荧光分光光度计- 原理

分子荧光分析法

发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。

根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种：

1. X射线荧光分析法

用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。

2. 原子荧光分析法：

待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。

荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。

荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。

3. 分子荧光分析法：

有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。

基本原理

一. 分子荧光的发生过程

（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态

大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，

称“单线态”；

图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）

当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；

如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；

“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生：

（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）

处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：

1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能

量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。

图2 分子吸收和发射过程的能级图

2. 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。

（“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）

3. 外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用（如碰撞）而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。

4.系间跨跃：当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的S—T 跃迁，这一过程称为“系间跨跃” 。

（含有高原子序数的原子如Br2、I2 的分子中，由于分子轨道相互作用大，此过程最为常见。）

5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为“荧光发射”。

如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒。（它代表荧光的寿命）

由于不同电子激发态（S）的不同振动能级相重叠时，内转换发生速度很快（容易），在10-11~1013秒内完成，所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多，因此，尽管使分子激发的波长有短（λ1）有长（λ2），但发射

荧光的波长只有λ3（>λ1>λ2）。

6. 磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。

（磷光的波长λ4较荧光的波长λ3稍长，发生过程较慢 约 10-4~10s ）

由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的，三线态寿命比较长，（10-3~10s 左右），若没其它过程同它竞争时，磷光的发生就有可能；由于三线态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。 总之：处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。

如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快，则荧光发生几率高，强度大。

如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢，则荧光很弱或不发生。

（三）荧光量子效率：

物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。

吸收激发光的光子数

发射荧光的光子数=Φ (1) Φ 数值在 0~1 之间。他的大小取决于物质分子的化学结构及环境（t 0c 、pH 、溶剂等）。

二. 激发光谱与荧光（发射）光谱

1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F )，作F —λ光谱图称激发光谱。 从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex ，选用 λex 可得到强度最大的荧光。

2. 荧光光谱：选择λex 作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 F- λ 光谱图称为荧光光谱。

荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。

λex 与 λem 一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。

三. 荧光与分子结构的关系

1. 分子结构与荧光

具有 π、 π 及 n 、 π 电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生 π -π* 或 n - π* 跃迁，然后在受激分子的去活化过程中发生 π*- π或 π*- n 跃迁而发射荧光。 发生 π - π* 跃迁分子，其摩尔吸光系数（?）比 n - π* 跃迁分子的大100—1000倍，它的激发单线态与三线态间的能量差别比 n - π* 的大的多，电子不易形成自旋反转，体系间跨越几率很小，因此， π - π* 跃迁的分子，发生荧光的量子效率高，速率常数大，荧光也强。

所以——只有那些具有 π- π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光；

π 电子共轭程度越大，荧光强度就越大（ λex 与 λem 长移）大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光，且 π 电子共轭越长， Φ 越大。

2. 取代基对分子发射荧光的影响

（1）（苯环上）取代 给电子基团，使 π 共轭程度升高 荧光强度增加：如–CH 3，–NH 2 ，–OH ，–OR 等。

（2） (苯环上）取代吸电子基团，时荧光强度减弱甚至熄灭：如： ，–COOH ，–CHO ， –NO 2 ，–N=N –。

（3）高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。如：Br ，I 。

3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。

例如：荧光素呈平面构型，其结构具有刚性，它是强荧光物质；而酚酞分子由于不易保持平面结构，故而不是荧光物质。

? 溶液的荧光强度

一.荧光强度与溶液浓度的关系

荧光是由物质吸收光能后发射而出，因此，溶液的荧光强度 F 和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光频率有关：

F ∝（I 0-I t ）→ F = K ’（I 0-I t ） (2) K ’ 为常数，取决于荧光物质的量子效率Φ，根据L —B 定律：

bc

t I I ε-=100

bc t I I ε-?=100

所以 F = K’ ( I 0-I 010

-εbc ) = K’ I 0 ( 1-10-εbc ) = K’ I 0 ( 1-e -2.303εbc ) (3) 将式中 e -2.303εbc 展开，得

)!

3)303.2(!2)303.2(303.2('3

20 ++-=bc bc bc I K F εεε (4) 当 2.303εbC ≤ 0.05 时(浓度很小，溶液较稀时)，上式括号内第一项以后的各项均可忽略不计，所以：

F = K’I 02.303εbc （5）

对于一荧光物质的稀溶液，当 I 0 及 b 一定时，

F = K·c （6）

即在低浓度（2.303εbc ≤ 0.05）时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈（线性）正比关系。

二. 定量分析方法

1. 工作曲线法：

配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，同空白溶液，使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F s 、F 0、F x ，然后作（ F s - F 0）— c 曲线，根据（F x –F 0)，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。

2. 直接比较法 ：

如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：

F sˉF 0 = Kc S ， F xˉF 0 = Kc x s s x x c F F F F c ?-==

0 （7） 三. 影响荧光强度的外界因素

1. 激发光源：一般选用λex 最大

但对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长，低 I 0 及短时间光照

2. 温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间，分子与溶剂分子之间的碰撞频率升高，非辐射能量转移过程升高，Φ 降低，因此，降低温度，有利于提高 Φ 。

3. 溶液的 pH ：带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物的荧光一般都与 pH 值有关，有些化合物在离子状态时不显荧光。为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格

控制溶液pH值是非常重要的。

4. 溶剂：对π—π共轭的荧光物质

在极性溶剂中，?E 减小↓→跃迁几率升高↑→Φ↑（波长长移）

溶剂粘度↓→Φ↓

5. 内滤：当荧光波长与荧光物质或其它物质的吸收峰相重叠时，将发生自吸收使荧光物质的荧光强度下降，此现象称“内滤” 。

6. 散射光的影响（溶剂的二种散射）

（1）瑞利散射光：物质（溶剂或其它分子）分子吸收光能后，跃迁到基态的较高振动能级，在极短时间（10-12s）返回到原来的振动能级并发出和原来吸收光相同波长的光，这种光称为瑞利散射光。

（2）拉曼散射光：物质分子吸收光能后，若电子返回到比原来能极稍高（或稍低）的振动能级而发射的光称为拉曼散射光。

瑞利散射光波长与激发光波长相同，拉曼散射与激发光波长不同，而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关，因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。

7. 荧光熄灭剂的影响：

荧光熄灭：荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低的现象。

荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。

如：X-，重金属离子、O2、硝基化物质、重氮化合物等。

尤其是溶液中的溶解氧能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象，因此，在较严格的荧光实验中必须除O2 。

8. 表面活性剂的影响：提高荧光强度。

?测量荧光的仪器

荧光计、荧光分光光度计的基本组成部件：激发光源、样品池、单色器、检测器、显示系统。

1. 激发光源：要比吸收法中光源强度大。

汞灯：提供线光谱（光源强度随 变化大）

碘钨灯：提供连续光谱300~700nm.

氙灯：提供连续光谱250~700nm，300~400nm 段强度相近。

激光：发光强度大，能极大地提高荧光分析的灵敏度。

2. 样品池：通常用石英材料制成长方体形（方形），（散射光较少），低温荧光测定时在一样品池外套一个液氮的透明石英真空瓶。

3. 单色器：

荧光计——两个滤光片。

第一滤光片：在光源与样品池之间，滤去不需要的光让需要的激发光通过。

第二滤光片：在样品池与检测器之间，滤去溶剂散射光，容器表面散射光，杂质发出的光等，让待测物质发射的荧光通过。

荧光分光光度计——两个光栅（位置同滤光片）单色性好。

4. 检测器：因荧光通常较弱，采用光电倍增管作检测器，灵敏度高。

5. 显示系统：光度表、计算机操作系统等

?应用与示例

一.无机化合物的荧光分析

无机化合物除了钠盐等少数例外，一般不显示荧光。但很多金属或非金属离子可以与一有π电子共轭结构的有机化合物形成有荧光的化合物后，用荧光法测定：

1. 直接分析法：形成配（鳌）合物

元素：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Ge、Hf、Mg、Nb、Pb、Rh、Ru、S、Se、Sn、Si、Ta (钽)、Th(钍)、Te、W、Zn、Zr 等。

常用有机荧光试剂：8-羟基喹啉，安息香、茜素紫酱R，黄酮醇，二苯乙醇酮等。

二. 有机化合物的荧光分析

荧光分析法主要应用于有机物、生化物质、药物的测定（200多种）；包括

有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。

药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。

维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、叶酸等。

甾体、抗生素、酶、辅酶等。

常见荧光试剂：荧胺→脂肪族或芳香族伯胺类；

邻苯二甲醛(OPA) →伯胺类及大多数氨基酸；

NBD →伯及仲类氨基酸，尤其是脯氨酸。

三. 基因研究及检测

遗传物质的脱氧核糖酸(DNA), 自身的荧光效率很低, 一般条件下几乎检测不到DNA 的荧光.因此, 常选用某些荧光分子作为探针, 通过探针标记分子的荧光变化来研究DNA 与小分子及药物的作用机理, 从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前, 典型的荧光探针分子为溴化乙锭(EB)。此外也使用钉的配合物等.在基因检测方面, 已逐步使用荧光染料作为标记物来代替同位素标记, 从而克服了同位素标记物产生的污染、价格昂贵及难保存等的不足。

LS55操作说明书荧光-磷光-发光分光光度计中文培训手册

ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 ２００３　年４月

一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。

图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图

荧光分光光度计- 原理概要

分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。

基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能

荧光分光光度计

荧光分光光度计 荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。 基本结构与原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 基本结构和原理如图所示，光源与检测器成直角方式安排。 荧光分光光度计的工作原理： 物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光 的形式放出，从而产生荧光． 不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 荧光分光光度计基本结构和原理图 1. 光源： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 2．激发单色器： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

高等仪器分析实验荧光分光光度计的使用

高等仪器分析实验(荧光分光光度计的使用) 实验目的 1． 2．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步荧光光谱 3． 4．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方

F-27000荧光分光光度计使用操作步骤

F-2700荧光分光光度计操作规程 1、开机： （1）开启计算机 （2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。 （3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入 （4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready） 2、点击扫描界面右侧“Method” 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence (荧光测量) 设定波长扫描范围 扫描荧光激发光谱(Excitation)：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL） 扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL） 其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定” 3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存） （1）点击扫描界面右侧“Sample” （2）样品名可自行命名 （3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据（4）参数设置好后，点击“OK” 4、扫描测试 （1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力） （2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图 5、数据处理与保存 （1）选中自动弹出的数据窗口 （2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作 （3）“File”--“Save as”对数据进行保存 6、关机顺序： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000 （2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色 （4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热） （5）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用 （6）关闭计算机

紫外分光光度计及荧光积分球

前言： 在分光光度计中，一个是作为检测器用的光电倍增管，另一个是作为附件用的积分球，两者看似没有直接的联系，实际上，积分球的问世和使用正是弥补了光电倍增管在检测多样化样品时的自身缺陷。 而对于积分球检测器这种附件，许多仪器使用者了解甚少，甚至没有听说过。为此，本文针对这两者的关系做一简单介绍，以飨读者。 1．光电倍增管的使用： 光电倍增管英文名称是photomultiplier tube，简称PTM。在目前的一些双光束分光光度计中经常使用光电倍增管作为检测器。由于光电倍增管具有灵敏度高，噪声低及响应速度快的特点，所以被广泛地应用在许多光学仪器中作为检测器，这是众所周知的常识。 2．光电倍增管的结构： 光电倍增管有侧窗式和端窗式两种，在实际应用范围里又以侧窗式居多，因此、本文以R 928型侧窗式光电倍增管为例加以介绍。 R928型光电倍增管有11个电极，分别为：1个光阴极（Ｋ），9个倍增极，也称打拿极（D Y）和1个阳极（P）；外观图和内部图如图－1，图－2所示：

图－1、R928型光电倍增管外观图

图－2、R928型光电倍增管内部结构顶视图 3．光电倍增管的简单工作原理： 当入射的检测光信号（S/R）照射到光阴极（K）后，光阴极向真空中激发出光电子。这些光电子首先进入倍增系统的第一个打拿极DY1，然后通过进一步的二次电子发射，逐级通过其余的8个打拿极（DY2～DY9）而得到递增式的倍增放大；最后这些被多次放大后的电子被阳极（P）收集作为信号输出。图－3是R928电极排列及供电电路示意图：

图－3、R928电极排列及供电电路示意图 4．光电倍增管灵敏度特性的分析： 虽然光电倍增管有许多优点，但暇不掩玉，该器件自身也有两个致命的缺陷； ①灵敏度因强光照射（这也就是为何仪器在通电的情况下样品室盖子不能打开的原因）或因照射时间过长而降低，停止照射后又部分地恢复；鉴于光电倍增管的这种特性致使它随着使用时间的累加，灵敏度会逐渐下降（一般从长波长开始下降，俗称“红外紫移”）且噪声输出却逐渐加大，直至被弃用。我们把这种现象称为“疲乏效应”。 ②光阴极表面各点的灵敏度不是均匀的，而是根据入射光束的输出变动而定。 对于第一个缺陷由于有个时间的累积过程，故负面效应在短时间内不是很凸显；但是对于第二个缺陷，却直接影响着不同样品的在线分析结果。于是就引出了一个关于光电倍增管灵敏度特性这样一个概念的分析。 侧窗型光电倍增管由于光电面（光窗）的弧形结构及电极的几何形状等原因，致使光阴极表面各个位置上的灵敏度是不均匀的，但是造成这种不均匀的原因不是光阴极表面本身，而是入射光束（或光斑）作用在光阴极光电面上不同的位置（locality）所致。形象地说，就是入射光束照射在光阴极表面上不同的位置会直接影响着阳极灵敏度的高低（即阳极输出电流的大小），这种特性关系见图－4所示： 图－4、光电倍增管的灵敏度特性 我们从上面示意图可以看到，入射光束作用在光电倍增管光电面上的位置不同会改变其输出的灵敏度；水平位置对灵敏度的影响最为明显，垂直位置其次。如果入射光束照射在光电面的水平方向的边缘时，甚至使检测器失去了放大功能，这也就是为何仪器在更换光电倍增管后需要仔细地调整管子与入射光束的垂直角度和高低的原因。如果有机会你会发现，许多仪器上的光电倍增管的光电面（光窗）不是与入射光束形成垂直0°度角，而是有个小小的偏差角度，其原因就是为了寻找检测器最佳灵敏度位置的结果。 5．不同测试样品对灵敏度的影响：

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量

荧光分光光度法测定荧光素钠的含量 一、实验目的 1.学习荧光分光光度法测定荧光素钠的分析原理。 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素钠的方法。 二、实验原理 荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 三、仪器及试剂 1．仪器 960荧光分光光度计； LC-UV 紫外检测器； 微量进样器 2．试剂 ① 二氯荧光素（分析纯）； ② 荧光素钠 四、操作步骤 1.标准溶液配制 准确称取0.05g 二氯荧光素标样，配制成2500ml 溶液，则此溶液浓度为0.05μm/mL ，分别移取此溶液2.0ml 、4.0ml 、6.0ml 、8.0ml ，于25ml 容量瓶中，bc I I F εφ0303.2=Kc I F =

并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。 2.荧光强度测定 (1)荧光光度计操作 开启220V稳压电源至220V； 打开主机电源开关。 检查氙灯电是否开启。 (2)二氯荧光素发光谱的绘制，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④发射波长EMISSION Wavelength 250.0 nm； ⑤激发波长范围200-350 nm； ⑥将某一浓度的二氯荧光素标液置于试样池中； ⑦扫描得到激发光谱。 (3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下： ①设定纵坐标 ②设定灵敏度； ③设定扫描速度； ④设定激发波长EXCITION Wavelength 496.0nm(从激发光谱曲线中)得到； ⑤发射波长范围EMISSION Wavelength 518nm； ⑥将1号标准溶液放入试样池中； ⑦扫描得到荧光光谱。 仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。其余4各标准溶液和样品液只要重复上述⑥⑦操作，就可以分别得到它们的荧光光谱。按各标液的荧光强度做出I-C工作曲线。 五、数据记录及计算 1.列表

高等仪器分析实验-荧光分光光度计的使用

高等仪器分析实验（荧光分光光度计的使用） 实验目的 1．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步 荧光光谱 2．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的 测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。 荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很 强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导 数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧 光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位

置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方 法：?laman=1/（1/? ex-?H2O /10 7）,其中波长单位为nm，?H2O 为溶剂的红外吸收波长，单位为波数，溶剂为水时，主要的红外吸收是O-H 伸缩振动，波长在3300波数。 狭缝的选择：激发和发射狭缝通常并不要求严格一致，为获得较好的灵敏度和准确反 应谱峰形状，测定激发光谱时，选用较大的发射狭缝和较小的激发狭缝是比较好的。而测 定发射光谱时则恰好相反。 灵敏度档的选择：灵敏度档与仪器中光电倍增管的放大倍数有关，对荧光比较弱的样 品，应选择灵敏度较高的档位，反之亦反。但注意不同档位之间的荧光强度值没有确定的 换算关系，不能相互比较。进行定量分析时，所有样品必须在同样的狭缝和灵敏度档位测 量。 仪器及试剂 970MC荧光分光光度计 缓冲溶液：10-2mol/L Na 2HPO4-NaOH 缓冲溶液，pH=11-12

荧光分光光度分析法

第一章荧光分光光度分析法 1.1概述 1.1.1 基本原理 由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。 不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。 在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。 1.1.2 基本结构 图1 荧光分光光度计工作原理示意图 （1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。 （2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。 （3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。

（4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。 1.1.3 仪器操作规程 1.1.3.1 开机 a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。 b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。 1.1.3.2 测样 （1）spectrum模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。 ?对于做荧光光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Emission；给定EX波长；给定EM的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”完成参数的设定。 ?对于做激发光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Excitation；给定EM波长；给定EX的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。 b. 在样品池中放入待测的溶液，点击“Start”，即可开始扫描。 c. 扫描结束后，系统提示保存文件。可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围；在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位，最后在“Channel”中进行通道设定。 d. 述操作步骤对固体样品同样适用。 （2）Quantitative模式 a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。 b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下： Method 选择“Multi Point Working Curve” ；“Order of Curve” 中选择“1st和

LS-50荧光分光光度计操作手册

ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 王国强黄建权编译 ２００２年４月

一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ ０ 表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重 态分别用Ｓ １、Ｓ ２ 表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、 二电子的激发三重态分别用Ｔ １和Ｔ ２ 表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。

图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图

荧光分光光度计操作规程

日本日立F-7000荧光分光光度计基本操作规程 1、开机顺序 （1）开启计算机。（按图中圆圈按钮） （2）开启仪器主机电源。按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）。（按下图中圆圈按钮） （3）观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，

都显示黄绿色。Xe LAMP灯先亮，RUN灯后亮。 2、打开运行软件。 （1）双击桌面图标（FL Solution 2.1 for F-7000）。主机自行初始化，扫描界面自动进入。 （2）初始化结束后，须预热15-20分钟(若要进行定量分析，须预热

30分钟以上，按界面提示选择操作方式。 3.点击右上角Method,进行方法设置。 若要预扫描，可选择3-D scan（如下图）.设置好方法后（见下图），再点击右上角Pre Scan（如上图），

在Instrument Monitor菜单(见下图)的Data mode中选择Fluorescence, 在EX Start WL中输入激发波长200，EX End WL中输入激发波长500,在EM Start WL中输入发射波长210(有利于保护检测器)，在EM End WL中输入700(nm)，为节约扫描时间，扫描速度Scan speed可设置为30000。点击update,可知扫描需要多少时间。EX slit和EM slit一般选择5.0（若荧光强度太弱，可提高该数值， 若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage （电压）中可选择700

（若荧光强度太弱，可提高该数值，若强度太高，可降低该数值），PMT Voltage 0-1000v前面的方框打勾后，可在上面的PMT Voltage 中随意填写电压值。在Response 中选择Auto。 在Processing菜单中(见下图)的 Y Axis中的Max中填5000或

荧光分光光度计使用

工作原理 荧光产生的原理 荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。 荧光产生的原理：化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。 荧光化合物的两种特征光谱 1. 荧光激发光谱，就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。 2. 荧光发射光谱，如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光光谱。 物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。 荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。 荧光发射的特点：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能，发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。 溶液荧光光谱通常具有的特征： (1) 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长。 (2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关。 (3) 荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系 荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。 荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光分光光度计实验

实验2 荧光分光光度计实验 一、实验目的 1、了解发光材料的激发和发射过程； 2、掌握用荧光分光光度计测量发光材料激发光谱和发射光谱的测量方法。 二、仪器用具 F-4600荧光分光光度计，发光材料 三、实验原理 光吸收和辐射与发光材料中的能级结构密切相关。紫外光激发荧光粉发光是研究发光材料发生性能和发光中心在基质晶格中能级结构的重要手段。本实验采用F-4600荧光分光光度计来研究发光材料的激发光谱和发射光谱。 F-4600荧光分光光度计的光学系统从功能上划分为两大部分，即激光光路和发射检测光路。激发光路将光源发出的光分解为单色光输出，照射到发光材料上激发荧光粉发光。发光材料发出的光进入发射光检测光路，被分解为单色光照射到光电倍增管上，光电倍增管输出信号的强度与照射到其上面的光强度呈正比。 由氙弧灯发出的光变色单色光后，即为荧光物质的激发光。被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光粉后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输到记录仪，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱，简称荧光光谱。 当测绘荧光激发光谱时，将激发光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，而让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即激发光谱。 四、实验内容 按实验要求，连接好计算机后开始实验。首先测试发射光谱，设置激发波长460nm，得到该样品的发射光谱，即

峰值波长出现在540nm左右。 加入1个310nm长波通型滤波片， 在测试激发光谱，输入检测波长540nm，得到激发光谱： 利用检测波长波长460nm，得到发射光谱：

荧光分光光度计测试步骤

荧光分光光度计测试步骤 测试步骤： （一）样品准备 1.液体样品根据用户提供的技术指标，检查浓度范围是否合适，如果需要稀释，则要考虑所需溶剂类型和稀释倍数。 2?固体样品均匀粉末、片状或具有光滑平面的块状样品，均可直接测定。 （二）操作步骤 1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃（打开）光源后，根据说明书要求启动计算机。 2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前 仪器应预热。 3.工作条件的选择：环境温度应在20 C ±5C;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、 电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件（如狭缝、PM增益、响应时间等）。 4.基本测定 （1）荧光激发光谱测定 设置仪器参数，扫描发射波长，找到max入em,以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。 （2）荧光发射光谱测定 设置仪器参数，扫描激发波长，找到max入ex,以此为激发波长，记录发射强度与发射波 长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。 （3）差谱测定 设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。

(4)峰面积积分 选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。 (5)荧光强度 选择合适的测量参数，设置入ex入em采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处 的荧光强度。 (6)定量测定 配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置入ex入em按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度一浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。 (三)分析结果的表述 1.荧光激发光谱、发射光谱以及其他光谱由仪器控制电脑直接绘出。 2?峰面积积分、荧光强度由仪器控制电脑计算显示。 3.定量测试：在相同的测定条件下，测定一系列已知浓度的标准溶液的荧光强度，绘制出 荧光强度-浓度的工作曲线。浓度未知的溶液的荧光强度测定后，由工作曲线求出该溶液的浓度。 (四)注意事项 1.在实验开始前，应提前打开仪器预热，并配制好所需的溶液，对于已经配制好的溶液，在不用时放在4C冰箱中保存，放置时间超过一星期的溶液要重新配制。 2.实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。 3.在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测 定上限。 4.实验结束后，要及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱，并且按规定登记实验记录，养成良好的实验习惯。

960CRT荧光分光光度计1

960CRT荧光分光光度计 产品简介-共同特点： 发射单色仪采用1200L/nm凹面光栅。大孔径非球面反射镜，灵敏度特别高，采用1500W 大功率汞灯，激发能量强，采用光源监控技术，测量结果稳定，高性能的光电倍增管，可获得最佳信号噪声比，具有自诊断功能，工作可靠，EM带宽小于10nm 960CRT型特点： 配置Windows95计算机工作站，仪器故障率小，可靠性强 工作站采用中文对话视窗，操作方便 利用鼠标可舒服地进行扫描测定；定量分析；运算；制表和记录等系列操作 可方便地选择联机或脱机工作方式 选配件： ●光源：150W氘灯 ●干涉滤光片（汞灯光源）：254nm、313nm、405nm、436nm、546nm ●干涉滤光片（氘灯光源）：250nm～700nm间任选 主要技术指标： 960MC/CRT型： ●EX波长选择范围：365nm（干涉滤光片） ●EM波长范围：200nm～800nm ●波长准确度：EM±2nm ●波长重现性：EM±1nm ●信噪比：蒸馏水喇曼峰S/N ≥比50,响应时间2s ●测定方法：a.波长扫描b.时间扫描c.定量分析 960CRT型配计算机 ●光谱处理功能： 连续扫描测定：1-4阶导数光谱；计算峰面积；波峰检索；图谱运算；图谱窗口处理；图谱保存及调出；图谱打印输出 ●定量测定： 样品定量分析；时间扫描；绘制标准曲线（1-3次）；浓度直读；自动测定S/N及稳定性；自动背景扣除；定量分析打印输出 970CRT型荧光分光光度计

应用范围 该仪器广泛用于化学、药检、环保、石油化工、医疗卫生、食品营养等场合的微量痕量分析测量。 产品简介 产品特点： 1、高灵敏度高信噪比，S/N比达100以上 2、采用光源监控技术，测量结果稳定 3、采用快速20位A/D变换技术，动态量程宽，线性好 4、采用先进中文windows软件技术，数据图谱处理功能强，操作简便 5、采用标准PC机作为硬件环境，仪器故障率小，可靠性强 6、双单色器系统结构 性能指标：(1)波长范围激发（EX）：200nm-800nm，反射（EM）：200nm-800nm 狭缝：激发（EX）：2nm,5nm,10nm,20nm，发射（EM）：2nm,5nm,10nm,20nm,30nm,40nm，波长准确度：±2nm，波长重复性：≤0.5nm，扫描速度：特快、快、中、慢，时间扫描：60s,300s,600s,900s1200s,1800s6档，灵敏度：6档切换选择，信噪比：激发和发射的频带宽为10nm时蒸馏水的喇曼峰S/N比>100，调零方式：可选择自动调零。

荧光分光光度计的简单使用说明

荧光分光光度计 Fluorescence Spectrometer 国别厂家：日本岛津公司 仪器型号：RF-5301PC 基本原理： 主要技术指标： 灯源：150 W Xe灯 单色器：闪耀式全息光栅，F2.5刻线1300条/mm 波长范围：220 900 nm. 波长精度：±1.5 nm, 分辨率：1.0 nm 狭缝宽:1.5, 3, 5, 10, 15, 20 nm 灵敏度: S/N比150以上（带宽5 nm、水拉曼峰时） 测定方式：荧光光谱测定、定量测定、时间过程测定 软件功能：10通道显示,数据RSC转换, 谱图自动找峰,不同谱图加减乘除, 谱图倒数、导数、常用对数转换等。 主要功能: 固体和液体的激发光谱、发射光谱和同步荧光光谱；荧光物质的定量分析。

使用方法： 1.将荧光光度计的右侧Xe灯开关置于“ON”的位置, 再打开电源开关和电脑电源。 2.双击电脑上的RF-5301PC图标, 静等仪器自检完成,出现喀嚓声后, 显示RF-5301P窗 口。 3.预热：开机预热20分钟后才能进行测定工作。 4.新建文件夹：在Data文件夹里新建本次所做实验的子文件夹 5.启动RF-5301PC后在Acquire Mode中选择欲分析的项目。 6.设定参数：根据测量方式在Configure的Parameter里设定合适的参数。 7.置入样品：将已经装入样品的四面擦净后的石英荧光比色皿放入样品室内试样槽后, 将 盖子盖好。 8.扫描：参数设定完毕后, 点击窗口右下角的“Start”图标,开始扫描, 扫图结束后输入文 件名将文件储存。 9.保存：在“File”中的“Save Channel”对曲线进行保存。 10.转换文件：在“File”的“Data Translation”里单击要转换的“ASCⅡ”格式或者“DIF” 格式。 11.关机：测试完毕后，关闭电脑。之后要先关闭氙灯(Xe灯开关置于“Off”位置), 散热 20分钟后, 再关闭电源开关。 注意事项： 1.开机时，请确保先开氙灯电源，再开主机电源。每次开机后请先确认一下排热风扇工 作正常，以确保仪器正常工作，发现风扇有故障，应停机检查。 2.使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。 3.当操作者错误操作或其它干扰引起微机错误时，可重新启动计算机，但无须关断氙灯电 源。 4.光学器件和仪器运行环境需保护清洁。切勿将比色皿放在仪器上。清洁仪器外表时，请 勿使用乙醇乙醚等有机溶剂，请勿在工作中清洁，不使用时请加防尘罩。 5.为延长氙灯的使用寿命, 实验完毕后要先关闭Xe灯, 不关电源主机电源(光度计的右 侧)，等其散热完毕后再关闭电源。

荧光分光光度计及其应用_李淑玲

荧光分光光度计及其应用 李淑玲 地矿部岩矿测试技术研究所　北京　100037 摘要　评述了近年来荧光分光光度计的发展,介绍了国内荧光分光光度计的研制及生产情况,综述了荧光分析技术的应用。 关键词　荧光分光光度计　发展　应用　综述 近年来,我国在荧光分光光度分析技术领域的研究取得了许多新的进展。如荧光总发光光谱技术、荧光探针、光纤荧光传感器、激光诱导时间分辨发光技术、荧光薄层扫描技术、动力学荧光法等。因此,对荧光分光光度计的要求不断提高。目前国内生产荧光分光光度计的厂家较少,国外厂商提供的都是中高档的荧光分光光度计。研制和生产性能可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。 1　基本原理 当激发光照射某些物质时,处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态,这些激发态分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后,以无辐射跃迁下降到低振动能级,再从低振动能级下降到基态,在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。 荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲,荧光强度I f等于分子所吸收辐射的光强度I a与量子效率的积[1],即I f= f·I a= f I0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低,则I f=2.3f I0εbc=kc。这就是荧光定量分析的理论公式,式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、液池厚度及被测物质的浓度。 2　荧光分光光度计的基本结构 荧光辐射是从样品发生的,其在所有方向发射都相同,原则上可以从任何角度进行观测。但从仪器设计和应用的观点来看,90°角度是最方便且是目前使用较为广泛的方式。 荧光分光光度计的基本结构是: 光源※单色器或滤光片※样品池※单色器或滤光片※检测器。 目前荧光分光光度计的常用光源为氙灯,单色器多用光栅,检测器主要用光电倍增管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长一般在200～900nm。 3　荧光分光光度计的分类 3.1　滤光片式荧光计 3.1.1　单光束滤光片荧光计 单光束滤光片荧光计的工作原理是第1滤光片允许紫外线(激发光)通过,第2滤光 李淑玲　女,副研究员,近年从事激光喇曼光谱分析技术应用研究。中国分析测试协会九五分析仪器发展调查项目资助。