芽孢杆菌属
第一、芽孢杆菌属的分类
一、芽孢杆菌属微生物特性
芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。芽孢杆菌属微生物具有共同的特性，都能够形成带有芽孢的生物膜，且代谢产物相似，都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等。
二、芽孢杆菌的分类方法
分类学是研究生物分类的原理、方法和实践的科学，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。目前细菌分类主要是采取多项分类技术。多项分类的概念是Colwell于1968年提出的，原理是利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。概括的讲，多项分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系。目前，多项分类法被认为是研究各级分类最有效的手段，可用于所有水平上分类单位的描述和定义。
2、1经典分类（表型特征）
表型是由于基因和环境因素相互作用引起的，在细胞、器官和整体水平上能检测和观察到的特征。一般，原核生物的表型特征能区分不同菌种但不能区分菌株。表型特征包括形态学特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析。表型特征虽然不能说明物种之间的亲缘关系，但它却是人们认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础，仍然是分类研究的基础。
芽孢杆菌，菌体杆状，直或近直，0.3~2.2×2.1~7.0um,多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子，严格好氧或兼性厌氧。由于实验条件的限制，传统芽孢杆菌的分类主要是根据形态学特征即好氧或厌氧和有无芽孢形成。Gibson和Gorden依据芽孢的形状（卵形或球形）以及它们在菌体或芽孢囊中的位置，提出芽孢形态群体概念，将芽孢杆菌分为三个类群。由于这个种的分离方法是以群体来划分的，它对芽孢杆菌分类鉴定有着非常重要的作用。群1、孢囊不显著膨大，芽孢椭圆或柱形，中生到端生，革兰氏阳性
A、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中有不着色的球状体
1、严格好氧；不产生乙酰甲基甲醇................................................巨大芽孢杆菌
2、兼性厌氧；产生乙酰甲基甲醇....................................................蜡状芽孢杆菌
B、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中没有不着色的球状体
1、7%氧化钠中生长；石蕊牛奶不产酸
a、在pH5.7生长；产生乙酰甲基甲醇
（1）水解淀粉；硝酸盐还原到亚硝酸盐
①兼性厌氧；利用丙二酸盐..............................................地衣芽孢杆菌
②好氧；不利用丙二酸盐..................................................枯草芽孢杆菌
（2）不水解淀粉；硝酸盐不还原到亚硝酸盐........................短小芽孢杆菌
b、在pH5.7不生长；不产生乙酰甲基甲醇................................坚强芽孢杆菌
2、7%氯化钠中生长；石蕊牛奶产酸...............................................凝结芽孢杆菌
群2、椭圆形芽孢使孢囊膨大，芽孢中生到端生，革兰氏阳性、阴性或可变
A、从碳水化合物产气
1、产生乙酰甲基甲醇；从甘油形成二羟基丙酮............................多粘芽孢杆菌
2、不产生乙酰甲基甲醇；不形成二羟基丙酮................................浸麻芽孢杆菌
B、不从碳水化合物产气
1、水解淀粉
a、不形成吲哚
（1）65℃不生长............................................................................环状芽孢杆菌
（2）65℃生长......................................................................嗜热脂肪酸芽孢杆菌
b、形成吲哚..................................................................................蜂房芽孢杆菌
2、不水解淀粉
a、接触酶阳性；连续转解在营养肉汤中存活
（1）兼性厌氧；葡萄糖培养液中培养物的pH小于8.0.........侧孢芽孢杆菌
（2）好氧；葡萄糖培养液中培养物的pH为8.0以上...............短芽孢杆菌
b、接触酶阴性；连续转解不能在营养肉汤中存活
（1）硝酸盐还原到亚硝酸盐；分解酪朊...................................幼虫芽孢杆菌
（2）硝酸盐不还原到亚硝酸盐；不分解酪朊
①孢囊含有伴孢体；2%氯化钠中生长...........................日本甲虫芽孢杆菌
②孢囊不含伴孢体；2%氯化钠中生长............................缓病芽孢杆菌
群3、包囊膨大；芽孢通常球形，端生到亚端生；革兰氏阳性、阴性或可变不水解淀粉；生长不需要脲素或碱性pH...........................................球形芽孢杆菌
2、2分子分类法
《伯杰氏系统细菌学手册》指出：（1）DNA-DNA同源性在60%以上通常认为是同一种；（2）同源性在20-60%之间认为是同一属中的不同菌种；（3）同源性在20%以下的应考虑是不同属的菌种。随着技术的发展，芽孢杆菌的分类逐渐由传统的表型分类转化为分子分类，如G+C mol%、DNA重组试验、DNA-DNA杂交、PCR技术、16s rDNA序列测序等等。
G+C mol%分析：DNA含有A、G、C、T四种碱基，一般生物个体的DNA分子中（G+C）/(A+T)的比例是非常稳定的。G+C mol%的测定常用于验证已建立的分类关系是否正确，是细菌分类鉴定的基本方法，并作为描述细菌分类单位的特征之一。测定方法有熔点法（Tm 值法）、浮力密度法、高效液相色谱法等。通常认为，种内菌株间G+C mol%相差不超过4%，属内菌株间的差异不超过10%。对芽孢杆菌的G+C mol%变化大约在33~65%,说明种还可以划分为几个遗传同源性的种类。
DNA-DNA杂交；DNA同源性分析是确定正确的分类单位，建立自然分类系统的最直接方法，而DNA-DNA杂交是分析DNA同源性的一种有效手段。利用DNA杂交可以在总体水平上研究菌株之间的关系，用于种水平上的分类研究。1987年国际系统细菌委员会规定：DNA同源性≥60%为细菌种的界限，DNA同源性≥70%是同一亚种，同源性在20~60%之间为同属不同种。在细菌分类中DNA杂交已被确定为建立新种的必要标准之一。常用的方法有液相复性速率、固相膜杂交法、羟基磷灰石吸附法、S1核酸酶法等。
由于16S rDNA基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。Masataka Satomi等从宇宙飞船设备上得到一些分离物，经试验分离证明是一种细菌，16S rRNA序列系统发育分析表明是属于芽孢杆菌属，与Bacillus pumilus(短小芽孢杆菌)很相近但又有很多表型不同的地方，DNA-DNA、rep-PCR表明是芽孢杆菌的一个新种，命名为Bacillus safensis。根据16S rRNA序列系统发育分析、DNA-DNA杂交，Cheok Jeon等将Bacillus haloalkaliphilus 从芽孢杆菌属中分离出一个新属Alkalibacillus, Bacillus haloalkaliphilus命名为Alkalibacillus haloalkaliphilus。Ibrahim M Banat等对Bacillus pallidus进行16S rRNA测序构建系统发育树，分析得出Bacillus pallidus 与芽孢杆菌属有很大的区别而和Geobacillus很相近，故将它归入Geobacillus属。所以利用
分子技术可以根据菌的基因进行鉴定，提高芽孢杆菌的分类地位划分的更准确。微生物的分类地位进行初步判断流程如下：
目的菌总DNA的提取→16S rRNA的PCR →16S rRNA序列测定→与Genbank中已知序列进行Blast比对→找出相似性最高的序列→将所得序列排序比→用建树软件建树状图→判定目的菌的分类地位或系统发育地位
2、3化学分类
以微生物化学组成成分为指标进行微生物分类研究的学科称为微生物的化学分类学。化学分类技术是检验微生物的某些化学成分而不是其生物学特征，微生物中含有一些化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类地位密切相关，能够标志某一类或某几种微生物的存在，称为生物标志物。这些具有分类学意义的化学物质的存在状态可以作为鉴定微生物的标志。很多仪器分析手段如高效液相色谱、气相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用等，逐渐在微生物分类和鉴定中显示出强大的功能。
脂肪酸分析细菌细胞内的脂肪酸易于提取和分离，经过甲酯化后挥发性大大改善，稳定性好，很适合于气相色谱分析。在细菌分类学中，气相色谱是分析细菌脂肪酸成分的主要工具。脂肪酸是细菌细胞中一种含量较高的、相对较稳定的化学组分，只要存在于细胞膜等生物膜脂双分子层以及游离的糖脂、磷脂、脂蛋白等生物大分子中。已有的研究结果表明，各种细菌中存在300多种脂肪酸及脂肪酸衍生物。种类不同的细菌含有的脂肪酸的种类和含量有一定的差别，人们可以根据脂肪酸的不同含量对未知菌株进行鉴定命名。脂肪酸对于不同生物油不同的成分特征，是细菌分类的重要指标和依据。目前，脂肪酸成分分析已成为芽孢杆菌分类鉴定的一种新手段，通过脂肪酸成分分析可以将未知菌快速鉴定到种属。宋亚军等人对若干需氧芽胞杆菌的芽孢脂肪酸成分进行了系统分析，并探讨了其在分类学上的意义，为需氧芽胞杆菌的分类研究提供了新的资料。
醌组分分析细菌细胞膜上的醌有泛醌（辅酶Q）和甲基萘醌（MK）。甲基萘醌的侧链由不同的异戊烯单位构成，根据侧链长度和双键氢化的程度可分为多种类型。不同类型由甲基萘醌的有无与含量是属和种鉴定中的一个重要指标。
磷酸类脂分析磷酸类脂是一种极性脂类，是构成细胞膜的重要成分。研究表明具有分类学意义的磷酸类脂为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甲基乙醇胺、磷脂酰甘油、含葡萄糖未知结构的磷酸类脂等。
全细胞蛋白SDS-PAGE分析全细胞蛋白SDS-PAGE是一种通过分析蛋白电泳图谱来获取分类信息的技术。在高度标准化的培养条件下它是一种分群和大量比较相近菌株的较好方法。该方法的一个优点是它与DNA杂交分析结果有很好的相关性，适用与种的水平上的区别。
第二、芽孢杆菌的分离、保存与鉴定
一、微生物分类鉴定主要是采用多相分类法，综合表型特征、化学特征、分子测序等方法。本次运用生理生化特征、脂肪酸鉴定等方法对分离的芽孢杆菌菌株进行鉴定，并对脂肪酸鉴定和ITS测序两种鉴定方法进行了比较。
二、方法
2、1芽孢杆菌的分离方法
采用稀释涂布法从土壤中分离芽孢杆菌，实验方法操作参照钱存柔、黄仪秀编著的《微生物学实验教程》。具体方法如下：
①称样称取10g土壤至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡15min，使之充分溶解，即配成10^（-1）浓度；②稀释吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管，即配成10^（-2）浓度，再次稀释成10^（-3）；③水浴将稀释好的土样溶液放在80℃水浴锅水浴10min，
期间振荡2-3次；④涂布超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10-20s，吸取100uL至相应标记浓度的平板上，溶液滴至平板中央，涂布棒涂匀。每个梯度重复3次；⑤培养将涂好的平板用倒置于30℃恒温箱中培养1-2d；⑥划线分离选取要纯化分离的芽孢杆菌菌株并编号，纯化后30℃培养箱中培养；⑦结果计算每克土样中芽孢杆菌的数量=同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品克数。
2、2 芽孢杆菌的保存
采用甘油冷冻保存和穿刺保存法，甘油冷冻保存菌株放于-80℃超低温冰箱，穿刺保存放于室温。
2、3 芽孢杆菌的鉴定
2、3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定
试验方法是参照东秀珠等编的《常见细菌系统鉴定手册》。
生理特性①温度梯度培养测定温度（℃）有5,10,15,30,37,50,55，采用连续划线法取幼龄菌种划线培养，设3个重复，2d后观察结果。pH梯度有4.5，5.7，7.2，8.0，9.5，取幼龄菌种划线接种，设3个重复，2d后观察结果。耐盐NA培养基中加入不同浓度的NaCl （2%、5%、7%、10%），取幼龄菌种接种培养，设3个重复，培养3和7d，目测生长情况。②丙二酸利用培养基为酵母膏1.0g，（NH4）SO4 2.0g，K2HPO4 0.6g，NaCl 2.0g，丙二酸钠3.0g，溴百里酚蓝0.025g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.4，分装试管，121℃灭菌15min,同时有不加丙二酸的空白对照。用幼龄菌接种，设3个重复，适温培养1-2d，培养基由绿变蓝者为阳性；培养基不变色者为阴性。③柠檬酸盐利用培养基为NaCl 1g，MgSO4.7H2O 0.2g（NH4)2H2PO4 0.5g，柠檬酸钠2g，0.04%酚红液20mL，蒸馏水1000mL，pH7.0分装试管，121℃高压灭菌15min。斜面上划线接种，适温培养3-7d，培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。
生化特性①接触酶将24h培养的菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生为阳性，否则为阴性。②氧化酶在干净培养皿里放一张滤纸，滴上四甲基对苯二胺的1%溶液，刮取菌苔涂抹在滤纸上，菌苔10s蓝色为阳性，10-60s 变蓝为延迟反应，60s后为阴性反应。
葡萄糖氧化发酵培养基为蛋白胨2g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，溴百里酚蓝1%水溶液3mL，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2,121℃蒸汽灭菌20min。以18-24h 幼龄菌种做种子，穿刺接种，每株4支。其中两支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡，高压灭菌）封盖，约0.5-1cm厚，以隔绝空气为闭管。另2支不封油为开管，同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1，2，7，14d观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。
淀粉水解NA培养基（牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7.2），0.2%可溶性淀粉，取新鲜培养物点中于在肉汁胨中加入0.2%可溶性淀粉平板，适温培养。培养2-5d后观察形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色的透明圈，表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。
M.R反应培养基为蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。试剂为甲基红（甲基红0.1g，95%乙醇300mL，蒸馏水200mL）。接种实验菌于上述培养基中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红阳性反应，黄色为阴性反应。（甲基红变色范围是4.4红至6.0黄）。
V-P反应培养基为蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。试剂为肌酸0.3%或原粉，NaOH 40%。接种实验菌于上述培养液中，每次3个重复，置适温培养2d，6d观察结果。取培养液和40%氢氧化钠等量混合，加少许肌酸，10min 后培养液若出现红色，即为阳性反应，否则为阴性。有时需要放置更长时间才出现红色反应。
硝酸还原反应培养基为肉汁胨培养基牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，KNO3 1g，pH 7.0-7.6，121℃蒸汽灭菌15min。A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%）150mL；B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%）150mL；二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5d，每株菌作2个重复，另留两管不接种作对照。取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养1，3，5d的培养液，再各加一滴A液和B液，在对照管中加入同样A液及B液一滴；当培养液中滴入A、B液后，溶液如变粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原反应；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，按硝酸盐还原阳性处理。
吲哚反应培养基为1%胰胨水溶液；pH7.2-7.6，分装试管，121℃灭菌20min。试剂为对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇760mL，浓HCl 160mL。把新鲜的菌种接种于上述培养基中，适温培养。培养1，2，4，7d后，沿管壁缓缓加入3-5mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加入4-5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮于液面后再加吲哚试剂。
明胶液化培养基为蛋白胨5g，明胶100g，水1000mL，pH7.2-7.4，分装试管，121℃灭菌15min。取24h的培养菌穿刺接种，并有2支空白对照。30℃培养箱中培养2d后放在冰箱中，7，10，14，30d后观察是否液化。
2、3、2 芽孢杆菌的脂肪酸鉴定
脂肪酸提取方法主要是参照MIDI操作手册，具体如下：①获菌挑取约40mg菌苔放入一个干净、干燥13mm×100mm有螺旋盖的试管中。②皂化加入1.0±0.1mL的试剂1，拧紧盖子，振荡试管5-10s，沸水浴5min，取出振荡5-10s，拧紧盖子，继续水浴25min，试管移至室温冷却。③甲基化加入2.0±0.1mL的试剂2，拧紧盖子振荡5-10s，精确控制（80±1）℃水浴10min，移开且快速用自来水冷却至室温。④萃取加入1.25±0.1mL的试剂3，拧紧盖子，快速振荡10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层似水部位。⑤基本洗涤加入3.0±0.2mL的试剂4，拧紧盖子，快速振荡5min，取出约2/3体积的上层有机体到干净的GC小瓶。⑥上样，鉴定。
3、讨论
3、1芽孢杆菌的生理生化鉴定
细菌的生理生化性状具有可变性，使用不同的化学药品得出的鉴定结果可能会有一些的差异。所以很难用常规的生理生化指标将细菌鉴定到种。一般，生理生化指标只作为鉴定的辅助手段，描述微生物的一些基本特征。
3、2芽孢杆菌的脂肪酸鉴定
MIS是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作简单、安全、快速，实验成本也相对较低。它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2200种。
刘志辉等应用气相色谱技术分析全细胞脂肪酸进行分枝杆菌菌种鉴定，和传统鉴定方法结果具有良好的一致性。脂肪酸的鉴定和16S rRNA 的序列相似性分析对微生物分类鉴定有着同等重要地位，每种菌特征脂肪酸的种类和含量不同，根据特征脂肪酸可以将未知菌快速鉴定到种或属。
三、芽孢杆菌鉴定方法的比较
微生物种类繁多，以形态学和生理生化指标为基础的细菌鉴定较为复杂，而且是一项繁琐、费时的工作，对一种未知细菌的鉴定和分类，不仅需要分析多个生化指标，有时还要取决于工作人员的经验。近几年，随着核酸测序技术的普及和测序周期缩短、成本降低，细菌核酸序列数据库的不断充实，16S rDNA全序列和16S-23S rDNA间的内源转录间隔区序列测定已成为细菌的快速鉴定方法。但分子方法操作比较复杂，成本高且局限于典型性已鉴定的菌株。因此迫切需要建立一些简单、方便、易于操作的分类鉴定方法对微生物进行分析，使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到分离物的分类地位。
现代微生物学研究表明，细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的DNA具有高度的同源性，不同种属的细菌脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，并且这种差异是比较稳定的，根据脂肪酸成分可以将未知菌株快速鉴定到种或属。
三、芽孢杆菌的生态分布及多样性
一、芽孢杆菌的形态特征
芽孢杆菌的形态特征包括细胞形态和菌落形态特征。芽孢杆菌细胞为杆状，直或近直，长生芽孢。如图描述了3种芽孢杆菌的细胞形态，a-d为简单芽孢杆菌的细胞形态：a为没有形成芽孢时的细胞形态，b-d为产生芽孢后的形态，从图中可以看出简单芽孢杆菌的芽孢中生，柱形或椭圆形。图片e为类芽孢杆菌的细胞形态：细胞小，短杆状，芽孢中生，近卵圆形。f为枯草芽孢杆菌的细胞形态：细胞长杆状，芽孢中生，柱状。
芽孢杆菌菌落形态根据种不同而不同，以下描述了几种常见芽孢杆菌的菌落形态：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)白色或浊白色，扁平，干燥，无光泽，表面的层膜状物形成褶皱，有的菌落中间有“水珠”，还有一株芽孢杆菌的菌落形态和其他完全不同，浅黄色，突起，近圆形，光泽，湿润。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)黄色，湿润，光滑，不透明，粗壮，具有流动性，有的菌落表面微皱，菌落培养久时会产生黑色色素。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)白色，扁平，圆形，边缘不整齐，有的布满整个平板，和覃状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)的菌落相似。球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus)浅黄色，圆形，有光泽，不透明，有时连成一片布满整个平板。多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)菌落小，米粒状，粘，紧贴培养基，不易挑取。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)黄色，湿润，边缘不整齐，突起。
二、芽孢杆菌的生态分布
2、1我国芽孢杆菌的种群数量
从表9中可以看出，巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个样点都能分离到，除青海外，每个样点都能分离到蜡状芽孢杆菌。15个采样点分离出12个芽孢杆菌种群，每个样点之间芽孢杆菌种群数量差异很大。每个采样点数量最多的芽孢杆菌菌种群分别为：吉林采样点的是巨大芽孢杆菌干土，新疆的为蜡状芽孢杆菌干土，内蒙古的为蜡状芽孢杆菌，甘肃的为巨大芽孢杆菌干土，宁夏的为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）干土，青海的为巨大芽孢杆菌干土，西藏的为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)干土，陕西的为简单芽孢杆菌干土，山东的为巨大芽孢杆菌干土，上海的为蜡状芽孢杆菌干土，江西的为蜡状芽孢杆菌干土，四川的为蜡状芽孢杆菌干土，广东的为短小芽孢杆菌干土，云南的为为蜡状芽孢杆菌干土，海南的为巨大芽孢杆菌干土。
根据优势种群的划分标准，某个物种占整体的百分比≥10%为优势种，1-10%之间为常见种，≤1为少见种。从表10可以看出，吉林采样点的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为多粘类芽孢杆菌，少见种为蜡状芽孢杆菌和球形芽孢杆菌；新疆的优势种群为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillus atrophaeus)，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，少见种为苏云金芽孢杆菌；
内蒙古优势种群为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为球形芽孢杆菌，少见种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种、多粘类芽孢杆菌；甘肃的优势种群为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，常见种群为简单芽孢杆菌；青海的优势种群为巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌；西藏的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；陕西的优势种群为简单芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种，山东的优势种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌，常见种群为蜡状芽孢杆菌；上海的优势种群为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；江西的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；四川的优势种群为蜡状芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌；少见种群为巨大芽孢杆菌；广东的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌；云南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，常见种群为巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌；海南的优势种群为蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，常见种群为简单芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌黑色变种。
2、1我国芽孢杆菌种群的多样性
从表11可以看出，15个分离到的采样点芽孢杆菌的丰富度在2-8之间。青海采样点的分离到的种群最少，只分离到2种，新疆、内蒙古和宁夏的芽孢杆菌丰富度最高，为8。陕西、四川和海南的丰富度为6，甘肃、江西、上海、广东、云南的物种丰富度为5，西藏的丰富度为3。15个采样点芽孢杆菌的多样性指数范围在0.2657-1.5586之间，西藏、内蒙古、陕西、青海、上海、四川芽孢杆菌的多样性指数在1.0000以下，其他采样点的多样性指数在1.0000以上，在1.0017-1.5586之间。新疆采样点的多样性指数最高，达1.5586，西藏采样点的多样性指数最低，仅为0.2657。均匀度指数在0.2419-0.9182之间，3个采样点的均匀度指数在0.5000-0.7000之间，4个采样点的均匀度指数在0.7000-0.8000之间，3个采样点在0.8000-1.0000之间，其中均匀度指数最高的是江西样点，最低的是西藏样点。生态优势度指数在0.2136-0.8199之间，最高的西藏样点，达0.8199，最低的是海南样点，只有0.2136。
从表11中可以看出，新疆样点的物种丰富度和多样性指数最高，其均匀度指数较高，生态优势度指数较低，西藏的物种丰富度较低，多样性指数和均匀度指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量差异程度有一定的关系。
2、3芽孢杆菌的生态分布
巨大芽孢杆菌和简单芽孢杆菌在每个采集样点都能分离到，除青海外，每个样点也都能分离到蜡状芽孢杆菌。每个采集地的芽孢杆菌的多样性不一致，新疆样点的丰富度和多样性指数最高，生态优势度很低；西藏的物种丰富度较低，多样性指数最低，生态优势度指数最高。生态优势度指数反映了各物种种群数量的变化情况，生态优势度指数越大，说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出。相同生境类型不同地理位置的生物多样性也不同。由此说明物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与种群数量的差异程度有一定关系。
土壤是微生物生活的大本营，存在大量的芽孢杆菌，芽孢杆菌的种类直接反应土壤的生态状况。石春芝等对神农架自然保护区九大湖调查认为蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和覃状芽孢杆菌是主要种类，巨大芽孢杆菌也有分离，但不是主要种类。张华勇等研究红壤不同生态条件下芽孢杆菌的变化情况中发现，巨大芽孢杆菌随耕作程度增加逐渐成为优势。本文采用的稀释平板法虽然不能全面反映采样地的实际情况，但可以反映芽孢杆菌在土壤中的存在情况。
四、主要菌株的分离与鉴定
（一）苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定
苏云金芽孢杆菌（Bt）是一类革兰氏阳性、产芽孢、不同亚种可产生不同形状蛋白晶体的杆状细菌。其晶体蛋白已成为应用最成功、前景最好的生防农药。苏云金芽孢杆菌广泛分布于昆虫、土壤、仓贮尘埃、污水之中。基于土壤蕴含着丰富的微生物资源及地域多样性赋予了土壤中微生物种类多样性的特点，土壤成为筛选不同种类和基因型Bt原始菌株的最普遍、最直接的来源。自20世纪80年代以来，Bt分离方法力求快速、高效而不断改进并趋于成熟，全世界被分离出的Bt数量大大增加，种类增加。故鉴定Bt类别成为一项重要的基础性工作。
1、苏云金芽孢杆菌的分离
1、1温度筛选与其他芽孢杆菌相同，苏云金芽孢杆菌的芽孢由外向内分为芽孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢内壁、原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞所具有的多聚糖磷壁酸，所以皮层保持着芽孢的脱水状态和耐热性，另一方面，芽孢形成过程中，会产生大量DPA-Ca螯合物，使得芽孢中的生物大分子形成耐热凝胶，在80℃下热处理20min，苏云金芽孢杆菌芽孢也不会死亡。而且休眠的芽孢在75℃的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但可促其快速萌发，还可提高芽孢的成活率。依据这一特性，可实施温度筛选。温度筛选分离范围广，不易漏筛，但工作量大，而且Bt要达到一定浓度。
1、2利用醋酸钠进行选择筛选苏云金芽孢杆菌芽孢的萌发，直接受pH值影响：当pH值为7.0时，芽孢萌发率在85℃以上；当pH低于6.5或高于8.5时，芽孢萌发率极低。因此，加入适量醋酸盐的培养基可选择性地抑制Bt芽孢的萌发，经热处理而被杀死，从而消除干扰菌以达到高效分离筛选的目的。用该方法筛选Bt，可有效抑制蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的生长，使得菌落与Bt类似的干扰菌大大减少。
1、3弹土分离法该方法简便，易操作。将土壤样品干燥后研碎，撒在灭菌的滤纸上，使滤纸面上均匀粘上一层样品粉末，使粘有样品的一面对着培养皿口，轻弹1~2次，然后培养。检出时，由于菌落种类多，数量大，影响目的菌落的特征识别；另外非目的菌落（芽孢菌菌落和真菌菌落）的存在，给纯化带来难度。
1、4抗生素选择性筛选抗生素能纯化酶的活性，阻止微生物新陈代谢的某些环节，从而对微生物产生选择性作用。芽孢杆菌中，由于芽孢衣皮层致密、通透性差，抗生素不能进入芽孢内部，无法抑制其萌发和生长。不同种、属的芽孢对抗生素有不同的抗性。苏云金芽孢杆菌除与地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌抗性类似外，较其他常见芽孢杆菌抗性显著。抗生素筛选检出率高，效果显著，但由于苏云金芽孢杆菌各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种会因抗生素浓度相对过高而不能形成芽孢和伴孢晶体，因此，抗生素筛选会造成个别亚种的漏筛。将醋酸钠、抗生素分离法合二为一，可显著消除干扰菌，使得土壤悬液的可操作浓度较单一使用醋酸钠或抗生素法高出20~30倍，大大提高Bt的分离效率和出土率。
2、苏云金芽孢杆菌的分类鉴定
苏云金芽孢杆菌被归属为第12类第18群芽孢杆菌的一个种，种下还区分不同的亚种。随着苏云金芽孢杆菌新菌株的不断发现，各种分类方法也被相继提出：将苏云金芽孢杆菌分为不同的亚种、变种、血清学、晶体基因型。鉴定方法主要包括生理生化试验、酯酶法、晶体抗原法、鞭毛抗原法。
2、1生理生化鉴定苏云金芽孢杆菌各亚种的生理生化特性存在着正与负、强与弱的不同。它们对一些反应会产生不同的阴性或阳性特征，将各指标综合起来，就构成亚种划分的标准。
后来随着热解气相色谱法鉴定问世，由于烃类代谢的数量和种类不同，苏云金芽孢杆菌大多数亚种都能得到有明显差异的“指纹图”，热解气相色谱法鉴定苏云金芽孢杆菌省时、快速，为鉴定过渡到使用现代化技术展现了广阔的前景。
2、2血清型鉴定苏云金芽孢杆菌的鞭毛主要由鞭毛蛋白质组成，它具有抗原的特性。在苏云金芽孢杆菌的鉴定中，血清型是一项重要的鉴定指标，这项指标特异性强，稳定可靠，被普遍接受和采用。1962年，Barjac对24个产晶体的品系进行生理生化和血清型研究，将Bt分列为6个血清型下的8个亚种。到2006年7月，Bt血清型已达到71个，血清型亚种达到94个。
3、苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定
随着生物化学、遗传学、分子生物学等学科的发展，1981年美国的Szhnepf和Whiteley 克隆了苏云金芽孢杆菌的第一个cry基因（编码苏云金芽孢杆菌蛋白晶体的基因被称作cry 基因），并于1985年发表了它的核酸序列。1989年该基因被命名为cryIAa，标志着Bt鉴定的研究进入了分子时代。1995年，Cricknore等在第28届国际无脊椎动物病理学年会上提出了新的cry基因命名原则，使得cry基因的分类趋于完善。现行分类系统根据δ-内毒素氨基酸序列的同源性确定出4个分类等级。
血清型等鉴定结果不能反映出Cry蛋白的类型，因此菌株命名与杀虫活性之间失去了联系的纽带，通常cry1、cry2、cry9编码蛋白对鳞翅目害虫有杀灭活性；cry1B、cry1I、cry3、cry7、cry8、cry18编码蛋白对鞘翅目害虫具有毒力；cyt1、cyt2、cry2、cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19、cry24、cry25、cry27、cry29、cry30、cry32、cry39、cry40编码毒杀双翅目害虫的蛋白；cry5、cry6、cry12、cry13、cry14、cry21编码蛋白可杀灭线虫。Cry基因的PCR扩增技术，不仅可以鉴别Bt菌株cry蛋白的杀虫特性，还能找到新型菌株，对于研究Bt资源的多样性，预测其杀虫活性具有重要意义。
3、1 PCR-RFLP鉴定1996年台湾学者Kou和Chak创立了一种新的鉴定方法，即PCR-RFLP法，适用于对多种基因型的通用引物进行PCR扩增。用2种特异性内切酶消化扩增产物，根据不同的基因型会产生不同长度的酶切片段，经电泳分析，记录差异来断定菌株的基因型。目前，中国农科院植物保护所宋福平等进一步优化了cry2、cry3、cry4/10的通用引物，将鉴定级别提高到了cry基因的第3等级，并进一步将台湾学者鉴定的11种cry1/7/9基因型扩大到29种。Sauka等利用cry1I的PCR-RFLP鉴定体系成功对202株Bt 菌株进行了鉴定。
3、2特异性PCR鉴定特异性PCR鉴定是在PCR基础上建立的复合引物鉴定方法。其引物有通用引物和高度同源的特异性引物之分，如以色列等人用通用引物从菌株中鉴定出cry9基因后，又用特异性引物区分出cry9A、cry9B、cry9C、cry9D，并检测出一株推测应为cry9E 的新菌株。这种方法用于鉴定已知基因是准确的、特异的，但对于新基因鉴定还需借助其他研究方法，并且特异性引物系统设计耗时、耗资金。
3、3杂交鉴定
3、3、1核酸分子杂交不同cry基因可能会有45%的同源性，但在染色体上的保守区域中，同源性高达95%。因此，可设计保守区探针核和可变区探针来检测新的Bt基因。澳大利亚学者Beard等在用杂交方法鉴定cry新基因时，设计并使用了8个基因家族（10个不同cry 基因）的通用探针，他们将实验分为2步，第1步用通用探针做Dot blot analyses，然后用特异性探针做Southern blot analysis，确定被检测出基因的基因型，再对比2步试验的结果，找出新型基因。但此方法首先要设计并合成大量DNA探针，并且较PCR鉴定耗时费力，新基因确定的类型仍然未知，需要借助其他方法作进一步鉴定。
3、3、2基因芯片基因芯片的杂交可高效测定微生物中某一特定序列并进行全基因组水平检测，比较不同样品间mRNA转录及表达水平，从而揭示不同生长条件、发育阶段、药物
处理情况下的基因表达。目前PCR-Based芯片技术和寡聚核苷酸探针设计也被应用于cry 基因的鉴定。如刘旭光等建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡聚核苷酸芯片从Bt总DNA 中检测cry基因类型的方法，检测结果具有很高的可信度。应用寡聚核苷酸做探针，可大规模、高通量、真实地反映基因组中存在的功能基因，鉴定方法是适应基因组时代的强有力的技术之一。
4、cry蛋白鉴定
对cry蛋白进行鉴定可最直接、最准确地获得Bt基因型，杀虫活力等相关信息，并可确定哪些基因被表达。Masson等研究蛋白时，用胰蛋白酶消化被测蛋白，用高效液相色谱对蛋白进行分析，在同标样相比较时，成功地分辨出cry1C、cry1D、cry1Ab的存在。但此法仅适用于对已知基因所表达的蛋白的鉴定。目前，对于cry蛋白测序而言，虽然真实性非其他方法所比拟，但由于存在许多技术性问题，如纯化、费用昂贵、步骤繁琐，较基因操作复杂等，还不具备应用条件，但它最具科学性，最具有发展前景。
（二）枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定
枯草芽孢杆菌是一种短杆状、无荚膜、能运动的革兰氏阳性细菌，内生芽孢，其分布非常广泛，在土壤、湖泊、海洋、动植物体表等处皆能发现。枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其制剂是无毒、无残留、无污染的绿色添加剂，故具有广阔的发展前景，并在饲料添加剂、污水处理、生物农药、疫苗载体等各方面已经得到了广泛的应用，显示了巨大的社会效益和生态效益。试验自土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌，并对该菌株进行了鉴定，旨在为枯草芽孢杆菌基因功能的研究以及进一步开发利用奠定基础。
1、材料与方法
1、1试验样品新鲜土壤，从山东省菏泽市某村田地土壤表层约10cm下采集的肥土。1、2试剂高保真Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶，pMD18-T载体，超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout（G+），E.coli DH5α感受态细胞。
1、3样品的热处理将采集的新鲜土壤加到营养肉汤培养基中，37℃培养18~24h，然后放于75~80℃水浴中热处理10~15min。
1、4细菌的分离将热处理后的培养物用平板划线分离法涂布于普通琼脂平板上，37℃培养18~24h；选取生长良好的菌落反复接种，经数次琼脂培养基培养筛选，挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯培养。
1、5细菌的鉴定
1、5、1细菌的生化鉴定根据《伯杰细菌鉴定手册》对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。
1、5、2细菌的PCR鉴定引物的设计与合成：根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列应用Primer Premier 5.0软件自行设计合成了1对能扩增1154bp基因片段的引物，序列为P1 5’-CACTGG-GACTGAGACACGG-3’，P2 5’-GGCGGCTGGCTC-CTAAAA-3’。
枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取：挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5mL营养肉汤中，37℃振荡培养过夜，参考细菌DNAout（G+）试剂盒说明书提取全基因组。
PCR体系与反应条件：以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增。反应体系（25uL）：DNA模板2uL，10×PCR Buffer 2.5uL，上、下游引物（25umol/L）各0.5uL，dNTP 2uL，Taq DNA聚合酶0.25uL，ddH2O17.25uL。优化的PCR 反应条件：94℃5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。PCR结束后，取5uL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。
目的片段的回收、纯化及序列测定：参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段，然后将其与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑斑，扩大培养，抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，将鉴定为阳性克隆的菌液测序。
16S rRNA基因序列分析：利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑，并与GenBank中的序列进行同源性比较。
2、结果
2、1细菌的形态特征
在普通营养琼脂平板上，菌落为圆形，边缘不规则，表面有皱褶，挑取单个菌落涂片，可见革兰阳性、直杆状细菌，常成对或呈链状排列，在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下形成芽孢。
2、2生化特性鉴定结果
细菌的生化鉴定结果为接触酶反应阳性，利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸，利用柠檬酸盐，不利用丙酸盐，不形成吲哚，水解淀粉，可使明胶液化。
上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性，初步证明分离菌为枯草芽孢杆菌。
3、讨论
（1）根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性，试验采用的75~80℃水浴中热处理10~15min的样品处理方式，从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性，使分离细菌的操作简单化。
（2）本试验从新鲜土壤中分离得到1株革兰阳性杆菌，其形态特征以及生理生化特征与文献报道的枯草芽孢杆菌的特性是一致的，但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性，因此用常规的生理生化指标测定很难得到准确的鉴定结果。枯草芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌细菌形态特征及其生理生化特性及其相似，在伯杰氏细菌鉴定手册（1984年版）和国内其他参考文献中都没有查到这两类菌的明显的区别，因此从形态特征及其生理生化特性只能初步证实分离细菌为枯草芽孢杆菌。
（3）为进一步证实分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌，试验在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S rRNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛，已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。16S rRNA是核糖体小亚基的骨架，在结构上分为保守区、半保守和非保守区，保守区序列基本恒定，半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异，一般不同属细菌16S rRNA基因同源性为70%~90%，而同种内不同株间基因同源性>99.5%。本试验扩增的16S rRNA基因序列与GenBank中的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因的同源性达到99.6%，大于99.5%，进一步说明分离细菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。本试验分离的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌功能基因及其相关研究奠定了基础。
酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌简介
由于具有防病、治病、促进动物生长、提高饲料转化率等功效，抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖业生产中被普遍使用。 大量科学研究已经证明，对动物长时间地使用抗生素添加剂，会导致动物体内微生物的耐药性不断增加，动物自身对疾病的抵抗能力越来越差，治疗时使用的抗生素剂量也随着越来越大。人食用了含有抗生素的食物，相应地也会增加人体内微生物的抗药性。30年前，人注射青霉素20万单位就可以了，后来逐渐发展到80万、100万甚至更高。不但危害人民的身体健康，而且还影响养殖业的健康发展。 生物无抗生素饲料可从仔猪营养方面着手，通过添加柠檬酸、酶制剂、益生素、氧化锌、纳米蒙脱石等措施控制仔猪腹泻。 乳酸杆菌 乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能。大量研究资料表明，乳酸菌能促进动物生长，调节胃畅道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。 乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表向成分等物质具有生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。 1．提供营养物质，促进机体生长 乳酸菌如果能在体内正常发挥代谢活性，就能直接为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素（维生素B族和K等)，还可提高矿物元素的生物活性，进而达到为宿主提必需营养物质、增强动物的营养代谢、直接促其生长的作用。研究报道乳酸菌可以改良水质，提高斑节对虾的存活率、生长速率和健康状况。试验证明，小麦、稻米等谷物进行乳酸发酵后，营养价值大大提高。此外，乳酸菌产生的酸性代谢产物使肠道环境偏酸性，而一般消化酶的最适PH值为偏酸性(淀粉酶6.5、糖化酶4．4)，这样就有利于营养素的消化吸收。何机酸的产生还可
芽孢杆菌常用培养基配方
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ，蒸 馏水1000ml ，琼脂18g 。调节PH7.2,0.1MPA20min 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL 液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g,磷酸 氢二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节PH7.3 —7.5Mpa 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节PH7.2，分装试管，0.06Mpa，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06Mpa-20min，带冷至45-50摄氏度时， 速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察
食品微生物学-试卷
食品微生物学试卷 一. 填空题（1分/空×20）：1. 细菌一般进行___⑴__ 繁殖，即__⑵_。酵母的繁殖方式分为有性和无性两类，无性繁殖又可分为__⑶__ ，__⑷__ 两种形式，有性繁殖时形成__⑸_ ；霉菌在有性繁殖中产生的有性孢子种类主要有__⑹__ ，_⑺__ ；在无性繁殖中产生的无性孢子种类有_⑻_ ，__⑼__，__⑽__ ；放线菌以__⑾__ 方式繁殖，主要形成__⑿__ ，也可以通过___⒀__繁殖。2. 微生物污染食品后，对人体造成的危害主要是引起___⒁_______和_____⒂_____。 3.在酵母菌细胞结构中，____⒃_____具有保护细胞及维持细胞外形的功能；____⒄____具有控制细胞对营养物及代谢产物的吸收和交换作用；____⒅_____是细胞进行生命活动，新陈代谢的场所；___⒆______是呼吸酶类的载体，细胞的能量供应站；_____⒇____具有传递细胞遗传性状的作用。 二.选择题（1分/小题×20）1.革兰氏染色的关键步骤是___a.结晶紫（初染） b.碘液（媒染）c.酒精（脱色） d.蕃红（复染）2. 属于细菌细胞基本结构的为___a.荚膜 b.细胞壁 c.芽孢 d.鞭毛3.测定食品中的细菌总数常采用_____a.稀释混匀平板法 b.稀 释涂布平板法 c.显微镜直接镜检计数法4.干热灭菌法要求的温度和时间为___a.105℃，2小时 b.121℃，30分钟c.160℃，2小 时 d.160℃，4小时5.微生物运输营养物质的主要方式___a.单纯扩散 b.促进扩散 c.主动运输 d.基团转位6. Saccharomyces cerevisiae有性繁殖产生____a.接合孢子 b.担孢子 c.孢囊孢子d. 子囊孢子7.以高糖培养酵母菌,其培养基类型为____ a.加富培养基 b.选择培养基 c.鉴别培养基 d.普通培养基8. 抗干燥能力较强的微生物是_________。a.酵母菌 b.霉菌菌丝 c.乳酸菌9. 产生假根是____的形态特征。a.根霉 b.毛霉 c.青霉 d.曲霉10.配制1000ml的固体培养基需加琼脂____a.0. b.2~7克 c.15~20克 d.50克11.食品和饮料工业生产上常采用的“巴氏灭菌法”是一种______方法。a.消毒 b.抑菌 c.灭菌 d.除菌12. 下列微生物器官耐温顺序为_____a.营养体＞孢子＞芽孢 b.芽孢＞孢子＞营养体c.孢子＞营养体＞芽孢 c.芽孢＞营养体＞孢子13.下列微生物能通过细菌滤器的是____a.细菌 b.酵母菌 c.病毒d霉菌14.下列不属于生长素类物质的是____a.氨基 酸 b.矿质元素 c.嘌呤碱基 d.维生素15. E.coli是______a. G＋菌 b.G－菌 c. G＋G－不定16. 在固体平板上,青霉菌菌落周围葡萄球菌不能生长,此种关系为____a.竞争关系 b.猎食关系 c.拮抗关系 d.寄生关系17.下列因素影响微生物生长_______a. pH b.温度 c.水分 d.这些都是18.细菌的生长曲线中，总菌数和活菌数几乎相等的是_____a.延缓期 b.对数期 c.稳定期 d.衰亡期19.罐藏食品的灭菌属于________a.消毒 b.灭菌 c.抑菌 d.商业灭菌20. 决定病毒感染专一性的物质基础是 ____a.核酸 b.蛋白质 c.脂类 d.糖类 三.判断题（1分/小题×10）1.真菌适宜在偏酸性的环境条件下生长。2.肉毒梭状芽孢杆菌属于厌氧性微生物。3.酒精消毒的最佳浓度为95%。4链霉菌是霉菌，其有性繁殖形成接合孢子。5.污染了赤霉菌毒素的食品原料，经处理后仍可用于加工食品。6.子囊孢子是半知菌纲霉菌的有性孢子。7.细菌产生芽孢是细菌的一种繁殖方式。8. 放线菌和霉菌都具有营养菌丝和气生菌丝。9.肠球菌对冷冻的抵抗力比大肠菌群细菌大。10. 自养菌可引起食品腐败。参考答案：一.填空：⑴无性⑵裂殖⑶芽殖⑷裂殖⑸子囊⑹子囊孢子⑺接合孢子⑻孢囊孢子⑼分生孢子⑽厚垣孢子（节孢子）⑾无性⑿分生孢子⒀菌丝片断⒁食物中毒⒂消化道传染病⒃细胞壁⒄细胞膜⒅细胞质⒆线粒体⒇细胞核二.选择题：cbaccdbaacabcbbcdbdb三.判断题：√√×√×××√√×四.分析问答题：1.从变质罐头中检出酵母菌和霉菌时，试分析引起罐藏食品变质的原因。∵酵母菌和霉菌的抗热性较差-----4∴从变质罐头中检出酵母菌和霉菌，则引起罐藏食品变质的原因可能是：a.罐头裂漏，被M污染（∵这些M的抗热性较差）。-----2b. 罐头杀菌不完全（残留霉菌孢子）------2c.罐内真空度不够（∵霉菌只能在有氧的环境中生长）。---2. 在微生物培养过程中引起PH值改变的原因有哪些？在实践中如何保证微生物能处于较稳定和合适的PH环境中？（10分）原因：①. 微生物分解基质中的蛋白质产氨，使PH值↑②.有机酸盐，使PH值↑③碳水化合物产酸，使PH值↓④. 无机氮盐（生理酸性盐、生理碱性盐）----6在实践中可通过在培养基中添加KH2PO4、K2HPO4或CaCO3使微生物能处于较稳定和合适的PH环境中。------3．根据你掌握的实验方法，在由枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌组成的混合菌悬浮液中，将上述菌进行分离、鉴别。（20分）用稀释平板分离法进行分离。⑴.在分离平板上，大肠杆菌、产气肠杆菌的菌落特征基本相同难以区分（菌落灰白色，半透明，表面光滑湿润，有光泽。）枯草芽孢杆菌的菌落较干燥用Gram染色法染色镜检，可见：大肠杆菌、产气肠杆菌为G-，短杆菌。枯草芽孢杆菌为 G+，长杆菌，有芽孢。根据以上特征可将枯草芽孢杆菌区分开来。⑵.将其它菌①.在EMB平板上划线、培养。在EMB平板上E.coli 的菌落较小，呈紫黑色，有时有金属光泽。产气肠杆菌大，灰棕色。②.接入葡萄糖.蛋白胨.水；蛋白胨.水；柠檬酸盐培养基中做生理生化反应E.coli MR+；VP-；I+；C-产气肠杆菌MR-；VP+；I-；C+4.气调保藏食品的原理（10分）∵①.在有氧的环境下，霉菌、酵母菌、细菌都有可能引起食品变质。而在缺氧只有部分酵母菌和细菌能引起食品变质。②.在有氧的环境中，因M的生长、繁殖而引起的食品变质速度较快。缺氧，由厌氧M生长引起的食品变质速度较缓慢。兼性厌氧M引起的食品变质速度也比在有氧环境中慢得多。即缺O2的环境中，a.可生长的M种类少；b.M生长的速度慢。在进行食品保藏时，可将食品储存在无O2环境（进行真空包装）or含高浓度CO2（40～80%）的环境中，以防止or 减缓M引起的食品变质。试卷二、
枯草芽孢杆菌简介及应用
枯草芽孢杆菌简介及应用 枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌（Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae) 的模式菌株，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。 枯草芽孢杆菌应用 枯草杆菌(B acillus Subtilis) 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。 ①枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。 ②枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水
细菌芽孢染色
微生物学实验报告 题目：细菌芽孢染色 姓名：学号：组别：年级班级： 同组者：时间： 【实验器材】 1．菌种：枯草芽孢杆菌。 2．染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 3．仪器、材料：二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。 【实验目的】 1．学习并掌握细菌的芽胞染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征。 2．巩固显微操作技术及无菌操作技术。 【基本原理】 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子(endospore)，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦被着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进如芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。 【操作步骤】 1．制片。 按常规方法涂片、干燥及固定。 2．加热染色。 向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3．脱色。 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 4．复染。 用0.5%番红水溶液复染2min。 5．水洗。 用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。 6．镜检。 将载玻片晾干后油镜镜检。 【实验结果】
枯草芽孢杆菌使用技术
枯草芽孢杆菌使用技术 制剂：1000亿活芽孢/克可湿性粉剂毒性：低毒级 枯草芽孢杆菌特点： 1、绿色环保――对人畜微毒、对环境无污染、对作物安全（本剂虽属细菌活体杀菌剂，但不会侵染作物引起病 害，亦不会对作物产生药害） 2、高效广谱――对水稻稻瘟病，西瓜、黄瓜、草莓、番茄等多种作物白粉病、灰霉病，马铃薯晚疫病，大豆、油菜菌核病，瓜类、谷物、三七等作物根腐病等多种真菌性病 害具有优良防效。 3、增产提质――枯草芽孢杆菌还能够分泌促进作物生长的活性物质，使植株叶片浓绿肥厚，提高作物免疫力，增产提质效果显著，发酵过程中产生多种氨基酸，对作物有生 长调节的作用。 枯草芽孢杆菌防治机理 １、竞争作用：通过生物间争夺氧气、营养物质及竞争
排它性，形成局部生物优势种群，防止其它菌侵入；同时争夺周围菌的营养，抑制病原菌生长―起到疫苗的作用。 ２、溶菌作用：枯草芽孢杆菌吸附于病原菌的菌丝上，随着菌丝生长而生长，从而消耗病原菌的营养，使病原菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，使病原菌失去进一步侵染 能力―起到寄生作用。 3、生物拮抗作用：枯草芽孢杆菌生长过程中能产生细菌素（枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌素）、有机酸、天然脂肽类化合物等，对病原菌抑制其生长或溶解其细胞壁、使细胞穿孔、畸形，最终杀死病原菌，。 ４、杀灭作用诱导作物产生抗病性、促进作物生长，增产提质。据统计，使用枯草芽孢杆菌可有效增产 5.6-20.2%。 枯草芽孢杆菌使用方法 1、稻瘟病、纹枯病、稻曲病。施药方法：水稻孕穗破口期和齐穗期各施药一次。每亩用枯草芽孢杆菌10克均匀 喷雾，喷药药间隔7-12天，
2、枯草芽孢杆菌与咪鲜胺、三环唑、井冈霉素等混用，有明显的相互增效作用。在病害集中、急性暴发时，更能显 示出混用的效果。 枯草芽孢杆菌使用注意事项 1、本品用量少，为减少浪费，兑药时应用小容器将所需用量药剂充分溶解后再倒入喷雾器中，加水至喷雾器最佳 水平线进行喷雾； 2、早上10点前或下午4点后施药，避免阳光直射，杀死芽孢。尤其是4点后用药，夜间潮湿的环境更有利于芽孢 萌发。 3、不能与铜制剂、链霉素等杀菌剂及碱性农药混用； 4、病害初期或发病前施药效果最佳，施药时注意使药 液均匀喷至作物各部位。
肉毒梭状芽孢杆菌简介
肉毒梭状芽孢杆菌 （一）、肉毒梭菌的生物学特性 肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)又称肉毒梭菌，属于厌氧性的梭状芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，杆菌。形成芽孢，由于芽孢比营养体宽，故呈梭状。无荚膜，但有鞭毛。 肉毒梭菌生长最适温度为25～35℃。当pH低于4.5或大于9.0时，或环境温度低于15℃或高于55℃时，肉毒梭菌芽胞不能繁殖，也不产生毒素。各型肉毒梭菌芽胞对热抵抗力有一定差异，但一般而言，对热抵抗力较强，干热180℃5～15分钟，或湿热100℃3小时，或高压蒸汽121℃10分钟才能将其杀死。肉毒梭菌是引起食物中毒病原菌中热抵抗力最强的菌种之一，所以罐头杀菌效果如何，一般以该菌作为指示细菌。在厌氧条件下，含水分较多的中性或弱碱性食品适于肉毒梭菌生长和产生毒素。反之，食物的性质偏酸，水分含量少或食盐浓度在8%以上，可抑制该菌的生长和毒素的形成。 根据所产生毒素的抗原性不同，将肉毒毒素分为A、B、C 、D、E、F、G型，引起人类中毒的有A、B、E、F型，其中A、B型最为常见。 （二）、食品中肉毒梭菌的来源 肉毒梭状芽孢杆菌是一种腐物寄生菌。在自然界广泛分布于土壤、江河湖海淤泥沉积物、尘土及动物粪便中。粮谷、豆类等食品受其污染的机会很多。A型菌多分布于山区和未开垦的荒地；B型多分布于草原区耕地；E型多分布于土壤、湖海淤泥和鱼类肠道中；F型
分布于欧、亚、美洲海洋沿岸及鱼体。 我国肉毒中毒多发地区新疆土壤中该菌检出率为22.2%，未垦荒地该菌检出率为28.5%，该地区粮谷、豆类及其发酵制品并有厌气条件者该菌检出率分别为12.6%和14.88%。该地区菌型分布以A型占多数，B型及A、B混合型次之，E型较少。 我国发生的肉毒梭菌食物中毒，91.48%由植物性食品所引起，8.52%由动物性食品所引起。引起中毒的食品以家庭自制的豆酱、臭豆腐为最多，其次为面酱和豆鼓等。此外，肉类罐头、腊肉、熟肉等也可引起中毒。 食物中肉毒梭菌主要来源于带菌土壤、尘埃及粪便。尤其是带菌土壤可污染各类食品原料。受肉毒梭菌芽胞污染的食品原料在家庭自制发酵食品、罐头食品或其它加工食品时，加热的温度及压力均不能杀死肉毒梭菌的芽胞。此外，食品在较高温度、密闭环境(厌氧条件)中发酵或装罐，提供了肉毒梭菌芽胞成为繁殖体并产生毒素的条件。食品制成后，一般不经加热而食用，其毒素随食物进入人体，引起中毒的发生。 肉毒梭菌食物中毒一年四季均可发生，但大部分发生在3～5月，其次为1～2月。自1896年Van Ermengein首次报道荷兰因火腿引起肉毒中毒暴发，并分离出肉毒梭菌以来，世界各地陆续报告本病。我国吴朝仁等1958年报道新疆察布查尔县由于食用面酱半成品(米送乎乎)引起肉毒毒素中毒之后，相继报告该地区由臭豆腐及其它发酵食品等引起的肉毒中毒事件。
芽孢杆菌属
第一、芽孢杆菌属的分类 一、芽孢杆菌属微生物特性 芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动。细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。芽孢杆菌属微生物具有共同的特性，都能够形成带有芽孢的生物膜，且代谢产物相似，都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等。 二、芽孢杆菌的分类方法 分类学是研究生物分类的原理、方法和实践的科学，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。目前细菌分类主要是采取多项分类技术。多项分类的概念是Colwell于1968年提出的，原理是利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。概括的讲，多项分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系。目前，多项分类法被认为是研究各级分类最有效的手段，可用于所有水平上分类单位的描述和定义。 2、1经典分类（表型特征） 表型是由于基因和环境因素相互作用引起的，在细胞、器官和整体水平上能检测和观察到的特征。一般，原核生物的表型特征能区分不同菌种但不能区分菌株。表型特征包括形态学特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析。表型特征虽然不能说明物种之间的亲缘关系，但它却是人们认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础，仍然是分类研究的基础。 芽孢杆菌，菌体杆状，直或近直，0.3~2.2×2.1~7.0um,多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子，严格好氧或兼性厌氧。由于实验条件的限制，传统芽孢杆菌的分类主要是根据形态学特征即好氧或厌氧和有无芽孢形成。Gibson和Gorden依据芽孢的形状（卵形或球形）以及它们在菌体或芽孢囊中的位置，提出芽孢形态群体概念，将芽孢杆菌分为三个类群。由于这个种的分离方法是以群体来划分的，它对芽孢杆菌分类鉴定有着非常重要的作用。群1、孢囊不显著膨大，芽孢椭圆或柱形，中生到端生，革兰氏阳性 A、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中有不着色的球状体 1、严格好氧；不产生乙酰甲基甲醇................................................巨大芽孢杆菌 2、兼性厌氧；产生乙酰甲基甲醇....................................................蜡状芽孢杆菌 B、生长在葡萄糖洋菜上的淡染细胞的原生质中没有不着色的球状体 1、7%氧化钠中生长；石蕊牛奶不产酸 a、在pH5.7生长；产生乙酰甲基甲醇 （1）水解淀粉；硝酸盐还原到亚硝酸盐 ①兼性厌氧；利用丙二酸盐..............................................地衣芽孢杆菌 ②好氧；不利用丙二酸盐..................................................枯草芽孢杆菌 （2）不水解淀粉；硝酸盐不还原到亚硝酸盐........................短小芽孢杆菌 b、在pH5.7不生长；不产生乙酰甲基甲醇................................坚强芽孢杆菌 2、7%氯化钠中生长；石蕊牛奶产酸...............................................凝结芽孢杆菌 群2、椭圆形芽孢使孢囊膨大，芽孢中生到端生，革兰氏阳性、阴性或可变 A、从碳水化合物产气 1、产生乙酰甲基甲醇；从甘油形成二羟基丙酮............................多粘芽孢杆菌 2、不产生乙酰甲基甲醇；不形成二羟基丙酮................................浸麻芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌概况
枯草芽孢杆菌研究概况 国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。 2.1国外研究概况 1945年Johnson等报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Papavizas G C报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。1992年Hwang等报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世纪90年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分别开发出活菌杀菌剂Serenade TM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌病害。GBO3(商品名为Kodiak)和MBI 600(商品名为Subtilex)分别由美国Gustafson公司和Microbio Ltd公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。2001年Gustafson将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为BioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作为植物促长剂被Taensa公司商品化生产，商品名Taegro TM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病。俄罗斯全俄植保所开发了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alifine-B，可用于防治多种作物真菌(Fusarium，Rhizoctonia，Ascohyta，Colletotrichum，Sclerotinia，Botrytis，etc)病害，田间防效高达60％~95％，增产达25％~35％；另一枯草芽孢杆菌产品Gamair由活菌和代谢物组成，主要防治由Clavibacter michiganense subsp.Michiganense，Erwinia caratovota
枯草芽孢杆菌的应用
学年论文（课程设计） 题目：枯草芽孢杆菌的应用 学院生命科学学院 学科门类理科 专业生物技术 学号2010445059 姓名陈家怡 指导教师郭立格 2012年7月6日 目录 枯草芽孢杆菌的应用 (3) 摘要 (3) ABSTRACT (4) 1.枯草芽孢杆菌的基本资料 (5)
1.1简介 (5) 2.枯草芽孢杆菌的研究现状及主要应用领域..................................................................................-5-. 2.1枯草芽孢杆菌的研究现状 (5) 2.2枯草芽孢杆菌的主要应用领域 (5) 2.2.1枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (5) 2.2.1.1纳豆激酶的发现及应用 (5) 2.2.1.2 脂肪酶 (6) 2.2.2枯草芽孢杆菌在农业中的应用 (6) 2.2.2.1枯草芽孢杆菌在饲料中的应用 (6) 2.2.3 枯草芽孢杆菌在动物养殖中的作用 (6) 2.2.4 枯草芽孢杆菌在农作物病虫防治中的作用 (6) 2.2.5枯草芽孢杆菌在现代科学研究中的应用 (7) 2.2.5.1枯草芽孢杆菌表达系统的研究 (7) 2.2.5.2枯草芽孢杆菌细胞质融合方面的研究 (7) 3.枯草芽孢杆菌应用中存在的问题 (7) 4.枯草芽孢杆菌制剂作用机理及应用效果 (7) 4.1枯草芽孢杆菌的作用机理 (7) 4.1.1生物夺氧 (7) 4.1.1.1拮抗致病微生物，改善体内外生态环境 (8) 4.1.1.2增强动物体的免疫功能 (8) 4.1.1.3产生多种消化酶 (8) 4.1.1.4产生多种营养物质 (8) 4.2枯草芽孢杆菌在动物生产上的应用效果 (9) 5.展望 (9) 参考文献 (9) 枯草芽孢杆菌的应用 摘要
地衣芽孢杆菌介绍
名称：地衣芽孢杆菌 英文名：PWD一1 (Baclicus lincheniformis PWD一1） 俗称：整肠生（地衣芽孢杆菌胶囊） 种属：芽孢杆菌科细菌 革兰氏染色性；为革兰氏阳性杆菌 细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm 细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生。细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（P HB）颗粒 芽孢形态：产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大 培养特性：在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm 生化形状：本菌有动力 地衣芽孢杆菌的作用机制是以菌治菌，活菌进入肠道后，对葡萄球菌、酵母样菌等致病菌有拮抗作用，而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化性链球菌有促进生长作用，从而可调整菌群失调达到治疗目的。可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。此外通过夺氧生物效应使肠道缺氧，有利于大量厌氧菌生长，造成肠道低氧环境，对肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化链球菌等有益健康的厌氧菌的生长繁殖有促进作用；对葡萄球菌、白色念球菌、酵母样菌等致病菌则有拮抗作用。通过这种双重作用可以调整肠道菌群失调，维持机体肠道微生态平衡，从而对肠道疾病达到治疗和预防的目的。 【性状】地衣芽孢杆菌高纯粉≥250亿／克水分≤10％ 【主要用途】 1、促进肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能； 2、对肠道细菌感染具有特效，对轻型或重型急性肠炎，轻型及普通型的急性菌痢等，均有明显疗效； 3、能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。 【适用对象】适用于细菌原因引起的肠道菌群失调症以及肠道需要保健的养殖动物。 【用法用量】添加在饲料中的量为：50～100克／吨（全价料），注意混合均匀。
枯草芽孢杆菌使用说明
枯草芽孢杆菌(活菌数200亿/400亿) 一、枯草杆菌概述：枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 二、枯草芽孢杆菌的作用机理：枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用．保护环境。以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。 三、枯草芽孢杆菌的使用说明： 特点：1.肠道定殖能力强。 2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的肥料生产需求。 3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。 成分含量：枯草芽胞杆菌有效活菌数大于200亿/克 用法用量：
贮藏：阴凉、干燥处密封保存。 保质期：密封保存不少于18个月。 四、枯草芽孢杆菌的应用范围：枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。 1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理； 2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖； 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。
(完整版)食品微生物学试题+答案
食品微生物学试卷一、 一. 填空题： 1. 细菌一般进行___无性__ 繁殖，即__裂殖_。酵母的繁殖方式分为有性和无性两类，无性繁殖又可分为__芽殖__ ，__裂殖__ 两种形式，有性繁殖时形成__子囊_ ；霉菌在有性繁殖中产生的有性孢子种类主要有__子囊孢子__ ，_接合孢子__ ；在无性繁殖中产生的无性孢子种类有_孢囊孢子_ ，__分生孢子__，__厚垣孢子（节孢子）__ ；放线菌以__无性__ 方式繁殖，主要形成__分生孢子__ ，也可以通过___菌丝片断_繁殖。 2. 微生物污染食品后，对人体造成的危害主要是引起___食物中毒_______和____消化道传染病_____。 3.在酵母菌细胞结构中，____⒃_____具有保护细胞及维持细胞外形的功能；____⒄____具有控制细胞对营养物及代谢产物的吸收和交换作用；____⒅_____是细胞进行生命活动，新陈代谢的场所；___⒆______是呼吸酶类的载体，细胞的能量供应站；_____⒇____具有传递细胞遗传性状的作用。 二.选择题（1分/小题×20） 1.革兰氏染色的关键步骤是__c_ a.结晶紫（初染） b.碘液（媒染） c.酒精（脱色） d.蕃红（复染） 2.属于细菌细胞基本结构的为__b_ a.荚膜 b.细胞壁 c.芽孢 d.鞭毛 3.测定食品中的细菌总数常采用__a___ a.稀释混匀平板法 b.稀释涂布平板法 c.显微镜直接镜检计数法 4.干热灭菌法要求的温度和时间为_c__ a.105℃，2小时 b.121℃，30分钟 c.160℃，2小时 d.160℃，4小时 5.微生物运输营养物质的主要方式_c__ a.单纯扩散 b.促进扩散 c.主动运输 d.基团转位 6. Saccharomyces cerevisiae有性繁殖产生__d__ a.接合孢子 b.担孢子 c.孢囊孢子 d. 子囊孢子 7.以高糖培养酵母菌,其培养基类型为__b__ a.加富培养基 b.选择培养基 c.鉴别培养基 d.普通培养基 8. 抗干燥能力较强的微生物是__a_______。 a.酵母菌 b.霉菌菌丝 c.乳酸菌 9. 产生假根是__a__的形态特征。
枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌拉丁学名Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。 中文名：枯草芽孢杆菌 其他外文名：Bacillus subtilis 类型：是芽孢杆菌属的一种 即“枯草杆菌”，芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 长沙泰莱生物科技有限公司专业分离提纯枯草芽孢杆菌菌种。 成份含量 枯草芽孢杆菌及生物酶、维生素、微量元素等辅助剂 功效特点 1、本品对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可100%直达大小肠的活菌。 2、枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。 3、在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良，出现“饲料便”等状况发生。 4、本品安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用。同时缓解动物不进食，生长缓慢等不良应激反应状态，恢复由于用药造成的动物体质下降，提高疫苗抗体水平等综合抗病力。 5、除臭驱蝇，减少污染，控制细菌性疾病，能减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少粪便臭味及有害气体排放，表现为动物粪便臭味逐步减轻，减少饲料蛋白质分解为氨气浪费，从而减少环境污染。 6、改善肉蛋奶品质，生产“绿色肉”、“农家蛋”、“无抗奶”，本品通过增强消化吸收功能，充分吸收利用饲料中营养成份及原料的天然色素，无需添加化学色素苏丹红、加丽素红造成对人体的有害物质及影响畜禽产品天然食用风味，可媲美家养畜禽肉。能天然增加动物产品着色度和食用风味，猪只皮肤红润，毛色发亮；肉鸡肉鸭颜色加深；改善蛋壳的质量和颜色，蛋清厚稠，蛋黄鲜红；水产动物颜色更加健康，无斑点。
微生物实验4 芽孢观察
微生物实验报告 细菌的芽孢染色观察实验 刘欣怡201100140057 生命科学基地班 组别：周一下午三组 同组者：曹平平，周楠， 刘艺，刘希伟 实验时间：2012年10月22号 一、实验目的 1、学习并掌握芽孢染色法 2、了解芽孢杆菌的形态特征 3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 二、实验器材 1、菌种 枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。 2、溶液和试剂 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。 3、仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。 三、实验原理 1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的
休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 2、芽孢菌体的特点： a.芽孢的含水率低，38%～40%。 b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。 c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。 d.含有耐热性酶。 芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。 3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。 4、芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节。芽孢可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据、在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只
枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌的简介和在各领域的作用 一、枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7~0.8×2~3微米，着色均匀。无夹馍，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽抱杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其他致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其他微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等。 二、枯草芽孢杆菌的应用领域 枯草芽孢杆菌是一种很好的菌种，应用领域很广，可以运用在饲料公司。用作饲料添加剂。可以用在生物有机肥公司，用作生物肥料的发酵剂，可以应用在养殖场，直接添加给动物吃，可以应用在鱼塘净化水质。或者一些城市环境监测部门或环保公司，他们勇于污水或
污染物的处理。以及一些糖厂或公司用于治理污染等. 三、枯草芽孢杆菌在农业中的作用 1、提高作物抗病、抗寒、抗旱能力 2、增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率； 3、促进土壤中的有机质分解成腐殖质，刺激作物生长。 4、促进作物生长、成熟、降低成本、增加产量、提高收入； 5、有一定的固氮、解磷、解钾作用。 四、枯草芽孢杆菌在水产种的作用 1、枯草芽孢杆菌有肥水的作用 枯草芽孢杆菌制剂种的活菌，可以在水中产生多种分解酶，将有机肥中的大分子分解成为小分子，但这一过程发生在芽孢杆菌激活扩繁殖之后。 制剂种枯草芽孢杆菌代谢产生的酶类。枯草芽孢杆菌制剂中有丰富的多种酶类，比如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、多糖酶等等。这些酶类在进入水中之后就开始发挥分解有机肥的作用。实践证明，在水体中添加芽孢杆菌制剂可使水体变绿（肥水）的时间提前三天左右，随着水温的升高，提前的速度还会更快。 2、枯草芽孢杆菌有嫩水的作用 嫩水，水肥而不老 所谓老水，一是指浮游生物大量死亡，水色发黑；二是指水色过浓，透明度过低（<１０ｃｍ），浮游生物量过大，藻类的光合作用速
细菌芽孢的有关知识
芽孢的定义 有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。 1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在细胞一端，有的在细胞中部。由于芽孢是在细胞内形成的，所以也常称之为内生孢子，亦称芽孢。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。 芽孢的形态 在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌，梭状芽孢杆菌的芽孢位于菌体中间。破伤风杆菌的芽孢位于菌体的一端，使菌体呈鼓槌状。好氧芽孢杆菌属(Bacillus)和厌氧的梭状 芽孢杆菌属(Clostridium)的所有细菌都具有芽孢。在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢. 芽孢形成和结构 芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。 光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：①核物质融合成轴丝状（杆状）。②在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。③小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。④前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。 芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。在成熟的芽孢中，芽孢原生质体含有极高的吡啶二羧酸钙，在新合成的、具有特殊化学构造的外层（皮层和孢子衣，有时还有芽孢外壁）中也有这种物质。芽孢的壁含有一种特殊的肽聚糖，所有芽孢基本上都一样，但与营养细胞的细胞壁肽聚糖却不一样。同时，芽孢中还含有一些特殊的蛋白质。 芽孢的特性 由于芽孢在结构和化学成分上均有别于营养细胞，所以芽孢也就具有了许多不同于营养细胞的特性。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。同时，芽孢还有很强的折光性。在显微镜下观察染色的芽孢细菌涂片时，可以很容易地将芽孢与营养细胞区别开，因为营养细胞染上了颜色，而芽孢因抗染料且折光性强，表现出透明而无色