蛋白质相关实验技术操作指南

1、Western blotting:

Western blotting using ECL reagent

used by：Laboratory of P.J. Hansen,Dept. of Animal Sciences, University of Florida

Kamps's Western Blotting Protocol

used by：Sefton Lab, Salk Institute

Dry Transfer 干法蛋白转膜

used by：The Preuss Lab,The Division of Biological Sciences,The University of Chicago

Western Blot of TBP from TBP-GST bacteria

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Western Blot/Anti-P-CREB

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Western blotting protocol for 1C2, 3B5H10, and 4C8 Antibodies

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Protocol for anti-HA antibody Western Blotting

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Probing and Stripping of Western Blot

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Western Blotting Protocol

used by：Mirmira Laboratory at the University of Virginia

Western Blotting and Immunostaining

used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

Western Blots

used by：Lab of Dr. Mark Barton Frank, Oklahoma Medical Research Foundation

Western Blotting - Antibodies

used by：The Minion Lab, College of Veterinary Medicine at Iowa State University

Western Blotting

used by：Cepko/Tabin Lab, Harvard University

Carbonate Solution For Western Blot

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

Western Blot with BSA

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

METHOD for Western Blots

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

Western Blots

used by：Michael Koelle's Lab,Department of Molecular Biophysics and Biochemistry

Yale University

2、蛋白分离/提取/浓缩

Lysis Buffers

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Yeast Protein Isolation "Yaffe-Schatz"

used by：Amberg Lab ,Upstate Medical University

Guanidine Hydrochloride Purification of Proteins From SDS PAGE

used by：Gottschling Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Yeast protein prep for SDS PAGE and western (rapid)

used by：Gottschling Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Yeast protein prep for SDS PAGE and western (glass bead)

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Purification of TFIIIC from yeast

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Purification of TFIIA from E. coli

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute TCA protein precipitation

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Purification of MLCK ( Myosin Light Chain Kinase )from Rabbit Skeletal Muscle肌球蛋白轻链激酶

used by：Stull Lab,University of Texas, Southwestern Medical Center

Purification of Calmodulin from Bovine Brain

used by：Stull Lab,University of Texas, Southwestern Medical Center

Myosin Light Chain Preparation from Skeletal and Cardiac Muscle

used by：Stull Lab,University of Texas, Southwestern Medical Center

Purifying Protein from Inclusion Bodies

used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

Protocol for Protein Extraction from Plant

used by：The University of Nebraska-Lincoln Protein Core Facility (PCF)

Taq Polymerase Purification

used by：Cepko/Tabin Lab, Harvard University

Yeast Protein Prep (No Boil)

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

Yeast Protein Prep (Boil)

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

GST Fusion Protein Prep

used by：Vesicle Trafficking, Stanford University

3、蛋白质检测分析：

AMIDO BLACK STAIN

used by：Hancock Laboratory Methods,Department of Microbiology and Immunology,

University of British Columbia, British Columbia, Canada

James Hardwick's angiotensin assay protocol

used by：Sefton Lab,Salk Institute

Phosphoamino acid analysis:Mark Kamps's method

used by：Sefton Lab,Salk Institute

ULTIMATE HIS-UB ASSAY FOR

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

ULTIMATE HIS-UB ASSAY FOR YEAST

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

Protocol for Beta-Hexosaminidase RBL-2H3 Secretion Assay

used by：meyer lab,Stanford University

Measurement of Myosin Regulatory Light Chain (RLC) Phosphorylation

used by：Stull Lab,University of Texas, Southwestern Medical Center

Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay

used by：David R. Caprette, Rice University

Biuret Protein Assay

used by：David R. Caprette, Rice University

Bradford protein assay

used by：David R. Caprette, Rice University

Hartree-Lowry and Modified Lowry Protein Assays

used by：David R. Caprette, Rice University

Colorimetric Assays

used by：David R. Caprette, Rice University

Kd measurement, fitting, calculation, and simulation

used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

4、蛋白标记修饰

DSP Crosslinking

used by：Peter Novick Lab, Department of Cell Biology Yale University School of Medicine Labeling Gc-Globulin with Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS)

Labeling Tubulin with Tetramethylrhodamine Succinimidyl Ester

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS)

Labeling Gizzard Vinculin with Tetramethylrhodamine Iodoacetamide

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS)

Labeling Gizzard Alpha-actinin with Tetramethylrhodamine Iodoacetamide

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS)

Labeling Gizzard Myosin with Tetramethylrhodamine Iodoacetamide (primarily 17kD MLC) used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS)

Labeling Gizzard Myosin with Tetramethyorhodamine Iodoacetamide (MHC and 17kD MLC)

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS) Labeling Muscle Actin with N-(1-pyrene) Iodoacetamide

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS) Labeling Muscle Actin with Tetramethylrhodamine Iodoacetamide

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS) Labeling Muscle Actin with Carboxyfluorescein Succinimidyle Ester

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS) Labeling Muscle Actin with 5-Iodoacetamidofluorescein

used by：Yu-Li Wang Lab,University of massachusetts Medical School(UMASS) ultimate mammalian cell pulse-chase

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

ultimate yeast pulse-chase

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

Gluteraldehyde Conjugation of Oligopeptides to Proteins

used by：Lab of Dr. Mark Barton Frank, Oklahoma Medical Research Foundation Fluorescein labeling of proteins

used by：David Chambers,Salk institute

Biosynthetic labeling

used by：Sefton Lab, Salk Institute , San Diego, California

5、免疫沉淀(IP/CoIP/ChIP)

Immunoprecipitation buffers and protocols

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Cell Lysis/Western/IP

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF Amplification and Labelling with Cy dyes

used by：Yale Genome Analysis Center, Yale University

Chromatin Immunoprecipitation from Mammalian Cell Extracts

used by：Yale Genome Analysis Center, Yale University

Chromatin Immunoprecipitation from Yeast Whole Cell Extracts

used by：Yale Genome Analysis Center, Yale University

Immunoprecipitation

used by：Hancock Laboratory Methods. Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia, British Columbia, Canada

Ultimate yeast denaturing IP

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

ULTIMATE FREEZE-THAW LYSIS FOR

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

Ultimate mammalian nondenaturing IP

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

Ultimate mammalian denaturing IP

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laboratory

Ultimate yeast ChIP assay

used by：the Tansey Lab at Cold Spring Harbor Laborat ory

Chromatin Immunoprecipitation Assay and PCR

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Yeast Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

u sed by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Mirmira Lab ChIP Protocol

used by：Mirmira Laboratory at the University of Virginia

ChIP Assay Protocol

used by：Mirmira Laboratory at the University of Virginia

Immunoprecipitation and Immune Complex kinase assay

used by：Sefton Lab, Salk Institute

General Principles of Immunoprecipitation

used by：Sefton Lab, Salk Institute

6、融合蛋白表达及纯化

Use of B-PER lysis reagent to purify recombinant proteins tagged with His6 or maltose binding protein

used by：Smith Lab,Division of Biological Sciences,University of Missouri

Bacterial Expression of Kinesin Motors

used by：Liz Greene and Steve Henikoff

Purification of recombinant sBRF M166L

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Protein Expression and Purification of RPA70-AB

used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

Co-Expression and purification of human DNA primase p49-p58 subunits引发酶p49-p58亚基共表达纯化方法used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

Protein Expression and Purification of MBP-T antigen MBP-T抗原表达纯化

used by：Chazin Lab, Center for Structural Biology, Vanderbilt University

Perspectives on Baculovirus Expression Systems表达

used by：Lab of Dr. Mark Barton Frank, Oklahoma Medical Research Foundation

Expression & Purification of His Tagged Proteins in E. coli

used by：Cepko/Tabin Lab, Harvard University

7、相互作用分析

Amplifying a large phage-display library without losing diversity

used by：Smith Lab,Division of Biological Sciences,University of Missouri

Protein Interaction Analysis Using an IASYS Biosensor

used by：Kitto Lab, The University of Texas at Austin

Yeast Two-Hybrid Screen with Library and Bait

used by：Mirmira Laboratory at the University of Virginia

8、蛋白电泳/双向电泳

SDS-PAGE

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Gel Drying干胶

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

NuPAGE Gel Electrophoresis 蛋白电泳

used by：Kitto Lab, The University of Texas at Austin

Isoelectric Focussing of Membrane Proteins by Slab Gel Method

used by：Hancock Laboratory Methods,Department of Microbiology and Immunology,

University of British Columbia, British Columbia, Canada

Silver Staining SDS PAGE Gels

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute E. coli total protein for SDS PAGE

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Comassie Blue Protein gel stain

used by：Hahn Lab，The Fred Hutchinson Cancer Research Center and Howard Hughes Medical Institute Coomassie & Silver Staining of Polyacrylamide Gels

used by：Lab of Dr. Mark Barton Frank, Oklahoma Medical Research Foundation

2-D Polyacrylamide Gel Electrophoresis

used by：Molecular Profiling Initiative, National Cancer Institute(NCI)

Silver Staining of SDS-PAGE Gels

used by：The Minion Lab, College of Veterinary Medicine at Iowa State University

SDS-PAGE Gels

used by：The Minion Lab, College of Veterinary Medicine at Iowa State University

CuCl2 Staining of SDS-PAGE Gels

used by：Cepko/Tabin Lab, Harvard University

Electroelution of Proteins From SDS-PAGE Gels

used by：Drs. C Cepko and C Tabin, Harvard University

Silver Stain of Protein Gels

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

SDS-PAGE （BIO-RAD

used by：Dr. DE Koshland, Carnegie Institution of Washington

SDS-PAGE

used by：Michael Koelle's Lab,Department of Molecular Biophysics and Biochemistry Yale University

9、质谱分析

Polycrystalline thin films质谱样品准备

used by：Prowl Lab,Rockefeller University

Seeded films (Vorm-Roepstorff)

used by：Prowl Lab,Rockefeller University

Dried droplet

used by：Prowl Lab,Rockefeller University

In-gel Tryptic Digest for Protein ID by Mass Spectrometry

used by：Mitshison Lab, Department of Systems Biology, Harvard Medical School

10、crystallization

Polycrystalline thin films

used by：PROWL, Rockefeller University

Slow crystallization

used by：PROWL, Rockefeller University

Crystallization of Kinesin Family Motor Proteins驱动蛋白家族的结晶条件和晶体参数used by：Liz Greene and Steve Henikoff

Crystallization Trials

used by：Liz Greene and Steve Henikoff

11、in vitro protein synthesis

Protein Syntheses in Cell Free Systems

used by：The Laboratory of William Heidcamp at Gustavus Adolphus University

12、蛋白纯化/层析

6xHis-tagged protein purification using Qiagen Ni-NTA Column under Native Conditions

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of dnEBNA-1/Soft from E. coli BL21 LysS

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of GST fusion proteins in E.coli GST融合蛋白纯化（方法四）筛选表达株

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of GST fusion proteins in E.coli GST融合蛋白纯化，方法三，纯化小量蛋白

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of GST fusion proteins in E.coli GST融合蛋白纯化，方法二

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of GST fusion proteins in E.coli GST融合蛋白纯化，方法一

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Purification of 6xHis epitope tagged proteins by Ni-NTA-Agarose His标签蛋白纯化

used by：Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison Medical School Fusion Protein Isolation 融合蛋白分离纯化

used by：Peter Novick Lab, Department of Cell Biology Yale University School of Medicine

Affinity Column Preparation 亲和层析柱制备

used by：Peter Novick Lab, Department of Cell Biology Yale University School of Medicine

Preparation of Affinity Column制备亲和层析柱

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

Column Buffers

used by：Steven Finkbeiner, Departments of Neurology and Physiology, UCSF

13、蛋白定量

Glutathione - a microassay for determining glutathione content in cells 检测细胞谷胱苷肽含量

used by：Laboratory of P.J. Hansen,Dept. of Animal Sciences, University of Florida

Bradford Protein Assay - a microassay for determining protein content in a 96-well microtiter plate format used by：Laboratory of P.J. Hansen,Dept. of Animal Sciences, University of Florida

Lowry Protein Assay

used by：Laboratory of P.J. Hansen,Dept. of Animal Sciences, University of Florida

Bradford Assay

used by：Kitto Lab, The University of Texas at Austin

蛋白质工程重点

一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。 2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。 4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。 5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。 6、晶胞(Unit cell)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。 8、化学势（位）移（）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

蛋白质组学研究方法选择及比较

蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：

●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。

酶与蛋白质工程实验及复习题

实验部分 稀释倍数意思就是你得到的最后的活性要换算成最初样品的活性。比如粗酶液是30ml，再取1ml稀释到10ml（最后用移液枪取10ul做微量活性测定）。那么稀释倍数就是 10/1*30=300。 公式里面就有两个体积，一个是反应总体积，一个是酶样液体积。反应总体积是指你最后测定时候，每个试管最终的体积3 ml酶样液体积是你加入试管的SOD的体积，比如微量法就是0.01ml(10ul)。 样液速率是30秒的，需乘以2。 理论部分复习题大纲 （给大家的只是复习的大纲，还有一些由于时间仓促，上课时强调的重点内容有些没在这个大纲上，但仍然是考试内容，希望大家能认真复习。） 一．名词解释8个，每题3分 1.酶工程 2.凝胶过滤层析 3.离子交换层析 4.亲和层析 5.酶的生产 6.酶的改性 7.生物酶工程 8.化学酶工程 9.酶分解代谢物阻遏作用 10.酶生物合成的诱导作用 11.酶生物合成的反馈阻遏作用 12.密度梯度离心 13.等密度梯度离心 14.酶分子修饰： 15.酶大分子结合修饰 16.酶侧链基团修饰 17.酶反应器 18.流化床反应器鼓 19.泡式反应器 20.定点诱变技术 21.蛋白质工程 二．填空每空1分10分 1.化学酶工程研究的主要内容是(酶的制备)、(酶的分离纯化)、（酶与细胞的固定化技术）、(酶分子修饰)、（酶反应器）和(酶的应用)。 2.在酶的发酵生产中，为提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是（延续合成型）。 3.常用的酶或蛋白质干燥的方法有真空干燥、(冷冻干燥)、气流干燥、（喷雾干燥）和吸附干燥。

4.（葡萄唐氧化酶）是一种有效地食品除氧保鲜剂。 5. 通过检测（）的酶活性，可以诊断癌症。 6.（X-射线衍射法）是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。 7.确定蛋白质分子在溶液中结构信息的方法是（核磁共振技术）。 8.酶反应器的操作方式可分为（）反应器、（）反应器和流加分批式反应器。 9.细胞固定化的方法有（吸附法）和（包埋法）。 10．1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为( )。 11．酶的生产方法主要有（），（）和（）。 12 微生物发酵产酶中使用的两种培养基是（）和（）。 13 针对胞内酶的分离提取，细胞破碎的方法有（）、物理破碎、（） 和（）。 14.利用有机溶剂沉淀法分离酶或蛋白质时常用有机溶剂有丙酮、（）、 （）和（）。 15.离子交换剂由（）、（）和（）构成。 16.凝胶过滤层析中常用的凝胶材料有（）、（）和 （）。 17. 常用的蛋白质序列数据库英文简写：（）和（）。 18.1926年,美国康乃尔大学的Sumner博士从刀豆中提取出( )结晶，并证明 具有蛋白质的性质。 19．常见产酶微生物种类（）、（）、（）和（）。 18. 酶的主要提取方法有酸提取法、（）、（）和（）。 19. 吸附层析中常用的强吸附剂：（）和（）。 20．离子交换层析中常用的阳离子交换基团是（）和 （）。 21．典型的双水相萃取系统：（）和（）。22. 常用的基因组数据库英文简写：（）、（）和 （）。 23．过滤分离的种类有、、和。 24．根据酶分子大小、形状的不同可选择的分离方法有、 或。 25．酶的固定化方法有、、和。 26. 固体发酵产酶的方法有、和。 27. 密度梯度离心常用的梯度介质是和。 28. 凝胶过滤层析中凝胶可分为凝胶、凝胶和凝胶。 29. 典型的双水相萃取系统：和。 30. 根据酶分子电荷性质的不同可选择的分离法是或。 31. 酶制剂有四种类型即液体酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 32．CO2超临界萃取的临界温度，临界压力。 33.1902年，亨利根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出（）学说。 34.1960年，雅各和莫诺德提出了（）学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。三．选择（5个，每个2分）

检测生物组织中的糖类脂肪蛋白质教学设计

《检测生物组织中的糖类》的教学设计 阳春市第一中学何方炎 一、教材分析： 1、教材的地位和作用 新教材把实验安排在学习蛋白质、糖类和脂质等知识内容之前，一方面为接下来的学习各类有机物奠定感性认识基础，另一方面，由于实验内容的设置上注重学生对材料的选择，对检测结果的预期和实验方案的设计，因此有利于培养了学生的实验探究的能力，为以后各章节的探究性实验的顺利开展搭建了一个较高的起点。 2、教学目标 （1）知识： ①尝试用化学试剂检测生物组织中的糖类。 ②推断组织液中有机物的种类和大致含量 （2）能力： ①学习实验探究的方法 ②初步掌握评价和报告实验结果的能力 （3）情感态度价值观：严谨认真合作学习敢于质疑善于反思 3、教学重点难点 重点：检测生物组织中的糖类的原理和方法。 难点：实验所用材料多，试剂种类和使用方法多，课堂容量大。 突破：面对全体学生，做好充分的准备:材料仪器准备，学生的情感和知识准备。课堂上发挥小组长的协助管理作用，合理有序地组织教学。 二、学情分析 1、学生的思维水平、学习能力已经发展到较高阶段，乐于并有能力接受自主探究的学习模式。 2、感兴趣，有实验操作的基础。 3、材料试剂多，任务繁重，合作学习显得尤为重要。 三、教法学法 1、学法：任务驱动，自主探究合作学习，分享交流。 2、教法：组织者，引导者，注意生成性问题的再探究。 四、教学过程 1、实验动员，知识准备 教师：介绍有关实验原理和检测方法（见板书） 学生：讨论交流，合作学习（讨论题见板书） 2、创设情景，任务驱动 提供一种水果组织（苹果），学生自带一样自己感兴趣的组织进行检测。

假设每个同学是一个营养师或检验员……如何准确检测出组织液各含哪种物质？ 你要选择哪些实验器材和试剂？ 3、作出预测设计实验 （1）先预测，再检测。 （2）设计记录表格，记录预测和实测结果。 4、分组探究，自主学习 小组长：组织分工，材料仪器的分配和管理。 组员：对提供的一种组织液和自带的组织用相应试剂进行检测。根据特定的颜色反应尝试分析其中有机物的种类，比较各种有机物的含量。 注意生成性问题的再探究（再探究课题见板书） 教师：不直接解疑，鼓励设计实验进行再探究 5、成果交流，评价反思 实验反思：预测与实测相符？ 小组间的异同？ 存在问题？ 教师公布答案，并作出恰当的评价： （1）实验纪录表格的设计、实验结果和推论 （2）自主学习和合作能力 （3）创新思维和能力 6、拓展延伸，学以致用 讨论： 今天检测的生物材料中有机物的种类，含量一样吗？对你选择食物有什么启发？ 依据课程的基本理念，注重与现实生活的联系，学以致用。 五、教学反思 1、以“自主性、探究性、合作性、完整性”为课堂教学的四个基本维度，以培养学生的科学素养为指导，侧重科学方法教育。 2、注重培养自疑自析的能力，“教为了不教”。 3、发挥小组长的协助作用。 4、试剂用量的差异，影响对实验结果的推断。 5、探究、创新能力的培养与课时的安排矛盾。 板书设计： 检测生物组织中的糖类 一、实验原理（）＋（）（）

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ①ＦREＴ技术(in vｉvo) FRET，Fluoresｃence ｒesonancｅenergy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术得原理就是用一种波长得光激发某种荧光蛋白后,它释放得荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长得荧光,如下图所示: 以下图为例,若要利用FＲET检测两种蛋白就是否有相互作用,需将两种蛋白得基因分别与这两种荧光蛋白得基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFＰ进行激发，并检测GＦP就是否放出绿色荧光.如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则就是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术(in vivｏ) 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白就是否有相互作用,其原理就是典型得真核生长转录因子,如GＡL4、GＣN4等都含有二个不同得结构域，即ＡD与BD.这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录．由此,设计不同得两个载体,一个含有AD基因（假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为Ｂ载体）。 一般将一个已知蛋白得基因连在Ｂ载体上，作为诱饵（Baｉt),将未知蛋白得基因连在A载体上,将这两个载体都转到特定得酵母细胞内,瞧未知蛋白与已知蛋白就是否有相互作用.如果两者有相互作用,那么就可以启动报告基因得转录,从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来;如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示:

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间得相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统得原理如下图所示: 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段,即C端段（Ｃub)与Ｎ端段(NubG）,并在Ｃ端段得Ｎ端接上一个LｅxA—VP16转录因子,此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上,将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白得Ｎ端段与C端段靠近结合,形成一个完整得泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记得片段降解，那么连接C端段得LexA-VＰ16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因得表达。 酵母三杂交得原理与双杂交一样,只就是它研究得就是两个蛋白与第三个成分间得相互作用,通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以就是:蛋白、RNＡ或小分子,如下图所示: 如上图所示,在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用,因此无法使BD与AD靠近,报告基因不能表达;当加入第三种成分后,蛋白X与蛋白Y得距离被拉近,ＢD与AＤ靠近,报告基因表达,从而可以被检测到。 ③ Puｌlｄoｗn技术(iｎｖｉｔro) Ｐuｌlｄｏwn，即蛋白沉降技术,它就是建立在蛋白质亲与层析得基础上得一种检测蛋白质间相互作用得分析方法．亲与层析得原理如下图所示,不同蛋白对配体得亲与程度不同,因此可以先将非特异结合得蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去,只剩目得蛋白与层析柱结合,然后再用洗脱液将目得蛋白洗脱下来,达到纯化目得蛋白得作用。

果实蛋白质组学研究的实验方法

植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.sodocs.net/doc/2112578582.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨

蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS

蛋白质工程的现状发展及展望

蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于

蛋白质工程(1)

蛋白质工程：以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术，是基因工程的深化和发展。 蛋白质结构：一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。 二级结构：一段连续的肽单位借助氢键排列成具有周期性结构的构象。 三级结构：蛋白质多肽链在各种二级结构的基础上，进一步盘曲折叠形成具有一定规律的三维空间。 四级结构：由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质的寡居蛋白，通过肽链间的次级键相互结合形成的空间结构。 蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。 结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。 蛋白质变性：天然蛋白质分子受到某些物理因素（热、紫外线、高压）或化学因素（有机溶剂、脲、胍、酸、碱）的影响，引起蛋白质天然结构的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失。 蛋白质折叠：蛋白质因所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电……等等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。 蛋白质定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。 蛋白质的分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。 第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程。 蛋白质组：基因组表达全部蛋白质及其存在方式，或基因组、一个细胞或一种生物表达的所有蛋白质。 蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控的机制的学科。双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 噬菌体表面展示技术：噬菌体展示技术是将外源基因或一组一定长度的随机寡居核苷酸片段克隆到特定的表达载体内，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。 基因工程抗体：利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其编码产生出预期的抗体分子。 抗体酶：通过改变抗体与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。既有抗体的高度选择性，又有酶的高效催化效率。 单克隆抗体：由一种抗原决定簇激活，并具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体。

《检测生物组织中还原糖脂肪和蛋白质》教案一实验原理鉴定

《检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质》教案 一、实验原理 （1）鉴定实验设计的理念： 某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物产生特定的颜色反应。 （2）具体原理： ①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。 ②脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。 ③蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应。 二、目标要求 初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 三、重点、难点 1.重点 ①初步掌握鉴定生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 ②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力，掌握探索实验设计技巧，从而培养创新思维能力。 2.难点 根据此实验方法、原理，设计实验来鉴定常见食物的成分。 四、实验材料 1.可溶性还原糖的鉴定实验:选择含糖量较高、颜色为白色或近白色的植物组织，以苹果、梨为最好。 2.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子，以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h)。 3.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆、或用鸡蛋蛋白)。 五、仪器、试剂 1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜。 2.试剂:①斐林试剂(0.1g/L的NaOH溶液+ 0.05g/mL的CuSO 溶液)；②苏丹 4 Ⅲ染液；③双缩脲试剂；④体积分数为50%的酒精溶液；⑤蒸馏水。 六、方法步骤(演示教学课件) 1.制备试剂。 2.可溶性还原糖的鉴定、方法、步骤。 3.脂肪的鉴定、方法、步骤。 4.蛋白质的鉴定、方法、步骤。 七、教学过程 新课引入：我们在化学中学习过物质的鉴定，其原理是被鉴定的物质与所用的化学试剂要么发生颜色反应，要么产生沉淀，我们生物学上也采用此原理，在生物学中物质鉴定的理念是：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应。 新课教学：（具体原理） ①可溶性还原糖+ 斐林试剂→砖红色沉淀。（水浴加热） ②脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒。（要显微镜观察）

Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)

Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月

第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%

高中生物人教版必修一《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》教学设计

《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》教学设计与反思 课题：《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》（高中生物人教版必修一 ） 环节一 ：明确本课学习目标。 1、知识与能力：认识是几种化学试剂和物质颜色反应特征；尝试用化学试剂检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质。培养学生的动手能力观察能力逻辑思维能力和表达能力。 2、 过程与方法：通过分组实验，跟同学分工合作，相互协调团结协力共同探究的精神。让学生学会探究问题的基本方法和程序。 3、 情感态度与价值观：乐于参与学习，认识生物科学的价值，养成质疑、求实、创新及勇于实践的科学精神和态度，认同生命的物质性，了解健康的饮食习惯。培养学生团结分工合作的精神。 二、实验原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应，从而将有关有机化合物鉴定出来。 1．检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质 实验原理：还原糖 （加热）先浅蓝再棕色最后是 砖红色 脂肪 红色 蛋白质 紫色 （因为有肽键） 环节二：复习准备实验的基本要求 通读实验手册，明白三种物质的检测方法和原理。 环节三：老师讲解 老师：同学们这节课，按我们的计划开始做《检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质》，根据课前制定的实验方案，分15个小组实验。先做验证实验：蛋白质、还原糖、淀粉和脂肪的检测，然后选取老师提供的待测物质探究这些物质里的主要成分，待测物质有豆浆、花生浆、马铃薯匀浆、新鲜猪肝匀浆、苹果汁、雪梨汁、橘子汁，每种物质都要探究主要含有糖类还是含有脂肪还是含有还原糖。同学们同时注意以下几点： 第一、配置菲林试剂的时候要注意用量，配好的斐林试剂不是全部倒入验证还原糖试剂里；为了节约能源，水浴加热的热水，到老师讲台取用已经烧好的热水，再加热。注意颜色的变化过程。 第二、验证脂肪的时候，滴加了A 液后、必须震荡，才能滴加B 液； 第三、注意药品不能随意混用，尤其是滴管是专用的； 第四、先做验证实验，再做探究实验； 第五、实验完成后，废液必须统一倒入指定的废液回收瓶，并清洗好仪器； 第六、必须如实记录实验现象。做切割花生切片的时候不要伤手了。 橘黄色 苏丹Ⅲ染液 苏丹Ⅳ染液 双缩脲试剂 斐林试剂

蛋白提取实验步骤51063

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。

蛋白质工程教学设计

蛋白质工程教学设计 教学内容:蛋白质工程 教学时间:1.5课时 教学对象:小教08数学 讲课者:王约纳29 一、教学目标: 1、掌握蛋白质和蛋白质工程的概念、功能和应用了,解蛋白质工程的原理。 2、尝试运用逆向思维分析和解决问题。 二、教学重难点: (1)蛋白质工程的原理。 (2)蛋白质工程的应用 三、教学方法 教授法、启发式教学 四、教学过程: (一)什么是蛋白质 1.蛋白质的概念

蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子,各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面,起着关键的作用。如血浆蛋白质、纤维状蛋白质、酶蛋白质等。 2.生活中的蛋白质 展示各种生活中蛋白质的图片。还有些什么? 3.蛋白质的功能 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子,它广泛地存在于所有生物界的机体之中,具有许多重要的作用: ①酶:构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行的; ②抗原抗体:高等动物的免疫反应,也主要是通过蛋白质即抗原和抗体来完成的;,免疫球蛋白 ③运动:运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的;鞭毛、肌肉蛋白 ④呼吸:运输氧和二氧化碳的是血红蛋白; ⑤激素:具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激素。 蛋白质的应用 ①蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。

②用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化,治疗某些消化不良性疾病;胰岛素用于治疗严重的糖尿病;转氨酶作为肝病变的指标等。 ③食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。 例如,酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。 4.蛋白质的结构 ①氨基酸是蛋白质的基本结构单位,各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线 形头尾相连,构成不同长短的肽链。 ②肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构,这时才产生具有生物活 性的天然蛋白质。 ③多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。 (二)蛋白质工程的崛起 1、蛋白质工程的概念 是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求 这是一门从改变基因入手,定做新的蛋白质的技术。故有人将其称为“第二代基因工程”