DNA甲基化分析方法

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《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）

●　技术与方法

文章编号： １０００－１３３６（２００８）04－0489-03

ＤＮＡ甲基化分析方法

肖正中 邬苏晓

（韶关学院英东生物工程学院，韶关　５１２００５）

摘要：ＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。甲基化分析的方法多且研究难度大，各种方法都有其一定的优势和不足。本文综述了基因组ＤＮＡ甲基化和特定ＤＮＡ片段甲基化状态分析方法新进展，为研究者提供参考。关键词：ＤＮＡ甲基化；ＣｐＧ岛；表观遗传学中图分类号：Ｑ３３４

收稿日期：２００８－０４－１２

作者简介：肖正中（１９７２－），男，博士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｚｚｗｓｘ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；邬苏晓（１９７２－），女，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｗａ４０３５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ

ＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的Ｃ５位，形成５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ），甲基化的胞嘧啶多位于ＣｐＧ岛上。ＣｐＧ岛是ＣｐＧ二联核苷富集区域，ＣＧ含量大于５０％，长约２００￣５００　ｂｐ。哺乳动物ＤＮＡ甲基化的模式只有５ｍＣ这一形式，真核生物中大约２％￣７％的胞嘧啶被甲基化修饰。１． 基因组ＤＮＡ甲基化分析方法

早期的基因组ＤＮＡ甲基化分析技术，如ＳｓｓＩ甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。１．１　甲基化敏感扩增多态性技术 甲基化敏感扩增多态性（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＭＳＡＰ）技术由Ｒｅｙｎａ－ｌóｐｅｚ等报道，并被用于检测双相型真菌的ＤＮＡ甲基化［１］

，它　是在扩增片段长度多

态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，　ＡＦＬＰ）技术的基础上建立起来的。其基本程序是：提取高质量基因组ＤＮＡ，分别用ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ，ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ两组酶组合对基因组ＤＮＡ进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行ＰＣＲ扩增。扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次ＰＣＲ扩增，扩

增产物变性后在６％的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析ＤＮＡ条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用［２－６］。

ＭＳＡＰ技术相对其他测定ＤＮＡ甲基化程度的技术有如下优点：（１）不需知道被测ＤＮＡ的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于ＤＮＡ序列背景知识未知的生物。（２）操作相对简便，在ＡＦＬＰ技术体系的基础无需改进，即可操作。（３）可在全基因组范围检测ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化变化。ＭＳＡＰ技术的局限性在于不能完成非ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化。１．２　高效液相层析及相关方法 高效液相层析（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，　ＨＰＬＣ）能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将ＤＮＡ样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算５ｍＣ／（５ｍＣ＋５Ｃ）的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Ｆｒａｇａ等［７］运用高效毛细管电泳法（ｈｉｇｈ　ｐｅｒ－ｆｏｒｍａｎｃｅ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　ＨＰＣＥ）处理ＤＮＡ水解产物确定５ｍＣ的水平，相比ＨＰＬＣ，ＨＰＣＥ更简便、快速、经济。ＨＰＬＣ及ＨＰＣＥ测定基因组整体ＤＮＡ甲基化水平的敏感性均较高。２． 特定ＤＮＡ片段甲基化检测方法

２．１　亚硫酸氢盐预处理法 （１）甲基化特异性ＰＣＲ。甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）是Ｈｅｒｍａｎ等［８］首先提出的一种

检测基因组ＤＮＡ甲基化水平的常用方法。该法是将ＤＮＡ经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在ＰＣＲ反应

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ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）

●Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ

时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的ＤＮＡ序列无互补配对。ＭＳＰ引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的ＣｐＧ岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中ＣｐＧ岛所占比例越高，甲基化ＤＮＡ检出率越高。该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对ＤＮＡ处理不完全，也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验ＰＣＲ产物作进一步判断。

（２）变性高效液相色谱法。Ｏｅｆｎｅｒ等［９］提出变性高效液相层析（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ＨＰＬＣ，　ＤＨＰＬＣ）用于单核苷酸和ＤＮＡ分析。邓大君等［１０］将该法改进并与ＰＣＲ联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的ＤＮＡ产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的ＰＣＲ扩增时，其变性温度也相应上升，使ＰＣＲ产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列甲基化状况。

（３）联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｂｉｓｕｌｆｉｔｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　ＣＯＢＲＡ）原理：先对样本ＤＮＡ行亚硫酸氢钠处理后，ＰＣＲ扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含ＣＧ序列，如ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）。若其识别序列中的Ｃ发生完全甲基化（５ｍＣＧ５ｍＣＧ），则ＰＣＲ扩增后保留为ＣＧＣＧ，ＢｓｔＵ　Ｉ能够识别并进行切割；若待测序列中，Ｃ未发生甲基化，则ＰＣＲ后转变为ＴＧＴＧ，ＢｓｔＵＩ识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例［１１］。Ｂｒｅｎａ等［１２］联用ＣＯＢＲＡ和Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ对酶切产物进行直接分析，使ＣＯＢＲＡ的定量更快速、准确且无放射性污染。该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道ＣｐＧ位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品ＤＮＡ中甲基化存在的可能；由于酶和ＰＣＲ的使用，序列分析受到限制。

（４）甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法。甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）可用于快速判断ＤＮＡ片段中某些具体位点的甲基化状况［１３］。其原理：样本ＤＮＡ经亚硫酸氢钠修饰，ＰＣＲ扩增目的片段，产物电泳分离后作为Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ模板。分别针对所检测的ＣｐＧ位点设计上游引物，使３＇－端引物紧邻Ｃ。然后将模板、引物、Ｔａｑ酶及３２Ｐ标记的ｄＮＴＰ混合，进行单核苷酸延伸反应。若所检测的ＣｐＧ位点发生甲基化，则３２Ｐ标记的Ｃ掺入到ＰＣＲ产物中；反之，未甲基化掺入的则为Ｔ。再电泳分离产物，成像。根据某一ＣｐＧ位点的Ｃ／Ｔ信号强度比，可定量其甲基化程度。也可不经电泳，ＰＣＲ产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个ＣｐＧ位点的平均甲基化程度［１４］。Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ可快速定量多个ＣｐＧ位点的甲基化程度，但它不能对较长的序列进行全面的考察，且检测多个ＣｐＧ位点时，需设计较多的引物。

２．２　联合甲基化敏感的限制性内切酶法 （１）甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ。甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ（ＭＳＲＥ－ＰＣＲ）原理为：基因组ＤＮＡ经甲基化敏感内切酶广泛消化后，再设计与所选基因特异性匹配的引物，经多重ＰＣＲ扩增（未被切割的片段不被识别），即可同时、快速检测多基因的ＤＮＡ甲基化状态［１５］。该法用很小量的ＤＮＡ标本即可检测多基因的甲基化状态，且可用于异质性标本，提示其可被进一步发展成为高通量的临床样本分析方法。

（２）　ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ。Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等［１６］报道了将ＭＢＤ柱层析法与甲基化敏感的限制性内切酶法（ＭＳ－ＲＥ）联用的ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ，能快速、敏感地检测ＤＮＡ甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的方法学工具。其过程是：用内切酶切取待测片段，再用甲基化敏感的限制性内切酶消化，消化产物经ＭＢＤ柱捕获含有甲基化区的片段，最后通过实时ＰＣＲ扩增进行定量分析。这种方法联合运用了ＭＢＤ柱层法及ＭＳ－ＲＥ法，避免了单用ＭＢＤ引起的非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。此法简便、快速、特异、敏感。缺点是需要使用限制性内切酶，因此不同程度

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《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２００８，２８（４）

●　技术与方法

地受到内切酶识别位点的限制。

２．３　探针杂交法 （１）甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法。甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法（ＭＳ－ＭＬＰＡ）法是根据ＭＬＰＡ技术发展起来的。其原理是：首先，应用ＭＳ－ＭＬＰＡ探针（探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点）和标本ＤＮＡ进行杂交使之结合形成ＤＮＡ－探针复合物，并用连接酶将探针连接，然后，ＤＮＡ－探针复合物与甲基化敏感的限制性内切酶结合并被消化，最后进行ＰＣＲ扩增、电泳。如果这个ＤＮＡ标本的ＣｐＧ位点被甲基化，一个ＭＬＰＡ产物将会被检测到；如果这个位点没有被甲基化，则这个复合物将被消化而不会产生产物［１７］。该方法敏感、高效，与目前常用的甲基化检测方法相比具有以下优点：只需要极微量ＤＮＡ标本就可以一次检测多种基因的甲基化水平；简便易行，可进行批量检测；ＭＬＰＡ可以进行定量检测；可用于石蜡包埋标本的检测。

（２）　ＤＮＡ微阵列法。Ｙａｎ等［１８］将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于ＤＮＡ甲基化检测中，极大的提高了检测的效率。ＤＮＡ微阵列，　又称ＤＮＡ芯片或基因芯片，是基于杂交的寡核苷酸微阵列法产生的，是一种在基因组中寻找新位点的方法，包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化（ＤＭＨ）杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列（ＭＳＯ）。前者类似于ｍＲＮＡ表达谱或ｃＤＮＡ微阵列，是ＣｐＧ岛微阵列；后者类似于寡核苷酸微阵列，是针对ＣｐＧ二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。ＭＳＯ要求预先设计一对含有２个不相邻的ＧＣ（或ＡＣ）的探针，用于识别甲基化和非甲基化的序列，其中含ＧＣ的探针（５＇－ＧＣＧＣ－３＇）识别甲基化序列，含ＡＣ的探针（５＇－ＡＣＡＣ－３＇　）识别非甲基化序列，探针的５＇－端通

过Ｌｉｎｋｅｒ固定于玻璃板上。首先对待研究片段用亚硫酸氢盐处理，将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，甲基化的不变，再行ＰＣＲ扩增，产物的３＇－端用荧光素标记，移至连有探针的玻璃板上进行杂交，通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序列中甲基化的水平。此法一定要设立对照，可用于多样本、多位点甲基化的检测，样本需要量少，适于临床样本，但不能得到每个ＣｐＧ位点的信息，且探针可能存在交叉杂交，致结果假阳性，影响分析。

虽然人们对ＤＮＡ甲基化的研究开展了大量的工作，但缺乏行之有效的甲基化检测方法。随着甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术将逐步完善，为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供强有力的技术支持。

参　考　文　献

［１］Ｒｅｙｎａ－ｌóp ｅｚ　ＧＥ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，　１９９７，　２５３（６）：　７０３－７１０［２］Ｐｏｒｔｉｓ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，　２００４，　１６６（１）：　１６９－１７８［３］Ｊａｌｉｇｏｔ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｏｍｅ，　２００４，　４７（１）：　２２４－２２８

［４］Ｓｈａ　ＡＨ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　２００５，　２７３（６）：　４８４－４９０［５］Ｍａｒｆｉｌ　ＣＦ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｏｍｅ，　２００６，　４９（２）：　１０４－１１３

［６］Ｄｏｎｇ　ＺＹ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，　２００６，　１１３（２）：　１９６－２０５［７］Ｆｒａｇａ　ＭＦ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２００２，　３３（３）：　６３２－６３４［８］Ｈｅｒｍａｎ　ＪＧ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　１９９６，　９３（１８）：　９８２１－

９８２６

［９］Ｏｅｆｎｅｒ　ＰＪ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，　１９９２，　６２５　（２）：　３３１－３４０［１０］邓大君等．　中华医学杂志，　２００１，　８０（２）：　１５８－１６１

［１１］Ｘｉｏｎｇ　Ｚ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１９９７，　２５（１２）：　２５３２－２５３４［１２］Ｂｒｅｎａ　ＲＭ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００６，　３４（３）：　ｅ１７［１３］Ｇｏｎｚａｌｇｏ　ＭＬ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２００２，　２７（２）：　１２９－１３３［１４］Ｍｅｌｎｉｋｏｖ　ＡＡ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００５，　３３（１０）：　ｅ９３［１５］Ｓｉｅｖｅｒｓ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　Ｃａｎｃｅｒ，　２００５，　４４（３）：　２５６－２６４［１６］Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００６，　３４（３）：　ｅｌ９［１７］Ａｎｄｅｒｓ　ＯＨ　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００５，　３３（１４）：　ｅｌ２８［１８］Ｙａｎ　ＰＳ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２００１，　６１（２３）：　８３７５－８３８０

Methods of DNA methylation analysis

Zheng-Zhong XIAO Su-Xiao WU

(YingDong Biotechnology College, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)

Abstract DNA methylation is one of the important research areas in epigenetics. The analysis of methylation is quite difficult. There are various methods of methylation analysis and each of them has its advantages and disadvantages. This review summarizes the research progress on the methods of DNA methylation and specific DNA fragment methylation analysis, hoping to provide the important reference information for researchers.Keywords DNA methylation; CpG Island; epigenetics

甲基化检测原理及步骤 DNA实验技术方法汇总

DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）

甲基化检测方法

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

DNA甲基化检测技术全攻略

DNA甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。 Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC

DNA甲基化详解

提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为

甲基化检测

甲基化研究方法学回顾 1 整体水平甲基化分析 1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5m C/(5m C+5℃)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA 甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA 水解产物，以确定5mC的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA 分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。 1.2 SssI 甲基转移酶法[22]

SssI甲基转移酶能够催化DNA 的CpG位点发生甲基化。3 H-S-腺苷甲硫氨酸(3 H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA 的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA 甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。 1.3 免疫化学法[23] 这种方法是基于单抗体能够与5m C发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA 特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5m C的水平，其荧光素强度与5m C水平成正比。Oakeley等199 7年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。 1.4 氯乙醛法 Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先，将DNA 经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）[25]，然后经过银或色谱柱去除D NA 链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5m C就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5m C的水平成正比。这种方法可以直接测定整体5m C水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。 2 特异性位点的DNA 甲基化的检测 2.2.1 甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法

甲基化检测方法

甲基化检测方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。

甲基化检测方法

甲基化检测(detection of methylation) 概念：DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶(DNMTs) 的作用下使CpG 二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA 修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA 的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG 岛以外的CpG 序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG 则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR 产物进行测序就可以判断CpG

位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting ，HRM） 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物, 这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞（＞106个）、组织（＞300mg）、血液（＞1ml）、血清（》等样品材料，基因组DNA（体积》20卩I，浓度》50 ng/口l）。

甲基化检测方法

甲基化检测方法 Prepared on 22 November 2020

甲基化检测（d e t e c t i o n o f m e t h y l a t i o n）概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

甲基化检测方法

甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为

尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。