尿病性神经痛）、感染（如带状疱疹）、血管性疾病、创伤和肿瘤等。并非所有涉及伤害感受通路的损伤都能引起疼痛，单纯切断脊神经背根几乎不会引发持续性疼痛[1]，但脊髓损伤确实有诱发疼痛的风险。Vireck等发现灵长类动物切断脊髓丘脑外侧束，仅损伤脊髓白质时不产生异常疼痛行为，而损伤脊髓灰质部分则产生疼痛[2]。脑干和丘脑损伤涉及伤害感受通路时可引起疼痛[3]。中枢神经系统疾病伴发的疼痛许多中枢神经系统疾病可伴有疼痛症状，表现为持续性疼痛或痛觉过敏，一些病人轻微的四肢温度降低即出现痛觉过敏现象。Mitchell 称之为“皮肤烧灼痛”的临床表现为：水肿、异常出汗、皮肤温度升高或降低，剧烈的自发性疼痛，不伴有明确神经损伤的称为“复杂性区域疼痛综合征（CRPS）1 型”，伴有神经损伤的称为CRPS2型。三叉神经痛是一种典型的神经病理性疼痛，表现为面部发作性剧烈疼痛，发作间歇期无或仅有轻微疼痛，轻触皮肤可诱发疼痛发作，其病因与神经根进入脑干部位的机械变形有关，神经根受压部位出现脱髓鞘现象。血管变异引起神经受压也是常见病因之一[4]。糖尿病性神经痛是一种典型的神经病理性疼痛，表现为双侧足趾的烧灼样痛。水痘病毒感染后激活带状疱疹病毒，后者侵犯脊髓背根神经节，该神经节支配区域皮肤出现持续性疼痛，即使切断支配该区域的c纤维疼痛依然存在。神经病理性疼痛动物模型自从制作大鼠坐骨神经松结扎模型后，有关神经病理性疼痛的研究取得了长足的进步。Chung等发明了脊神经切断大鼠模型（SNL），保留支配足趾的部分神经，记录相邻脊神经的传入冲动。糖尿病模型是通过注射连脲酶素，动物表现与人类神经痛相似。最近又发明了紫杉醇-长春新碱诱发的神经病理性疼痛模型。动物持续性疼痛的测定较为困难，大鼠后肢去神经支配后可出现自残行为，采用细胞内标记物神经元活性的增加，如脊髓背角即刻早期基因蛋白c-fos表达的增加，可用以评估持续性疼痛。功能性核磁成像（fMRI）和/或PET 成像技术将成为可能的测定手段。继发性痛觉过敏及中枢敏感化皮肤损伤后产生持续性疼痛和痛觉过敏，原发性痛觉过敏发生在组织损伤部位，部分由初级伤害性感受器调节，表现为热刺激的反应增强。继发性痛觉过敏发生在损伤周围的正常组织，表现为对机械刺激的反应增强，如轻触刺激诱发疼痛，与人体神经病理性疼痛的痛觉过敏相似，与中枢敏感化有关。有研究发现触痛来自 Aβ纤维出入冲动引发的中枢敏感化，而刺痛来源于对辣椒素不敏感的Aδ伤害感受器[5]。触觉纤维聚集在脊髓背角，该部位接受初级神经纤维的伤害性冲动传入。初级传入纤维的作用药理学研究发现初级传入纤维在神经病理性疼痛的形成过程中具有重要作用。例如，静脉?予AM1241，一种选择性大麻素受体（CB2）激动剂，可以逆转 SNL损伤后的机械和热痛觉过敏。由于CB2在CNS 不表达，其作用可能是通过外周机制[6]。反义寡核苷酸（6DNs）可直接拮抗Nav1.8，从而逆转机械性痛敏。Nav1.8 是一种河豚毒素拮抗钠通道，仅在初级传入小细胞上表达，即使神经损伤6-14d，应用6DNs 仍然有效，说明持续性外周神经冲动的传入参与了神经病理性疼痛的维持过程。神经损伤的局部会形成神经瘤，已经证实对机械、热和化学刺激产生的自发性和异常电位活动起源于创伤性神经瘤[7]。有报道SNL 大鼠L5 背根A 纤维出现自发性活动，这种自
神经病理性疼痛的药物治疗-修改稿
神经病理性疼痛的药物治疗 神经病理性疼痛是一个持续进展的过程，早期进行药物干预，可能达到阻止疾病进展的目的。认识神经病理性疼痛的机制是治疗的关键，外周和中枢敏化是许多临床疼痛综合征产生的主要原因，是治疗的重要靶点，但如果疼痛机制完全在于中枢，则仅治疗外周敏化可能是无益的。目前，神经病理性疼痛的药物治疗虽不够理想，仅有约少于50%的患者可能通过药物治疗达到较满意的疼痛控制效果，但仍是主要的治疗手段。药物治疗应建立在明确诊断的基础上，并认真评估治疗前后的症状体征和治疗反应。应同时治疗相关疾病，注意对以往治疗的反应及可能影响治疗的合并疾病。注意抑郁、焦虑、睡眠障碍、躯体功能改变和神经病理性疼痛对患者生活质量的影响。停药是试探性的，并采取逐步减量的方法。停药应建立在有效、稳定治疗效果的基础上。 2010年IASP和EFNS最新版指南推荐的神经病理性疼痛一线药物包括钙离子通道α δ配体药物如普瑞巴林和加巴喷丁，三环类抗抑郁药和局部病损时的 2 局部利多卡因贴剂。二线药物包括阿片类镇痛药和曲马多。当一线药物单独或联合使用效果不满意时，可使用阿片镇痛药或曲马多，或将这些药物和一线药合用。三线药物包括其他抗癫痫药(如拉莫三嗪、托吡酯)、抗抑郁药(如度洛西汀、文拉法辛)，NMDA受体拮抗剂及局部辣椒素等。 神经病理性疼痛治疗药物的选择应考虑药物的疗效/安全比和患者的临床情况(如：并发症、禁忌症、合并用药情况等)，药物选择应个体化，不同种类药物，作用机制可能不同，各种药物的主要作用机制和主要应用事项见附表。 一、钙通道调节剂(普瑞巴林和加巴喷丁) δ亚基，减少谷氨酸、去甲肾上腺素和P 两者均作用于电压门控钙通道α 2 物质释放。除可能减轻疼痛外也可改善患者睡眠和情绪。药物的吸收受食物影响较小，不与血浆蛋白结合，基本不经肝脏代谢，没有重要的临床药物相互作用。副作用主要为剂量依赖的嗜睡和头晕，肾功能不全的患者应减量。 普瑞巴林具有显著的镇痛及广泛抗焦虑作用，是目前治疗糖尿病周围神经痛（pDPN）具有A级证据的药物(2011年美国神经病学会、美国神经肌肉和电子诊断医学会及物理医学与康复学会等共同发布的《糖尿病神经病变疼痛处理指
神经病理性疼痛发病机制研究进展(一)
神经病理性疼痛发病机制研究进展(一) 解剖学病因 神经病理性疼痛起源于神经系统的损伤，其本质是一种伤害感受，包括骨关节炎和炎性疼痛等。病因包括自身免疫性疾病（如多发性硬化）、代谢性疾病（如糖尿病性神经痛）、感染（如带状疱疹）、血管性疾病、创伤和肿瘤等。 并非所有涉及伤害感受通路的损伤都能引起疼痛，单纯切断脊神经背根几乎不会引发持续性疼痛1]，但脊髓损伤确实有诱发疼痛的风险。Vireck等发现灵长类动物切断脊髓丘脑外侧束，仅损伤脊髓白质时不产生异常疼痛行为，而损伤脊髓灰质部分则产生疼痛2]。脑干和丘脑损伤涉及伤害感受通路时可引起疼痛3]。 中枢神经系统疾病伴发的疼痛 许多中枢神经系统疾病可伴有疼痛症状，表现为持续性疼痛或痛觉过敏，一些病人轻微的四肢温度降低即出现痛觉过敏现象。Mitchell称之为“皮肤烧灼痛”的临床表现为：水肿、异常出汗、皮肤温度升高或降低，剧烈的自发性疼痛，不伴有明确神经损伤的称为“复杂性区域疼痛综合征（CRPS）1型”，伴有神经损伤的称为CRPS2型。 三叉神经痛是一种典型的神经病理性疼痛，表现为面部发作性剧烈疼痛，发作间歇期无或仅有轻微疼痛，轻触皮肤可诱发疼痛发作，其病因与神经根进入脑干部位的机械变形有关，神经根受压部位出现脱髓鞘现象。血管变异引起神经受压也是常见病因之一4]。 糖尿病性神经痛是一种典型的神经病理性疼痛，表现为双侧足趾的烧灼样痛。水痘病毒感染后激活带状疱疹病毒，后者侵犯脊髓背根神经节，该神经节支配区域皮肤出现持续性疼痛，即使切断支配该区域的c纤维疼痛依然存在。 神经病理性疼痛动物模型 自从制作大鼠坐骨神经松结扎模型后，有关神经病理性疼痛的研究取得了长足的进步。Chung等发明了脊神经切断大鼠模型（SNL），保留支配足趾的部分神经，记录相邻脊神经的传入冲动。糖尿病模型是通过注射连脲酶素，动物表现与人类神经痛相似。最近又发明了紫杉醇-长春新碱诱发的神经病理性疼痛模型。 动物持续性疼痛的测定较为困难，大鼠后肢去神经支配后可出现自残行为，采用细胞内标记物神经元活性的增加，如脊髓背角即刻早期基因蛋白c-fos表达的增加，可用以评估持续性疼痛。功能性核磁成像（fMRI）和/或PET成像技术将成为可能的测定手段。 继发性痛觉过敏及中枢敏感化 皮肤损伤后产生持续性疼痛和痛觉过敏，原发性痛觉过敏发生在组织损伤部位，部分由初级伤害性感受器调节，表现为热刺激的反应增强。继发性痛觉过敏发生在损伤周围的正常组织，表现为对机械刺激的反应增强，如轻触刺激诱发疼痛，与人体神经病理性疼痛的痛觉过敏相似，与中枢敏感化有关。有研究发现触痛来自Aβ纤维出入冲动引发的中枢敏感化，而刺痛来源于对辣椒素不敏感的Aδ伤害感受器5]。触觉纤维聚集在脊髓背角，该部位接受初级神经纤维的伤害性冲动传入。 初级传入纤维的作用 药理学研究发现初级传入纤维在神经病理性疼痛的形成过程中具有重要作用。例如，静脉给予AM1241，一种选择性大麻素受体（CB2）激动剂，可以逆转SNL损伤后的机械和热痛觉过敏。由于CB2在CNS不表达，其作用可能是通过外周机制6]。反义寡核苷酸（6DNs）可直接拮抗Nav1.8，从而逆转机械性痛敏。Nav1.8是一种河豚毒素拮抗钠通道，仅在初级传入小细胞上表达，即使神经损伤6-14d，应用6DNs仍然有效，说明持续性外周神经冲动的传入参与了神经病理性疼痛的维持过程。 神经损伤的局部会形成神经瘤，已经证实对机械、热和化学刺激产生的自发性和异常电位活动起源于创伤性神经瘤7]。
神经病理性疼痛的定义和病因
神经病理性疼痛的定义和病因 1994年国际疼痛学会定义神经源性疼痛为“起源于外周或中枢神经系统的病变或功能障碍或短暂的脏器损伤所致的疼痛”，而其中去除“短暂的脏器损伤”一条即为神经病理性疼痛这一亚型。2001年，神经病理性疼痛重新简化定义为“来自外周或中枢神经系统的病变或功能紊乱所引起的疼痛”。 一、神经病理性疼痛的病因 神经病理性疼痛原因众多，包括从物理损伤到代谢性的复合性神经病变。它与临床症状之间关系复杂，大多数患者存在神经损伤时并无病理性疼痛，少部分患者却会在发生中枢或者外周神经损伤后出现极为严重的疼痛，并且长期存在。神经病理性疼痛可因神经系统受无伤害的或有伤害的刺激及许多疾病所诱发，包括：①末梢或中枢神经系统损伤，如神经受压，截肢，碾碎伤及脊髓损伤；②带状疱疹感染后或有关HIV（human immunodeficiency virus人免疫缺陷病毒）的神经疼痛；③神经受压，如肿瘤压迫，腕管综合征；④代谢紊乱，如糖尿病性神经痛或尿毒症所致；⑤缺血，如血管梗死，脑卒中。神经病理性疼痛是由一组病因和表现不尽相同的疾病混合形成。表1-1为神经病理性疼痛的常见原因；表1-2为常见的导致神经病理性疼痛的一些病症。目前对于神经损伤后神经病理性疼痛个体敏感性的认识还不够，很难预测何种神经损伤的患者会发生异常的神经病理性疼痛。因此也无法清楚解释为何临床症状相似的患者，其疼痛程度和性质却各有差异。 表1-1 神经病理性疼痛的病因
表1-2 常见的引发神经病理性疼痛的相关病症 二、神经病理性疼痛的分类 不论病因和病灶局部解剖如何，许多患者神经病理性疼痛的临床表现极为相似，主要的特征有：①继续存在的自发性疼痛；②疼痛出现于感觉神经病灶所破坏的区域；③阈下（温柔）刺激引起疼痛；④呈高兴奋性，对超阈刺激反应增强； ⑤可有牵涉痛和刺激停止后持久存在的疼痛；⑥常包含交感神经活动。神经病理性疼痛常根据病因学诊断（如：糖尿病神经病变、带状疱疹后遗痛、创伤后神经痛）或神经病变的解剖学位置（中枢痛或外周神经痛）来分类。 按照机制方面更为详尽的分类目前还不可行。例如，外周神经损伤时，很大范围的神经支配区域会发生机械痛觉超敏，但目前尚不能指出精确全面的相关机制。目前有一部分动物模型和人类研究提出一些与之相关的或单独存在或共同起作用的可能病理生理学机制来解释此现象：①Aδ/C纤维相关的外周敏化作用； ②某些沉默伤害感受器的激活；③外周神经机械感受以及伤害感受传入神经之间的假突触传递；④Aβ纤维介导的脊髓背根神经功能抑制的缺失；⑤中枢敏化；
神经病理性疼痛的发病机制及其临床意义
神经病理性疼痛的发病机制及其临床意义 概述 疼痛是身体对正在进行或即将发生的组织损伤做出的警告，是机体的一种保护性机制。根据在2011年，美国一个医学研究所发布的报告指出：三分之一的美国人经历着慢性疼痛，这个比例比心脏病、癌症、糖尿病患者的总和还要多。在欧洲，慢性疼痛的发生率是25-30％。在所有慢性疼痛患者中，大概有五分之一的患者患有神经病理性疼痛。 以发病机制为基础的治疗原理 慢性疼痛患者，特别是神经病理性疼痛患者发病率如此之高，其主要原因是缺乏有效的治疗方法。对非神经病理痛患者疗效显著的基础药物，非甾体类抗炎药、阿片类药物在对神经病理性疼痛患者进行治疗时，只对少数人群起到作用而且疗效甚微，导致该结果的主要原因在于没有精确地了解神经病理性疼痛的发病机制。一般来说，针对发病机制而采用的疼痛治疗方法要明显优于仅针对病因的治疗。这也是为什么很多药物在临床前期实验中可以起到很好的疗效，而在临床应用时却收效甚微的原因。在过去的十年里，已有几篇文献综述分析了神经病理性疼痛的发病机制，其中大部分都是针对神经科学家的，然而，让临床医师理解其发病机制也相当重要，因为他们可以引导未来的研究方向，并指导临床实践。 生理学与分类 身体组织损伤后产生疼痛需要四个基本要素： 转导：伤害性感受器将伤害性刺激转化为伤害性信号。 传递：将伤害性信号从伤处沿神经纤维传递至中枢神经系统。 转变或重塑：在突触水平和中枢神经系统水平通过上行、下行或者局部易化和抑制的转变调节伤害性信号。 感知：整合认知和情感对伤害性信号的应答，是临床上疼痛的重要成分。 虽然可以将所有疼痛定义为同一概念，但这过于简单。实际上疼痛可以分为很多类型，且每种类型具有不同的神经生物学和病理生理学机制。最常见的是将疼痛分为两种主要类型：神经病理性疼痛和伤害感受性疼痛。这种分型极为重要，因为它不仅反映疼痛的病因，更能指导后续治疗。 伤害性疼痛又可被分为躯体性疼痛和内脏性疼痛。由于伤害感受器在躯体组织分布较多，因此慢性躯体疼痛一般很容易定位，经常由于退行性变所致（如关节炎）。相反，内脏则对传统的疼痛刺激（如切割、烧灼)不敏感，但对缺血、炎症、梗阻等非常敏感。 神经病理性疼痛是指躯体感觉系统的损伤或功能障碍所引起的疼痛。在此类疼痛中，组织损伤直接影响神经系统，导致绕过转导的异位放电的发生。 情感与生理
神经病理性疼痛诊疗专家共识(全文)
神经病理性疼痛诊疗专家共识（全文） 一、定义及分类 国际疼痛学会(International Association for theStudy of Pain，IASP)于1994年将神经病理性疼痛（Neuropathic Pain，NP）定义为：“由神经系统的原发损害或功能障碍所引发或导致的疼痛 （Pain initiated or caused by a primary lesion or dysfunction in the nervous system）。2008年，IASP神经病理性疼痛特别兴趣小组（NeuPSIG）将该定义更新为：“由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛” (neuropathic pain is defined as pain caused by a lesion ordisease o f the somatosensory system)。 新定义发生了如下重要变化：①用“损害”或“疾病”取代了“功能障碍”。 ②用“躯体感觉系统”取代了“神经系统”，使其定位更加明确。 以往中文名称有神经源性疼痛、神经性疼痛、神经病性疼痛等，为了确切反映以上定义并兼顾中文语言习惯，建议将其统一称为“神经病理性疼痛”。神经病理性疼痛分为周围性和中枢性两种类型，不同类型的疼痛具有相似或共同的发病机制。常见的神经病理性疼痛类型见表1。 表1 神经病理性疼痛的常见类型
以上表内疾病的定义和分类并非毫无争议，例如，交感相关性疼痛如复杂性区域疼痛综合征I型（CRPS-I）、纤维肌痛症（FMS）、内脏痛等，按新定义不属于神经病理性疼痛范畴，但在临床上仍然参照神经病理性疼痛来治疗。 二、流行病学和疾病负担 NeuPSIG认为神经病理性疼痛患病率约为3.3％～8.2％。另一项来自欧洲的研究资料显示，一般人群的神经病理性疼痛患病率高达8.0％。以此数据推算，我国目前神经病理性疼痛的患者约有9000万。尽管国内尚无针对神经病理性疼痛患者生存质量的系统性研究数据，但神经病理性疼痛对患者的生活质量的影响是显而易见的。长期疼痛不但会影响患者的睡眠、工作和生活能力，还会增加抑郁、焦虑等情感障碍的发病率。有研究表明：带状疱疹后神经痛患者的生活质量得分约为正常人群的1/2。 三、病因 神经病理性疼痛的产生有很多原因，包括从物理、化学损伤到代谢性复合性神经病变。 尽管患者的临床症状相似，但其病因却各不相同。外伤、代谢紊乱、感染、中毒、血管病变、营养障碍、肿瘤、神经压迫、免疫与遗传等多种
神经病理性疼痛的药物治疗
神经病理性疼痛的药物治疗……毛庆祥刘林译王景阳审 “神经病理性疼痛”在本质上与“伤害感受性疼痛”有所不同。伤害感受性疼痛由伤害感受器被激活（介导）并沿固定的通路传递电化学冲动到达较高级的背角中枢而引起，其传入有害冲动的调节发生在脊髓水平。神经病理性疼痛则与之相反，其出现可提示体内已有神经组织损害，虽没有固定的通路，但原先存在的通路可能已遭损坏。受损神经元或高级神经元的自然放电，与神经病理性疼痛的发生有着密切的关系，鉴于中枢神经系统的可塑性，这些改变可以持续很久。尽管伤害感受性与神经病理性疼痛有着上述的基本不同，但各自分担着某些传导、传递和调节生理进程方面的工作。 伤害感受器通过神经系统传递有害冲动，与非伤害性感受器的传递不同。伤害感受器传递有害冲动有两个特点：①刺激阈值比非伤害感受器者高；②有“致敏”可能。致敏是指刺激阈值降低而对该刺激的反应程度增加。末梢伤害感受器和中枢伤害感受器都可能被致敏。? 关于中枢致敏或背角神经元反应上调已有较多的描述。兴奋性氨基酸（谷氨酸和天门冬氨酸）和神经肽（P物质、降钙素相关基因肽和神经激肽A）的释放分别激活AMPA和NK-1受体。这些受体的激活可为NMDA受体激活作准备。NMDA 受体激活可以耦联释放第二信使，从而引起脊髓背角内广动力范围型神经元改变。这些改变包括激发加大和持续时间增加，激发阈值降低和感受区域扩大，其影响可引起长时间强化，从而导致慢性疼痛状态的产生[1]。 目前用于治疗神经病理性疼痛的药物已有较多，本文从疼痛发生机理出发，探讨治疗神经病理性疼痛的较适宜药物。采用抑制末梢和（或）中枢致敏的药物，以及调节下行抑制系统的药物，可以治疗神经病理性疼痛。下文将可能有效的药物进行机械分类，期望对大量模糊的认识得到进一步了解。 1 抑制外周致敏的药物?