蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用

生物技术通讯

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７

综述

文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３

蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用

李敏，周慧，崔银秋

吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１

［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限

性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修

饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。

［关键词］蛋白质组学；信号转导

［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ

ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ

ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ

ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－

ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ

ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－

ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。

１信号蛋白的寻找和确定

细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。

２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶

［收稿日期］２００６－０８－３０

［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３）

［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生

［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

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图１质谱方法分析磷酸化肽的不同策略

解，接着对酶解产物进行第一向离子交换色谱（ＩＥＸ）和第二向反向色谱（ＲＰＣ），最后用ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ测序。目前该技术作为双向电泳的有利补充正越来越多地被人们应用。

２信号蛋白的定量

研究细胞内的信号转导过程，不仅要确定表达类型改变的

蛋白，还要对许多在表达水平上有所变化的蛋白进行定量。在传统的定量方法中，研究者主要利用同位素标记（１８Ｏ，１５Ｎ，３２Ｐ）结合质谱等方法来定量特殊表达的信号分子，但是由于它们难以操作且造价昂贵而逐渐被人们舍弃。１９９９年，Ｇｙｇｉ等［４］利用稳定同位素稀释原理发明了同位素亲和标签（ｉｓｏｔｏｐｅｃｏｄｅｄａｆｆｉｎｉｔｙ

ｔａｇ，ＩＣＡＴ）技术，它利用质量差异确定的同位素分别标记差异表

达的蛋白，可实现对蛋白质的定量。这种新方法的建立为利用蛋白质组学研究信号转导提供了一个广阔的空间。ＩＣＡＴ技术结合

ＭｕｄＰＩＴ，已经被成功地用于许多领域，来反映由于信号分子的作

用而引起的胞内信号蛋白表达与调节的变化，Ｓｈｉｉｏ等［５］就利用该方法分析了鼠成纤维细胞中５２８种蛋白在ｃ－ｍｙｃ信号转导中的差异表达，其中１／３以上显示了超过２倍的蛋白丰度改变。最近又开发了细胞培养中的稳定性同位素氨基酸技术（ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅ

ｌａｂｅｌｉｎｇｂｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＩＬＡＣ），该方法通过将一

些非放射性的、同位素标记的必需氨基酸加入氨基酸缺陷的培养基中，在细胞生长时就自动并入蛋白中，之后再用质谱检测其相对丰度。这种方法操作较简便，费用低廉，并可以对培养细胞中的全蛋白精确定量［６］。

３磷酸化修饰的识别

在信号转导过程中，许多蛋白通过化学修饰来传递胞内信

号通路并参与调节细胞的功能。迄今，文献报道的翻译后修饰（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＰＴＭｓ）形式已有２００余种，如磷酸化、糖基化、法尼基化和蛋白遍在化等。几乎５０％的蛋白含有

一种或多种修饰作用来控制或调节它们的功能。由于磷酸化修饰在胞内信号转导过程中具有“分子开关”的作用，许多信号途径的完成是通过某些关键蛋白的磷酸化来达到的，因而蛋白的磷酸化修饰逐渐成为研究的核心。

细胞内全部蛋白质大约有１／３时间处于磷酸化状态，且主要以磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的形式存在。由于磷酸化蛋白的短暂存在、丰度较小等特点，使得它的富集和检测都变得比较困难。在传统方法中，人们通常采用磷酸化肽特异性抗体或３２Ｐ标记来富集磷酸化蛋白，然而由于抗体的造价昂贵且难以生产、

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Ｐ标记引入了放射性且不易操作，使得在实验中产生许多困难。

随着质谱技术的飞速发展，人们摸索出一系列以质谱为主要检测手段，结合传统生化技术来检测和定位磷酸化蛋白质的方法，更加方便和准确。图１［７］描述了这些方法的主要流程。在磷酸化肽富集方法中，固定化金属亲和层析（ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄｍｅｔａｌａｆｆｉｎｉｔｙ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＩＭＡＣ）［８］目前较多被人们采用。磷酸基团与螯合

在固相支持物上的金属离子（通常是Ｆｅ３＋或Ｇａ３＋，也有人用Ｃｕ２＋）通过离子对的相互作用被吸附，然后再洗脱下来。该方法在大通量分析蛋白质磷酸化作用方面有着广泛的前景。利用亲和色谱的方法，许多生物公司还开发了一些磷酸化蛋白纯化试剂盒，方便了人们的使用。图１还介绍了一种Ｅｄｍａｎ降解的方法，未用到质谱，它利用Ｅｄｍａｎ磷酸基（３２Ｐ标记）释放测序的办法来检测磷酸基位点，结合生物信息学工具，也可以对磷酸化肽进行较好的分析［９］。

４蛋白之间相互作用研究

在信号传递过程中，各种分子很少单独起作用，它们通常与

胞内许多其他分子相互作用形成蛋白复合物来完成生物学功能。因此，我们要研究信号转导的详细过程，就必须弄清这些复合物的组成分子及其功能。在体外建立的最好的研究蛋白质之间相互作用的方法是酵母双杂交分析系统。但是该系统不能检测相互作用的翻译后修饰，且其反映的只是相互作用的可能性，这种可能还需通过其他方法验证。近几年来，

利用蛋白质组学的

李敏等：蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用３３７

生物技术通讯

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７方法研究蛋白之间的相互作用发展很快。最有效的是串联亲和

纯化技术（ｔａｎｄｅｍ－ａｆｆｉｎｉｔｙｐｒｕｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＴＡＰ），ＴＡＰ技术是在没有破坏目的蛋白调控序列的基础上，于其一端或中部嵌入一段蛋白质标记（ＴＡＰｔａｇ），再经２步特异性的亲和纯化，与目标蛋白发生相互作用的蛋白质便可一起被洗脱下来，所得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Ｅｄｍａｎ降解法进行鉴定［１０］（图２）。该技术提高了特异性，降低了背景蛋白的污染，获得了巨大突破。利用该技术已经对酵母细胞的蛋白质相互作用进行了大规模研究，最近又成功地用于分析果蝇的蛋白质组，验证了一些已知Ｎｏｔｃｈ信号通路中关键的相互作用，并发现了许多新的相互作用［１１］。

蛋白质微阵列技术，又称抗体微阵列技术，作为定位蛋白质、研究蛋白之间相互作用和生物功能的大规模方法正越来越多地被人们利用。抗体微阵列是将特异性抗体非共价地固定在一个固体支持物表面，当细胞溶解物或血清的混合物流过该表面时，抗原就特异性地结合在相应的抗体上。结合的抗原通过荧光标记、放射性或抗原的第二抗体来检测［１２］。但目前微阵列技术在确定蛋白图谱的数量上还是有限的，还需要生物信息学的发展对其做出进一步改善。

５展望

研究细胞内信号转导过程，二维凝胶电泳－质谱－生物信息学是目前最前沿和较可靠的技术平台，国际上也日益开始重视以色谱－电泳－质谱为基础的技术平台。尽管蛋白质组学的相关技术在操作自动化、检测灵敏度等方面存在缺陷，但其在未来的生命科学研究及医药开发中将占有越来越重要的地位。随着样品制备、高通量自动分析、质谱技术及生物信息学领域的进步，蛋白质组学的研究也将更加系统，应用更加广泛。参考文献

［１］李小娟，付玉芹，高贵，等．ａＦＧＦ拮抗剂对３Ｔ３细胞蛋白质组影响的研究［Ｊ］．高等学校化学学报，２００４，２８（３）：３３８

［２］李蕾，应万涛，杨何义，等．蛋白质组研究中的二维电泳分离技术［Ｊ］．色谱，２００３，２１（１）：２７

［３］ＷｏｌｔｅｒｓＤＡ，ＷａｓｈｂｕｍＭＰ，ＹａｔｅｓＪＲ．Ａｎａｕｔｏｍａｔｅｄｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎ－ｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｓｈｏｔｇｕｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００１，７３：５６８３

［４］ＧｙｇｉＳＰ，ＲｉｓｔＢ，ＧｅｒｂｅｒＳＡ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｍ－ｐｌｅｘｐｒｏｔｅｉｎｍｉｘｔｕｒｅｓｕｓｉｎｇｉｓｏｔｏｐｅ－ｃｏｄｅｄａｆｆｉｎｉｔｙｔａｇｓ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１７（１０）：９９４

［５］ＳｈｉｉｏＹ，ＤｏｎｏｈｏｅＳ，ＹｉＥＣ，ｅｔａｌ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｙｃｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，２００２，２１：５０８８

［６］ＯｎｇＳＥ，ＢｌａｇｏｅｖＢ，Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ，ｅｔａｌ．Ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇｂｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＩＬＡＣ，ａｓａｓｉｍｐｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅａｐｐｒｏａｃｈｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２，１（５）：３７６

［７］ＲｅｉｎｄｅｒｓＪ，ＬｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉＵ，ＭｏｅｂｉｕｓＪ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００４，４（１２）：３６８６［８］ＰｏｒａｔｈＪ，ＣａｒｌｓｓｏｎＪ，ＯｌｓｓｏｎＩ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔａｌｃｈｅｌａｔｅａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏ－ｍｏａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５８：５９８

［９］ＭａｃｄｏｎａｌｄＪＡ，ＭａｃｋｅｙＡＪ，ＰｅａｒｓｏｎＷＲ，ｅｔａｌ．Ａｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２，１（４）：３１４

［１０］ＧｉｎｇｒａｓＡＣ，ＡｅｂｅｒｓｏｌｄＲ，ＲａｕｇｈｔＢ，ｅｔａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．ＪＰｈｙｓｉｏｌ，２００５，５６３（Ｐｔ１）：１１

［１１］ＶｅｒａｋｓａＡ，ＢａｕｅｒＡ，ＴｓａｋｏｎａｓＳＡ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍ－ｐｌｅｘｅｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｗｉｔｈｔａｎｄｅｍａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｍａｓｓｓｐｅｃ－ｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．ＤｅｖｅｌｏｐＤｙｎａｍｉｃｓ，２００５，２３２：８２７

［１２］ＨｅｎｇＺ，ＭｅｔｉｎＢ，ＭｉｃｈａｅｌＳ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，２００３，７２：７８３

图２亲和标记检测蛋白复合物的一般流程３３８

细胞信号转导练习题

细胞信号转导练习题 选择题：正确答案可能不止一个 1. NO直接作用于(B) A.腺苷酸环化酶 B.鸟苷酸环化酶 C.钙离子门控通道D．PKC 2.以下哪一类细胞可释放NO( B) A.心肌细胞 B.血管内皮细胞 C.血管平滑肌细胞 3.硝酸甘油作为治疗心绞痛的药物是因为它( C) A.具有镇痛作用 B.抗乙酰胆碱 C.能在体内转换为NO 4.胞内受体(A B) A.是一类基因调控蛋白 B.可结合到转录增强子上 C.是一类蛋白激酶 D.是一类第二信使 5.受体酪氨酸激酶RPTK( A B C D) A.为单次跨膜蛋白 B.接受配体后发生二聚化 C.能自磷酸化胞内段 D.可激活Ras 6. Sos属于(B) A.接头蛋白（adaptor protein） B.Ras的鸟苷酸交换因子（GEF） C.Ras的GTP酶活化蛋白（GAP）D：胞内受体 7.以下哪些不属于G蛋白(C)

A.Ras B.微管蛋白β亚基 C.视蛋白 D. Rho 8. PKC以非活性形式分布于细胞溶质中，当细胞之中的哪一种离子浓度升高时，PKC转位到质膜内表面(B) A.镁离子 B.钙离子 C.钾离子 D.钠离子 9.Ca2+载体——离子霉素（ionomycin）能够模拟哪一种第二信使的作用(A) A.IP3 B.IP2 C.DAG D.cAMP 10.在磷脂酰肌醇信号通路中，质膜上的磷脂酶C（PLC-β）水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），产生哪两个两个第二信使(A B) A.1，4，5-三磷酸肌醇（IP3） B.DAG C.4，5-二磷酸肌醇（IP2） 11.在磷脂酰肌醇信号通路中，G蛋白的直接效应酶是(B) A.腺苷酸环化酶 B.磷脂酶C-β C.蛋白激酶C D. 鸟苷酸环化酶 12.蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）由两个催化亚基和两个调节亚基组成，cAMP能够与酶的哪一部分结合？(B) A.催化亚基 B.调节亚基 13.在cAMP信号途径中，环腺苷酸磷酸二酯酶（PDE）的作用是(C) A.催化ATP生成cAMP B.催化ADP生成cAMP C.降解cAMP生成5’-AMP 14.在cAMP信号途径中，G蛋白的直接效应酶是(B)

细胞信号通路大全

1 PPAR信号通路：过氧化物酶体增殖物激活受体( PPARs) 是与维甲酸、类固醇 和甲状腺激素受体相关的配体激活转录因子超家族核激素受体成员。它们作为脂 肪传感器调节脂肪代谢酶的转录。PPARs由PPARα、PPARβ和PPARγ 3种亚型组成。PPARα主要在脂肪酸代谢水平高的组织，如：肝、棕色脂肪、心、肾和骨骼肌表达。他通过调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括能量代谢、生 长发育等。另外，他还通过调节脂质代谢的生物感受器而调节细胞生长、分化与 凋亡。PPARa同时也是一种磷酸化蛋白，他受多种磷酸化酶的调节包括丝裂原激活蛋白激酶( ERK-和p38．M APK) ，蛋白激酶A和C( PKA，PKC) ，AM PK和糖原合成酶一3( G SK3) 等调控。调控PPARa生长信号的酶报道有M APK、PKA和G SK3。PPARβ广泛表达于各种组织，而PPAR γ主要局限表达在血和棕色脂肪，其他组织如骨骼肌和心肌有少量表达。PPAR-γ在诸如炎症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和糖代谢调节，以及肿瘤和肥胖等方面均有着举足轻重的作用， 而其众多生物学效应则是通过启动或参与的复杂信号通路予以实现。鉴于目前人 们对PPAR—γ信号通路尚不甚清，PPARs通常是通过与9-cis维甲酸受体( RXR)结合实现其转录活性的。 2 MAPK信号通路:mapk简介:丝裂原激活蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）是广泛存在于动植物细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。作用主要是将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞的生物化学反应（增殖、分化、凋亡、应激等）。 MAPKs家族的亚族 :ERKs（extracellular signal regulated kinase)：包括ERK1、ERK2。生长因子、细胞因子或激素激活此通路，介导细胞增殖、分化。 JNKs(c-Jun N-terminal kinase)包括JNK1、JNK2、JNK3。此亚族成员能使 Jun转录因子N末端的两个氨基酸磷酸化而失活，因此称为Jun N末端激酶(JNKs)。物理、化学的因素引起的细胞外环境变化以及致炎细胞因子调节此通路。P38 MAPKs：丝氨酸/络氨酸激酶，包括p38 α、p38β、p38γ、p38δ。p38 MAP K参与多种细胞内信息传递过程 ,能对多种细胞外刺激发生反应,可磷酸化其它细胞质蛋白,并能从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性来改变基因的表达水平 ,从而介导细胞生长、发育、分化及死亡的全过程。 ERK5:是一种非典型的MAPK通路，也叫大MAPK通路，只有一个成员。它可被各种刺激因素激活。不仅可以通过磷酸化作用使底物活化，并且通过C端的物理性结合作用激活底物。 3 ERBB信号途径:ErbB 蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的 EGF 受体家族成员。ErbB 的命名来源于在禽红白血病 B( v-Erb-B) 发现的 EGF 受体的突变体,因而 EGF 受体 亦称为“ ErbB1”。人源 ErbB2 称为HER2, 特指人的 EGF 受体。ErbB 家族的

(完整版)细胞信号转导研究方法

细胞信号转导途径研究方法 一、蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图：

2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）

Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、GST pull-down assay GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

细胞信号转导习题及答案

第七章细胞信号转导 一、英译中(Translate) 1.primary messenger（） 2.calcium homeostasis（） 3. cell surface receptor（） 4. protein kinase,PK（） 5. ion-channel-linded receptor（） 6. adenylyte cyclase（） 7. diacylglycerol,DAG（） 8. calcium-dependent protein kinase,CDPK（） 9. heterotrimeric GTP binding protein（） 10.cross talk（） 11.extracellular domain（） 12.amplitude modulation（） 二、中译英(Translate) 1、细胞信号转导（） 2、配体（） 3、钙调素（） 4、GTP结合蛋白（） 5、第二信使（） 6、G蛋白连接受体() 7、三磷酸肌醇（）

8、蛋白磷酸酶（） 9、类受体蛋白激酶（） 10、级联（） 11、受体酪氨酸激酶（） 12、跨膜 螺旋（） 13、胞内蛋白激酶催化结构域（） 14、调敏机制（） 三、名词解释(Explain the glossary) 1、细胞信号转导 2、受体 3. calmodulin 4. signal transduction 四、是非题（对的打“√”，错的打“×”）(True or false) 1、土壤干旱时，植物根尖合成ABA引起保卫细胞内的胞质钙 离子等一系列信号转导，其中ABA是第二信使。（） 2、植物细胞中不具有G蛋白连接受体。（） 3、G蛋白具有放大信号作用。（） 4、受刺激后胞质的钙离子浓度会出现短暂的、明显的下降.（） 5、少数植物具有双信使系统。（） 6、钙调素是一种不耐热的球蛋白。（） 7、蛋白质的可逆磷酸化是生物体内一种普遍的翻译后修饰方 式。（） 8、植物细胞壁中的CaM促进细胞增殖、花粉管萌发和细胞长 壁。（） 五、选择题（Choose the best answer for each question）

TCR细胞通路研究进展

TCR信号通路研究新进展 T细胞相关免疫疗法在近期的癌症研究中大放异彩，“主力部队”是CAR-T和TCR-T这两种技术。相对于 CAR-T细胞疗法，TCR-T疗法的关注度相对低些，但是这两种细胞疗法都属于利 用患者自身的 T淋巴细胞治疗癌症的前沿基因疗法。研究发现，在实体瘤治疗方面，TCR疗 法可能比CAR疗法更有优势。 T细胞在免疫系统中具有重要作用，可以攻击病原体和肿瘤细胞。T细胞受体（TCR）能识别 不同的广泛亲和力的配体，参与激活多种生理过程。TCR细胞疗法定制功能性TCR，具有最 佳的抗原识别特性，利用人体免疫系统来对抗癌症。那么，这种疗法的分子机制是什么呢？ 与之相关的TCR信号通路的分子调控机制有怎样的研究进展呢？本文将对这些问题进行综 合性讲述。 TCR蛋白结构 图一TCR复合物结构 T细胞作为适应性免疫应答的主要组成部 分，其抗原识别受体结构以被证实，克隆获得的TCR 由α-链和β-链构成异源二聚体。TCR异源二聚体主要与CD3的多个信号转导亚基结合，如 图所示，CD3γ、CD3δ和CD3ε异源二聚体以及CD3δ同源二聚体。在CD3的不同亚基含 有免疫受体酪氨酸的活化基序-ITAM，但是每个亚基的数量不 同，CD3γ、CD3δ和CD3ε分 别含有一个，而CD3δ含有三个串联的ITAM，这样就使的每个T细胞受体可以产生10个ITAM。酪氨酸磷酸化的ITAM可以使TCR与胞内信号转导通路发生偶联，向TCR募集含有SH2结构 域的蛋白质，如酪氨酸激酶ZAP70。但是现在还没有解决为什么TCR复合物包含这么多的信 号转导亚基和ITAM的问题，主要有两种假说，一种是CD3分子或单独的ITAM可能通过募 集独特的效应分子，执行不同的信号转导功能；另一种是 多个ITAM的主要功能是放大TCR 信号。 TCR识别与抗原递呈细胞（APC）呈递的可以结合MHC分子（pMHC）的肽。单独的TCR能够识别具有广泛亲和力的不同配体（自身肽和外来 肽）。TCR参与触发不同的功能输出。在 胸腺中，pMHC与TCR信号结合强度决定了细胞发育与分化过程。当结合力在最小值到最大 值之间时，促进胸腺细胞的存活，并转化 成CD4+CD8-或CD4-CD8+的成熟阶段；如果TCR与pMHC太低或太高，细胞会发生凋亡。在外围，自体pMHC对TCR的低亲和力结合提供了维

第七章 细胞信号转导异常与疾病-卢建

总字数：19,361 图：5 表：0 第七章细胞信号转导异常与疾病 第一节细胞信号转导系统概述 一、受体介导的细胞信号转导通路 二、细胞信号转导通路调节靶蛋白活性的主要方式 第二节信号转导异常发生的环节和机制 一、细胞外信号发放异常 二、受体或受体后信号转导异常 第三节与信号转导异常有关的疾病举例 一、胰岛素抵抗性糖尿病 二、肿瘤 三、心肌肥厚和心衰

第七章细胞信号转导异常与疾病 细胞信号转导系统(signal transduction system或cell signaling system)由能接收信号的特定受体、受体后的信号转导通路以及其作用的靶蛋白所组成。细胞信号转导系统具有调节细胞增殖、分化、代谢、适应、防御和凋亡等作用，它们的异常与疾病，如肿瘤、心血管病、糖尿病、某些神经精神性疾病以及多种遗传病的发生发展密切相关。受体和细胞信号转导分子异常既可以作为疾病的直接原因，引起特定疾病的发生；亦可在疾病的过程中发挥作用，促进疾病的发展。细胞信号转导异常可以局限于单一成分（如特定受体）或某一环节，亦可同时或先后累及多个环节甚至多条信号转导途径，造成调节信号转导的网络失衡。对信号转导系统与疾病关系的研究不仅有助于阐明疾病的发生发展机制，还能为新药设计和发展新的治疗方法提供思路和作用靶点。 第一节细胞信号转导系统概述 信号转导过程包括细胞对信号的接受，细胞内信号转导通路的激活和信号在细胞内的传递。激活的信号转导通路对其靶蛋白的表达或活性/功能的调节，如导致如离子通道的开闭、蛋白质可逆磷酸化反应以及基因表达改变等，导致一系列生物效应。 一、受体介导的细胞信号转导通路 细胞的信号包括化学信号和物理信号，物理信号包括射线、紫外线、光信号、电信号、机械信号(摩擦力、压力、牵张力以及血液在血管中流动所产生的切应力等)以及细胞的冷热刺激等。已证明物理信号能激活细胞内的信号转导通路，但是与化学信号相比，目前多数物理信号是如何被细胞接受和启动细胞内信号转导的尚不清楚。 化学信号又被称为配体(ligand)，它们包括：①可溶性的化学分子如激素、神经递质和神经肽、细胞生长因子和细胞因子、局部化学介质如前列腺素、细胞

细胞信号转导练习题--四套题

、选择题（共 10 题，每题 1 分） 1、 Ca2+ 在细胞信号通路中是（ A. 分泌化学信号分子 C. 间隙连接或胞间连丝 C. DAG 和 Ca2+ B. IP3 和 Ca2+ A. 抑制 Ras 蛋白 B. 激活 Ras 蛋白 A. 蛋白激酶 G （ PKG ） C. 蛋白激酶 C （ PKC ） 8、 NO 信号分子进行的信号转导通路中的第二信使分子是（ A. cAMP D. cGMP 9、在下列蛋白激酶中，受第二信使 DAG 激活的是（ ）。 A. PKA C. MAPK 细胞信号转导 第一 套 A. 胞外信号分子 C. 第二信使 B. 第一信使 D. 第三信使 2、动员细胞内源性 Ca2+ 释放的第二信使分子是（ ） 。 A. cAMP C. IP3 B. DAG D. cGMP 3、细胞通讯是通过（ ）进行 的。 B. 与质膜相结合的信号分子 D. 三种都包括在内 4、 Ras 蛋白由活化态转变为失活态需要 ）的帮 助。 A. GTP 酶活化蛋白（ GAP ) C. 生长因子受体结合蛋白 2 （GRB2） B. 鸟苷酸交换因子（ GEF ) D.磷脂酶 C- Y (PLC Y 5、PKC 在没有被激活时， 游离于细胞质中， 一旦被激活就成为膜结合蛋白， 这种变化依赖于 （ ）。 6、鸟苷酸交换因子（GEF ）的作用是（ ） 。 7、 cAMP 依赖的蛋白激酶是（ ） 。 B. 蛋白激酶 A （ PKA ） D. MAPK A. 磷脂和 Ca2+ D. DAG 和磷脂 C. 抑制 G 蛋白 D. 激活 G 蛋白 ）。 C. IP3 B. DAG

B. PKC D. 受体酪氨酸激酶 10、在RTK－Ras 蛋白信号通路中，磷酸化的（）残基可被细胞内的含有SH2 结构域的信号 蛋白所识别并与之结合。 A. Tyr C. Ser B. Thr D. Pro 二、判断题（共10 题，每题 1 分） 11、生成NO 的细胞是血管平滑肌细胞。（） 12、上皮生长因子（EGF）受体分子具酪氨酸激酶活性位点。（） 13 、Ras 蛋白在cAMP 信号通路中起着分子开关的作用。（） 14、Ras蛋白结合GTP时才能导致Raf蛋白的活化。（） 15、在磷脂酰肌醇双信使信号通路中，IP3的下游成分是PKC。（） 16、在cAMP信号通路中，霍乱毒素能使G蛋白a亚基持续活化。（） 17、G蛋白的磷酸化与否控制着下游靶蛋白的活性。（） 18、参与细胞信号转导中所有的受体都是跨膜蛋白质。（） 19、cAMP、DAG、IP3都是细胞内的第二信使，它们的产生都与G蛋白有关。（） 20、甾类激素能够透过细胞膜到细胞内与受体结合，发挥作用。（） 三、简答题（共10 题，每题 1 分） 21、G蛋白藕联受体含有_______ 个跨膜a螺旋区，而受体酪氨酸激酶含有________ 跨膜a螺旋区。 22、细胞表面受体可分为离子通道藕联受体，_______________ 受__体和__________ 受__体。 23、磷脂酰肌醇双信使信号通路的关键反应是生成IP3 和DAG，催化这一反应的酶是 24、IP3 的全称为1,4,5- 三磷酸肌醇，DAG 和cAMP 的全称分别为___________________________ 和__ 25、Ras 蛋白在RTK 介导的信号通路中起着关键作用，具有________________ 活_性，当结合 ______________ 时_为活化状态，当结合____________ 时_为失活状态。 26、G 蛋白所参与的细胞信号通路主要包括： ______________________ 和_________________________ 。 27、甾类激素的受体存在于_______________ ，__每个受体一般都具有 ______ 个_ 结构域。 28 、内质网膜上的 ______________ 将_细胞基质中的Ca2+ 泵入内质网腔中，而内质网膜上的

蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用

生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７ 综述 文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３ 蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用 李敏，周慧，崔银秋 吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１ ［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限 性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修 饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。 ［关键词］蛋白质组学；信号转导 ［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。 １信号蛋白的寻找和确定 细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。 ２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶 ［收稿日期］２００６－０８－３０ ［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３） ［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生 ［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ３３６

细胞信号转导

植物Ca2+信号的研究进展 摘要 为了适应环境,调节自身代谢和生长, 在植物的生长发育过程中,需要对各种外界环境刺激以及植物内部生理信息做出反应,因此,植物产生了自己的信号系统。Ca2+作为一种信号分子，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动，在植物细胞的信号系统中也起着举足轻重的作用。钙是植物生长发育必需的大量元素之一，在细胞水平上, 钙在细胞分裂、极性形成、生长、分化、凋亡等过程中均有重要的调节功能, 能维持细胞壁, 细胞膜及膜结合蛋白的稳定性并参与调节和控制植物的许多生理生化反应, 是植物代谢的重要调节者。针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况,综述了Ca2+信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、Ca2+信号的检测以及其研究的最新进展。 关键词：植物; Ca2+信号; 检测; 研究进展

钙元素广泛存在于自然界和各种生物体内, 而游离态的Ca2+更是在生命活动中扮演着举足轻重的角色, 它几乎参与了生命体所有的生理生化活动。作为一种信号分子, Ca2+在受精、胚胎发育、基因表达、细胞分化、组织形成、代谢调控等过程中都有参与, 可以说, Ca2+信号无处不在[1]。1967年, Ridg-wang和Ashley通过向藤壶肌纤维中微注射水母发光蛋白, 第一次测定静息态胞内钙离子浓度[Ca2+]以来, 对于Ca2+信号的研究即风生水起。虽然植物Ca2+信号的研究起步较动物细胞晚, 但依然取得了一些成果。对植物Ca2+信号的研究, 不但能揭示生命的奥秘, 同时能帮助我们更加清楚地了解各种生命活动。为此, 针对国内外对植物Ca2+信号的研究情况, 笔者对Ca2+信号的生理功能、信号的产生、Ca2+信号参与的各种植物生理过程、以及其研究的最新进展进行了综述。 1.Ca2+的功能 Heilbrunn在1937～1952年发表的著作中, 提出了Ca2+在生物系统中复杂和多功能性的观点。认为利用Ca2+是所有活细胞的基本特征。在他提出的“细胞刺激理论”中认为:当细胞受到各种刺激时, 细胞内原来浓度很低的Ca2+水平明显增高。Heilbrunn提出Ca2+的一些细胞效应有:(1)促进细胞黏合和胞间通讯;(2)影响酶活性, 如ATP酶酯酶等;(3)调节细胞分裂;(4)控制细胞的代谢活动;(5)调节细胞溶质中溶胶-凝胶状态转变;(6)高浓度Ca2+可能造成细胞死亡, 溶质中Ca2+浓度如果太高, 会与细胞内的磷酸根产生沉淀, 而磷酸根是细胞能量及物质代谢所必须的;(7)调节细胞膜的透性。钙在维持细胞膜方面有着重要作用, 电镜观察表明, 缺钙导致细胞膜解体, 加钙又恢复常态。可见钙有稳定细胞膜结构, 防止细胞膜损伤的作用。有机酸是植物代谢的中间产物, 钙能和有机酸结合成为可溶性的钙盐结晶, 其中最为普遍的就是草酸钙。据报道, 在外源Ca2+诱导下, 细胞内可形成草酸钙结晶移去外源Ca2+, 结晶会消失。草酸钙的形成有以下生理作用:(1)消除有机酸在植物体内的过多积累。(2)草酸钙的形成过程是可逆的,植物体内钙离子过多形成草酸钙, 消除过量钙对植物的伤害, 当钙离子浓度不能满足植物需要时,草酸钙释放出Ca2+以满足植物的需要。 2.植物Ca2+信号的产生和终止 高度区域化的植物细胞内结构中, 在质膜液泡膜内质网膜上都存在着跨膜的钙离子电化学梯度, 细胞质和细胞核内游离钙离子也呈现不均匀分布, 这些梯度分布在静止状态是相对稳定的, 在受到刺激时会发生变化。钙离子梯度是钙信号产生的基础，即植物细胞Ca2+空间分布的不均衡性是产生Ca2+信号的生物基础。植物细胞中, 静息态的胞内Ca2+浓度([Ca2+] i)为100～200nM, 而细胞外(细胞壁)和细胞内(内质网、液泡、线粒体、高尔基体、细胞核)钙离子库中钙离子浓度却是胞内的数十倍, 达到了1～10mM[2,3]。当细胞受到信号刺激时, Ca2+从钙离子库中释放, 使胞内Ca2+浓度瞬间升高,激活Ca2+依赖蛋白和激酶CPKs引起细胞代谢以及基因表达的改变。当Ca2+重新进入细胞内钙离子库或流出细胞进入胞外钙离子库时, 信号得以终止。钙离子浓度的调节是通过各种钙离子通道, 钙离子泵和钙离子转运来实现的[4]。 3.植物Ca2+信号的多样性 Ca2+信号几乎参与了各种植物生理过程, 包括花粉管生长、细胞分裂、受精等;同时, Ca2+信号还参与植物的抗逆反应和对光线的感知。由此可见, Ca2+

细胞生物学信号转导练习题

选择题：请在以下每题中选出正确答案，每题正确答案为1-6个，多选和少选均不得分 1. NO直接作用于 A.腺苷酸环化酶 B.鸟苷酸环化酶 C.钙离子门控通道 2. 以下哪一类细胞可释放NO A.心肌细胞 B.血管内皮细胞 C.血管平滑肌细胞 3. 硝酸甘油作为治疗心绞痛的药物是因为它 A.具有镇痛作用 B.抗乙酰胆碱 C.能在体内转换为NO 4. 胞内受体A.是一类基因调控蛋白 B.可结合到转录增强子上 C.是一类蛋白激酶 D.是一类第二信使 5. 受体酪氨酸激酶RTK A.为单次跨膜蛋白 B.接受配体后发生二聚化 C.能自磷酸化胞内段 D.可激活Ras 6. Sos属于 A.接头蛋白（adaptor） B.Ras的鸟苷酸交换因子（GEF） C.Ras的GTP酶活化蛋白（GAP） 7. 以下哪些不属于G蛋白 A.Ras B.微管蛋白β亚基 C.视蛋白 8. PKC以非活性形式分布于细胞溶质中，当细胞之中的哪一种离子浓度升高时，PKC转位到质膜内表面

A.镁离子 B.钙离子 C.钾离子 D.钠离子 9. Ca2+载体——离子霉素（ionomycin）能够模拟哪一种第二信使的作用 A.IP3 B.IP2 C.DG 10. 在磷脂酰肌醇信号通路中，质膜上的磷脂酶C（PLC-β）水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），产生哪两个两个第二信使 A.1，4，5-三磷酸肌醇（IP3） B.DAG C.4，5-二磷酸肌醇（IP2） 11. 在磷脂酰肌醇信号通路中，G蛋白的直接效应酶是 A.腺苷酸环化酶 B.磷脂酶C-β C.蛋白激酶C 12. 蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）由两个催化亚基和两个调节亚基组成，cAMP能够与酶的哪一部分结合 A.催化亚基 B.调节亚基 13. 在cAMP信号途径中，环腺苷酸磷酸二酯酶（cAMP phosphodiesterase）的作用是 A.催化ATP生成cAMP B.催化ADP生成cAMP C.降解cAMP生成5’-AMP 14. 在cAMP信号途径中，G蛋白的直接效应酶是 A.蛋白激酶A B.腺苷酸环化酶 C.蛋白激酶C 15. 以下哪一种感觉不是由G蛋白偶联型受体介导的 A.听觉 B.味觉 C.视觉 D.嗅觉 16. G蛋白的GTP酶活化蛋白GAP（GTPase activating protein）可

TCR细胞通路研究进展

T C R细胞通路研究进展标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

T C R信号通路研究新进展 T细胞相关免疫疗法在近期的癌症研究中大放异彩，“主力部队”是CAR-T和TCR-T这两种技术。相对于CAR-T细胞疗法，TCR-T疗法的关注度相对低些，但是这两种细胞疗法都属于利用患者自身的T淋巴细胞治疗癌症的前沿基因疗法。研究发现，在实体瘤治疗方面，TCR疗法可能比CAR疗法更有优势。 T细胞在免疫系统中具有重要作用，可以攻击病原体和肿瘤细胞。T细胞受体（TCR）能识别不同的广泛亲和力的配体，参与激活多种生理过程。TCR细胞疗法定制功能性TCR，具有最佳的抗原识别特性，利用人体免疫系统来对抗癌症。那么，这种疗法的分子机制是什么呢？与之相关的TCR信号通路的分子调控机制有怎样的研究进展呢？本文将对这些问题进行综合性讲述。 TCR蛋白结构 图一TCR复合物结构 T细胞作为适应性免疫应答的主要组成部分，其抗原识别受体结构以被证实，克隆获得的TCR由α-链和β-链构成异源二聚体。TCR异源二聚体主要与CD3的多个信号转导亚基结合，如图所示，CD3γ、CD3δ和CD3ε异源二聚体以及CD3ζ同源二聚体。在CD3的不同亚基含有免疫受体酪氨酸的活化基序-ITAM，但是每个亚基的数量不同，CD3γ、CD3δ和CD3ε分别含有一个，而CD3ζ含有三个串联的ITAM，这样就使的每个T细胞受体可以产生10个ITAM。酪氨酸磷酸化的ITAM可以使TCR与胞内信号转导通路发生偶联，向TCR募集含有SH2结构域的蛋白质，如酪氨酸激酶ZAP70。但是现在还没有解决为什么TCR复合物包含这么多的信号转导亚基和ITAM的问题，主要有两种假说，一种是CD3分子或单独的ITAM可能通过募集独特的效应分子，执行不同的信号转导功能；另一种是多个ITAM的主要功能是放大TCR信号。 TCR识别与抗原递呈细胞（APC）呈递的可以结合MHC分子（pMHC）的肽。单独的TCR能够识别具有广泛亲和力的不同配体（自身肽和外来肽）。TCR参与触发不同的功能输出。在胸腺中，pMHC与TCR信号结合强度决定了细胞发育与分化过程。当结合力在最小值到最大值之间时，促进胸腺细胞的存活，并转化成CD4+CD8-或CD4-CD8+的成熟阶段；如果TCR与pMHC太低或太高，细胞会发生凋亡。在外围，自体pMHC对TCR的低亲和力结合提供了维持初始T细胞所必需的强直性存活信号，并且还可以促进其与外来抗原高亲和力遭遇时的完全激活。 图二TCR结合强度对胸腺细胞的影响 TCR信号强度对于产生合适的应答T细胞至关重要。TCR信号传导应答指导 CD4+T细胞分化成功能不同的T辅助细胞亚群，对特定T细胞亚群（如调节性T 细胞）也起着关键作用。TCR细胞的强度和持续时间与记忆T细胞分化相关，也是诱导T细胞无能或耗竭的基本决定因素。TCR信号受到生化及分子机制的调控，导致信号放大或衰减。调控TCR的机制复杂多样，不过可以分为三个基本层面：早期信号转导效应分子（如关键激酶和磷酸酶的调节）；信号分子发育阶段（特异性表达调控）；以及TCR信号强度的动态调控。 TCR信号通路概述 图三：TCR信号通路概述

(完整版)第十一章细胞的信号转导习题集及参考答案

第十一章细胞的信号转导 一、名词解释 1、细胞通讯 2、受体 3、第一信使 4、第二信使 5、G 蛋白 6、蛋白激酶A 二、填空题 1、细胞膜表面受体主要有三类即、、和。 2、在细胞的信号转导中，第二信使主要有、、、和。 3、硝酸甘油之所以能治疗心绞痛是因为它在体内能转化为，引起血管，从而减轻的负荷和的需氧量。 三、选择题 1、能与胞外信号特异识别和结合，介导胞内信使生成，引起细胞产生效应的是( )。 A、载体蛋白 B、通道蛋白 C、受体 D、配体 2、下列不属于第二信使的是（）。 A、cAMP B、cGMP C、DG D、CO 3、下列关于信号分子的描述中，不正确的一项是（）。 A、本身不参与催化反应 B、本身不具有酶的活性 C、能够传递信息 D、可作为酶作用的底物 4、生长因子是细胞内的（）。 A、结构物质 B、能源物质 C、信息分子 D、酶 5、肾上腺素可诱导一些酶将储藏在肝细胞和肌细胞中的糖原水解，第一个被激活的酶是（）。 A、蛋白激酶A B、糖原合成酶 C、糖原磷酸化酶 D、腺苷酸环化酶 6、（）不是细胞表面受体。 A、离子通道 B、酶连受体 C、G蛋白偶联受体 D、核受体 7、动物细胞中cAMP的主要生物学功能是活化（）。 A、蛋白激酶C B、蛋白激酶A C、蛋白激酶K D、Ca2+激酶 8、在G蛋白中，α亚基的活性状态是（）。 A、与GTP结合，与βγ分离 B、与GTP结合，与βγ聚合 C、与GDP结合，与βγ分离 D、与GDP结合，与βγ聚合

9、下面关于受体酪氨酸激酶的说法哪一个是错误的 A、是一种生长因子类受体 B、受体蛋白只有一次跨膜 C、与配体结合后两个受体相互靠近，相互激活 D、具有SH2结构域 10、在与配体结合后直接行使酶功能的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 11、硝酸甘油治疗心脏病的原理在于 A、激活腺苷酸环化酶，生成cAMP B、激活细胞膜上的GC，生成cGMP C、分解生成NO，生成cGMP D、激活PLC，生成DAG 12、霍乱杆菌引起急性腹泻是由于 A、G蛋白持续激活 B、G蛋白不能被激活 C、受体封闭 D、蛋白激酶PKC功能异常 13下面由cAMP激活的酶是 A、PTK B、PKA C、PKC D、PKG 14下列物质是第二信使的是 A、G蛋白 B、NO C、GTP D、PKC 15下面关于钙调蛋白（CaM）的说法错误的是 A、是Ca2+信号系统中起重要作用 B、必须与Ca2+结合才能发挥作用 C、能使蛋白磷酸化 D、CaM激酶是它的靶酶之一16间接激活或抑制细胞膜表面结合的酶或离子通道的受体是 A、生长因子受体 B、配体闸门离子通道 C、G蛋白偶联受体 D、细胞核受体 17重症肌无力是由于 A、G蛋白功能下降

第15章--细胞信号转导习题

第十五章细胞信号转导 复习测试 （一）名词解释 1. 受体 2. 激素 3. 信号分子 4. G蛋白 5. 细胞因子 6. 自分泌信号传递 7. 蛋白激酶 8. 钙调蛋白 9. G蛋白偶联型受体 10. 向上调节 11. 细胞信号转导途径 12. 第二信使 （二）选择题 A型题： 1. 关于激素描述错误的是： A. 由内分泌腺/细胞合成并分泌 B. 经血液循环转运 C. 与相应的受体共价结合 D. 作用的强弱与其浓度相关 E. 可在靶细胞膜表面或细胞内发挥作用 2. 下列哪种激素属于多肽及蛋白质类： A. 糖皮质激素 B. 胰岛素 C. 肾上腺素 D. 前列腺素 E. 甲状腺激素 3. 生长因子的特点不包括： A. 是一类信号分子 B. 由特殊分化的内分泌腺所分泌 C. 作用于特定的靶细胞 D. 主要以旁分泌和自分泌方式发挥作用 E. 其化学本质为蛋白质或多肽 4. 根据经典的定义，细胞因子与激素的主要区别是： A. 是一类信号分子 B. 作用于特定的靶细胞 C. 由普通细胞合成并分泌 D. 可调节靶细胞的生长、分化 E. 以内分泌、旁分泌和自分泌方式发挥作用 5. 神经递质、激素、生长因子和细胞因子可通过下列哪一条共同途径传递信号：

A. 形成动作电位 B. 使离子通道开放 C. 与受体结合 D. 通过胞饮进入细胞 E. 自由进出细胞 6. 受体的化学本质是： A. 多糖 B. 长链不饱和脂肪酸 C. 生物碱 D. 蛋白质 E. 类固醇 7. 受体的特异性取决于： A. 活性中心的构象 B. 配体结合域的构象 C. 细胞膜的流动性 D. 信号转导功能域的构象 E. G蛋白的构象 8. 关于受体的作用特点，下列哪项是错误的： A. 特异性较高 B. 是可逆的 C. 其解离常数越大，产生的生物效应越大 D. 是可饱和的 E. 结合后受体可发生变构 9. 下列哪项与受体的性质不符： A. 各类激素有其特异性的受体 B. 各类生长因子有其特异性的受体 C. 神经递质有其特异性的受体 D. 受体的本质是蛋白质 E. 受体只存在于细胞膜上 10. 下列哪种受体是催化型受体： A. 胰岛素受体 B. 甲状腺激素受体 C. 糖皮质激素受体 受体 D. 肾上腺素能受体 E. 活性维生素D 3 11. 酪氨酸蛋白激酶的作用是： A. 使蛋白质结合上酪氨酸 B. 使含有酪氨酸的蛋白质激活 C. 使蛋白质中的酪氨酸激活 D. 使效应蛋白中的酪氨酸残基磷酸化 E. 使蛋白质中的酪氨酸分解 12. 下列哪种激素的受体属于胞内转录因子型： A. 肾上腺素 B. 甲状腺激素 C. 胰岛素 D. 促甲状腺素 E. 胰高血糖素

细胞信号转导课程作业资料

专业文献综述 题目: 脱落酸在植物细胞信号转导中的作用姓名: 学院: 专业: 班级: 学号: 指导教师: 职称:

摘要:脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，受到生物胁迫和非生物胁迫的调控，在植物对胁迫环境抗逆性中发挥重要作用。当植物受到外界条件影响后会导致植物体内ABA含量上升，调节气孔的开度，防止植物体进一步失水，维持细胞渗透平衡；参与相关抗逆基因的表达调控，产生抗逆分子；通过延长种子休眠期等以适应逆境；通过一些调节因子调节植物细胞内环境稳定。本文介绍了脱落酸的合成、调控、作用机制及其在植物逆境胁迫中的作用。 关键词：脱落酸；合成；作用机制；胁迫

细胞信号转导是在特定时空条件下将外界生长、发育、分化等信息通过一定的途径转移至细胞内并调控相关基因表达的过程。细胞的一切生命活动都与信号转导有关。细胞信号转导系统具有调节细胞增殖、分化、代谢、应激、防御、凋亡和胀亡等作用[1]。脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，参与植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟以及逆境胁迫等许多方面，对植物生长发育起着调节作用[2]。植物接受胁迫信号，影响基因的表达，引起植物体内ABA水平上调，从而增加植物的抗逆性。ABA在植物干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中起重要作用，它是植物的抗逆诱导因子，因而被称为植物的“胁迫激素”。本文介绍了脱落酸的合成、调控、作用机制及其在植物逆境胁迫中的作用。 1 脱落酸的合成与调控 ABA主要在叶绿体中合成，然后转移到其他组织中积累起来。研究发现不仅植物的叶片，立体的根系，特别是根尖也能合成大量的脱落酸。进一步研究发现，植物的其他器官，特别是花、果实、种子也能合成脱落酸。 脱落酸是C15化合物，在植物体内有两条合成途径，一是直接途径：3个异戊烯单位聚合成C15前体—法呢焦磷酸(FPP)，由FPP经环化和氧化直接形成15碳的ABA。另一个是高等植物中的C40间接途径：质体内的MEP途径，由C40的类胡萝卜素转化形成[3]。迄今为止，脱落酸生物合成中几乎全部基因都已经被克隆。进一步的研究发现，在脱落酸代谢途径中有多个步骤受到差异调控，从而在转录和转录后水平对脱落酸含量进行精细调控。 在非胁迫条件下脱落酸可能在维管组织中合成，然后被运送到气孔等目标部位，有研究表明脱落酸在凋亡的叶片和子叶的保卫细胞中也有所表达。脱落酸的代谢调控并不仅仅局限于生物合成途径中的某一部分，而是一个多位点的协调过程。MEP途径中的DXP合成酶、类胡萝卜素代谢中参与其合成的八氢番茄红素去饱和酶和参与其转化的ZEP都能够在种子和幼苗中引起脱落酸的积累[4]。除了代谢途径自身的酶基因外，脱落酸的生物合成也依赖于内部和外部的各种信号，以及发育阶段、组织和器官的特异性等等。在胚的发育早期，脱落酸促进胚的生长;而在发育晚期则通过与赤霉素相拮抗而抑制胚的生长[5]。 2 脱落酸的作用机制 现在研究认为，在干旱、高盐或低温等逆境胁迫条件下，可能存在的机制是：逆境胁迫条件促使植物体内脱落酸的积累，脱落酸诱导ABA响应元件基因表达，从而产生对逆境抗性[6]。从胁迫刺激到植物作出反应是一系列复杂的信息传递过程，包括三个环节：一是感受细胞或组织对原初信号(环境刺激)的感知传导和反应，产生胞间信号；二是胞间信使在细胞或组织间的传递，并最终到达受体细胞的作用位点；三是受体细胞对胞间信使的接受、转导和反应，使受体组织中生理生化和功能的最优化组合，最终体现为植物对环境刺激或逆境的适应或抗性[7]。从这个角度来说脱落酸在植物体内产生作用主要表现在3个方面：通过受体作用、通过基因表达作用、通过信号因子作用。 2.1 通过受体作用 ABA信号转导研究最突出的进展之一是ABA受体PYR/PYL/PCAR蛋白的鉴定