引物测序直播问题及回答

1、我想问下：为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度呢？

两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。

2、老师您好，我想自己设计测序引物，请问对于测序引物有什么要求吗？

在待测目的基因前面100bp左右设计引物，GC含量不能太高或太低，3’端不能有错配，引物的长度建议是18-20bp以内。

3、甲基化的建议反向测序,是什么意思?

正向测序有甲基化的结构，会导致测序峰图双峰或者严重的时候导致信号突然中断，就可以反向测序，然后正反双向测序结果拼接起来就可以得到完整的序列。

4、老师请问一个测序反应有效的大概有多长?

普通序列一个测序反应有效长度大概是800bp左右。

5、请问RNA最长能合多少呢

30bp以内。

6、稀释后引物保存时间多久？

稀释后的引物一般4℃保存3个月内是没有问题的

7、你们的积分的兑换时间有限制吗？

积分不清零的

8、测序为什么前70bp不准呢

一代测序，由于仪器的缺陷，所以前面会有几十bp是不准确的，严重的时候会有70bp左右不准确。

9、老师请问那引物最长能合多长呢？

引物最长能合139bp。

10、金开瑞引物合成与外面其他公司引物合成相比，优势有哪些？

我们公司技术服务内容比较多，内部和外部引物合成需求都是一起合成，效果和质量的反馈方面，我们综合有内部使用和外部使用反馈，更全面。

11、只做常规的pcr，用什么纯化方式的引物呢?

常规的pcr脱盐纯化就可以满足实验了。

12、引物测序时，单向、双向、测通之间的具体区别是什么呀？

这个主要是根据待测目的序列的长度来决定的，如果待测目的序列700bp以内的话可以选择正向或者反向都行；1500bp以内的序列一般双向测序就可以了；如果是待测目的序列大于1500bp就可以填测通，这边会根据测序结果自动安排测序反应，直到完全测通，我们会默认测通后拼接。

13、不同纯化方法,你们收费不一样是吗

不一样的，脱盐纯化

14、金开瑞收到测序样品后一般最快多久出结果？

质粒和PCR产物24小时内出结果，菌液48小时内出结果。

引物保护碱基列表--百度文库

11月13日 引物合成的详解 4.需要什么级别的引物？ 答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增<45 base OPC 一般PCR扩增>45 base PAGE 诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE DNA测序20base左右OPC 亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC 根据实验要求定PAGE 基因构建（全基因合成） 反义核酸根据实验要求定PAGE PAGE, HPLC 修饰引物根据实验要求定 8.如何计算引物的浓度？ 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul。一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml. 9.如何计算引物的Tm值？ 答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 11.如何溶解引物？ 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 12.如何保存引物？ 答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 13.合成的引物5’端是否有磷酸化 答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。 14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连

测序常用名词解释整理

高通量测序领域常用名词解释大全 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。

测序引物设计指南

测序引物设计指南 ?P CR引物设计方法： 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使P CR反应不能正常进行。

一、测序样品要求

一、测序样品要求： 质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul； 2．大质粒必须注明载体长度; 3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。 菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。 3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。 PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。 2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。 3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。 4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。 5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。 6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。 二、免费提供通用引物列表： T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX； 3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R 三、注意事项: 1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。 2．T载体请注明是PGEM-T还是PMD18T、PUC18、PUC19。 3．M13＋/－请注明是M13F，M13R，还是M13F（-47），M13R（-48）。 4．一般测序样品浓度要求：100ng/ul。 5．若临时变更测序，请尽快电话联系我们，E-Mail通知无效，对于通知前已经安排的反应，照常收费。 6．超过3K需要测通的样品，请客户自己提供引物进行测序。 7．简并引物和随机引物不宜用于测序。 8．样品如需返还请填写备注栏，无特殊要求不返还。 9．所送样品及引物，我们将免费保存一个月，超过一个月后如客户无特殊要求，样品自动被销毁。 10．由于自带引物问题或样品本身原因（复杂结构，高级结构等）造成测序失败照常收费，非样品原因造成测序失败免费。 11．对于选择E-mail发送报告的，如对结果有异议，请在接到报告后3天内用电话联系我公司，未联系的则认为您接受结果与费用。 测序定单 客户姓名：必填手机：必填科室电话：必填 E-Mail（1）: 必填

用软件设计引物(Primer Premier & Oligo)

用软件设计引物（Primer Premier & Oligo） 使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，软件的立足点也是按照引物设计的基本原则，只是更加快速和自动化而已。我们可以直接提交模板序列到特定网页，如著名的primer3（https://www.sodocs.net/doc/2818915732.html,/），得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“DNAsis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步骤及技巧 其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 进行引物设计时，打开DNA序列后点击按钮primer，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按search，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按OK，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标。 点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，所得结果分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一

DNA测序常见问题及分析

DNA测序过程可能遇到的问题及分析 对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。 为什么呢？ PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。 N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。 测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物 （<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间

常见载体的测序引物

常见载体的测序引物： Primer of Vector: Vector：Primer(F)；Primer(R) pACT T7 T3 pACT2 GAL4 AD pACT2-R pAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.R pB42AD pB42ADF pB42ADR pBACPAK8 BAC1 BAC2 pBK-CMV T7 T3 PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13R pBV220 PBV220F PBV220R pCAMBIA 1301(1300) P1 P2 pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47) PCANTB5E S1/M13R S6 pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGH pcDNA3.1 T7 BGH pcDNA4 T7/CMV-F BGH pcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面）BGH pcDNAII T7 SP6 pCE2.1 M13F M13R pCEP4 pCEP-F EBV-R

pCF-T M13F M13R pCI T7（17Base）此载体无反向引物 pCI-neo T7（17Base）T3 pCMS-EGFP T7 T3 pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7 pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5F pCMV5R pCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-R pCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13R pCMV-Tag(KAN+) T3 T7 pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13R pCR3.1 T7 BGH pCS2 SP6 T7 pDonar M13F M13R pDONR221 M13F M13R pDrive T7 SP6 pDRIveR(KAN+) T7 SP6 pDsRED1-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’(距离很近,一般不用) pDsRED2-C1(KAN+) pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’ pDSRED-N1(KAN+) pEGFP-N-5’ PDSRED-N-R pECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3' pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’

20个测序常见的问题

20个测序常见的问题 1．为什么需要新鲜的菌液？ 首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。2．如何提供菌液？ 如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ （1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果； (2）必须进行胶回收纯化； (3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。 6．如何进行PCR产物纯化？ PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。 7．PCR产物直接测序的好处？ （1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况； （2) 省去克隆的实验费用和时间； （3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障； （4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。 8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？ 对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。 9．如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？ 我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加E，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA 的不同构型。 质粒DNA的3种构型是指在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭-标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

引物设计Oligo使用介绍

作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能，如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。 在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法： 1、直接用键盘输入： a、点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口； b、此时即可键入DNA序列； c、如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。 2、利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件。html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oli go会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。 3、如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA,GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。 点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。 进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6-碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6-碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，

常用引物信息列表

3’AOX5′-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3‘ 3‘AD5′- AGA TGG TGC ACG ATG CAC AG-3‘ 3‘BD5′-TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT C-3‘5’AOX5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3‘ A-FACTOR5′-TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGC-3‘ CMV-F5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3‘ CMV-R5′-GTTCACGGTGCCCTCC-3‘ EGFP-Nrev5′-CGT CGC CGT CCA GCT C-3‘ GLP15′-TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG-3‘GLP25′-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA-3‘ M13(-96)5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘ M13-205′-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3‘ M13F5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3‘ M13F（-47）5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ M13F-215′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3‘ M13R5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3‘ M13R（-48）5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3‘ P125845′-TTTTCAGTATCTACGAT-3’ P171105′-TACCACTACAATGGATG-3’ pbd-gal4-f5′-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3‘ pbd-gal4-r5′-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA-3‘ pbi-121(35s)5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3‘ PBV220F5′-AAGAAGGGCAGCATTCAAAG-3‘ PBV220R5′-CTG CGT TCT GAT TTA ATC TG-3‘ PCDNA3.0-R25′-GGC AAC TAG AAG GCA CAG TC-3‘PCDNA3.1F5′-CTAGAGAACCCACTGCTTAC-3’ PCDNA3.1R5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’ PCMV-F5′-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3‘ PCMV-5F5′-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3‘ PCMV-R5′-TCCAAACTCATCAATGTATC-3‘ PCMV-5R5′-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3‘ PEGFP-C-3’5′-TATGGCTGATTATGATCAGT-3‘ PEGFP-C-5’5′-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3‘ PEGFP-N-3’5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3‘ PEGFP-N-5’5′-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3‘ PGEX-3’5′-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3‘ PGEX-5’5′-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3‘PIRES2-EGFP-F5′-GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG-3‘PIRES3-EGFP-R5′-AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC-3‘ pMAL-C2X-F5′-TGC GTA CTG CGG TGA TCA AC-3’ pMAL-C2X-R5′-CTG CAA GGC GAT TAA GTT GG-3’ PQE30F5′- TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC-3‘ PQE30R5′- GTT CTG AGG TCA TTA CTG G-3‘ RVP35′-CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-3‘

常用pGEX载体图谱

Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。。。pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达 Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac 启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成 蛋白标签：

pGEX4T1载体基本信息 出品公司: GE 别名: pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体 表达水平: 高拷贝 启动子: Tac 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4969 bp 5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 载体标签: N-GST 载体抗性: Ampicillin 氨苄 备注: 复制子是pMB1 产品目录号: 27-4580-01 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pGEX4T1载体质粒图谱和多克隆位点信息 原核生物DNA复制起始点，是DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。大肠杆菌的复制起

pGEX4T1载体简介 pGEX4T1载体序列 LOCUS pGEX-4T-1 4969 bp DNA circular SYN DEFINITION pGEX-4T-1 ACCESSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI https://www.sodocs.net/doc/2818915732.html,/ COMMENT VNTAUTHORNAME|https://www.sodocs.net/doc/2818915732.html,| FEATURES Location/Qualifiers source 1..4969 /organism="pGEX-4T-1" /mol_type="other DNA" promoter 184..212 /label="tac_promoter" misc_feature 224..246 /label="M13_pUC_rev_primer" gene 258..977 /label="GST (variant)" /gene="GST (variant)" CDS 258..977 /label="ORF frame 3"

引物设计原则

引物设计 一、软件使用： ●推荐软件：Primer Premier 5.0 ●优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 ●缺点：没有明显缺点 ●本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar； DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). ●网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好 这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物 对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基 因组PCR的用户试用。 二、推荐操作： ●引物搜索：Primer Premier 5.0 ●引物评价：Oligo 6.22 三、引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：

引物测序直播问题及回答

1、我想问下：为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度呢？ 两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。 2、老师您好，我想自己设计测序引物，请问对于测序引物有什么要求吗？ 在待测目的基因前面100bp左右设计引物，GC含量不能太高或太低，3’端不能有错配，引物的长度建议是18-20bp以内。 3、甲基化的建议反向测序,是什么意思? 正向测序有甲基化的结构，会导致测序峰图双峰或者严重的时候导致信号突然中断，就可以反向测序，然后正反双向测序结果拼接起来就可以得到完整的序列。 4、老师请问一个测序反应有效的大概有多长? 普通序列一个测序反应有效长度大概是800bp左右。 5、请问RNA最长能合多少呢 30bp以内。 6、稀释后引物保存时间多久？ 稀释后的引物一般4℃保存3个月内是没有问题的 7、你们的积分的兑换时间有限制吗？ 积分不清零的 8、测序为什么前70bp不准呢 一代测序，由于仪器的缺陷，所以前面会有几十bp是不准确的，严重的时候会有70bp左右不准确。 9、老师请问那引物最长能合多长呢？ 引物最长能合139bp。 10、金开瑞引物合成与外面其他公司引物合成相比，优势有哪些？ 我们公司技术服务内容比较多，内部和外部引物合成需求都是一起合成，效果和质量的反馈方面，我们综合有内部使用和外部使用反馈，更全面。 11、只做常规的pcr，用什么纯化方式的引物呢? 常规的pcr脱盐纯化就可以满足实验了。 12、引物测序时，单向、双向、测通之间的具体区别是什么呀？ 这个主要是根据待测目的序列的长度来决定的，如果待测目的序列700bp以内的话可以选择正向或者反向都行；1500bp以内的序列一般双向测序就可以了；如果是待测目的序列大于1500bp就可以填测通，这边会根据测序结果自动安排测序反应，直到完全测通，我们会默认测通后拼接。

针对外显子设计PCR测序引物教程

针对外显子设计PCR测序引物教程 在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。当然，您有钱当然可以这样做。我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。 （1）基础知识 我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。 （2）设计软件 在线设计软件exon primer http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html 大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。 由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。否则我们得到的引物不会包含UTR。要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。 下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。 （2）找到smurf2 mRNA 打开gene bank https://www.sodocs.net/doc/2818915732.html,/,注意要在database中选nucleotide

Invitrogen中国测序通用引物序列

Invitrogen中国测序通用引物序列 引物名称序列(5'-3') M13R CAG GAA ACA GCT A TG ACC M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96) CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG SP6 A TT TAG GTG ACA CTA TAG T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG T3 A TT AAC CCT CAC TAA AGG GA pGEX-4T-5' GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3' CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1 TGT A TC TTA TGG TAC TGT AAC TG GLp2 CTT TA T GTT TTT GGC GTC TTC CA RVp3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC RVp4 GAC GA T AGT CA T GCC CCG CG pcDNA3.1R TAG AAG GCA CAG TCG AGG PinPoint primer CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F TCT AAA AGC TGC GGA A TT GT pCMV-R TCCAAACTCA TCAA TGTA TC pTRC99C-F: TTG CGC CGA CA T CA T AAC pTRC99C-R: CTGCGTTCTGA TTTAA TCTG pCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG EBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC pIRES2-EGFP.P5’:GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TA T TC 3'AD: AGA TGG TGC ACG A TG CAC AG CMV -F CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG S1 CAA CGT GAA AAA A TT A TT A TT CGC S6 GTA AA T GAA TTT TCT GTA GTA GG 5`AOX1 GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC 3`AOX1 GCA AA T GGC A TT CTG ACA TCC α-Factor TAC TA T TGC CAG CA T TGC TGC GAL4 AD TAC CAC TAC AA T GGA TG pACT2-R GTGCACGA TGCACAGTTGAA pB42ADF: CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG A TG

常用载体测序引物列表

常用载体测序引物列表 载体名称 正向引物 反向引物 pACT T7 T3 pACT2 GAL4 AD(5’AD) 3'AD/pACT2-R PACYCDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TER pAD/pl-DEST CMV-F pAD-Track pAD-Track-F 无 pAS2-1 5’BD M13-26/48 PB42AD PB42ADF PB42ADR PBAD PBAD-F PBAD-R pBABE pBABE5’ pBABE3’ PBACPAK8 BAC1 BAC2 pBK-CMV T7/M13-20 T3/M13-26 PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13R pBV220 PBV220F PBV220R pBI121 需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 1301(1300) 需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 2300 需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 PCANTB5E S1/M13R S6 pCAT3-enhancer pGL3+ pcDNA3.0 pEGFP-N5/T7 SP6/BGH pcDNA3.1 pEGFP-N5/T7 BGH pcDNA4 T7/pEGFP-N5 BGH pcDNA6 T7/pEGFP-N5 BGH pcDNAII T7 SP6 pCE2.1 M13F M13R pCEP4 pCMV5R/PCEP-F pEGFP-N5/EBV-R pCF-T M13F M13R pCI T7（17Base ） pCMV5R pCI-neo T7（17Base ） T3 pCMS-EGFP T7 T3 pCMV-3Tag-4A T3 /pFlag-CMV-F T7 pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5F pCMV5R pCMV-MYC/NUC pCMV5F pCMV5R PCMV-HA pCMV5F pCMV5R pCMV-Sport SP6/M13R pCMV-Tag T3 T7 pCMV-TNT T7/SP6 pCMV5R pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13R pCR3.1 T7 BGH pCS2 SP6 T7