酵母的分子生物学鉴定
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ
?技术与方法?
２００８年第５期
收稿日期：２００８－０３－１４
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３）
作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４
酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来
对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ
ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多
态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａ
ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片
（ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。
１核糖体ＤＮＡ鉴定法
核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的
核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同
酵母的分子生物学鉴定
唐玲
刘平黄瑛杨江科闫云君
（华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４）
摘
要：
酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分
类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。
关键词：
核糖体ＤＮＡ
ＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔ
ＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆ
ｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ
２００８年第５期
沉降系数的核糖体ＲＮＡ片段，它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性，同时由于各种原因具有一定的突变，使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。早期一般选取大小适中的１８Ｓ序列作为鉴定的标准，随后２６Ｓ的Ｄ１／Ｄ２区序列和ＩＴＳ序列也被用于应用于鉴定工作中（图１）。
１．１２６ＳｒＤＮＡ的Ｄ１／Ｄ２序列
２６ＳｒＤＮＡ５＇末端有一个长约６００ｂｐ的Ｄ１／Ｄ２序列，根据Ｐｅｔｅｒｃｏｎ［１］对核苷酸序列可变区Ｄ２的多态性分析，发现这一区域在同种间的该区域核苷酸的差异小于１％，而不同种之间的差异通常远远大于这个数据，这一试验结果表明可以利用２６ＳｒＤＮＡ的Ｄ２区域进行引物设计ＮＬ１（５′－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ－３′）和ＮＬ４（５′－ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧ－３′）扩增２６ＳｒＤＮＡＤ２区基因片段，根据同源性序列来对待测酵母进行分类。该方法已经作为一种酵母分类和鉴定的方法被人们广泛采用。通过Ｋｕｒｔｚｍａｎ等［２］在子囊类酵母２６Ｓ大亚基的研究以及Ｆｅｌｌ等［３］对担子酵母和类酵母真菌２６Ｓ大亚基的研究，基于２６Ｓ的Ｄ１／Ｄ２的酵母鉴定数据库初步形成。目前绝大多数酵母菌种模式菌株的２６ＳｒＤＮＡ大亚基序列已被测定和公布，对于鉴定提供了很大的帮助。因此，现在广泛采用这种方法进行酵母菌的鉴定［４］。但是Ｋｕｒｔｚｍａｎ与Ｆｅｌｌ在利用该方法进行鉴定工作中发现，有的亲缘关系很接近的种类仍旧没有办法进行明确的鉴定。为此，分别引入了ＤＮＡ杂交和ＩＴＳ的方法对鉴定工作中有分歧或不确定的种类进行进一步的确证。
１．２１８ＳｒＤＮＡ基因序列
１８ＳｒＤＮＡ作为一种经典的鉴定方式在真菌的鉴定工作中占有重要作用。用于扩增１８Ｓ片段的ＰＣＲ引物是根据真菌１８Ｓ的保守区域设计。常用的引物：正向引物：５＇－ＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡ－３＇和反向引物：５＇－ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴ－３＇。通过ＰＣＲ对酵母１８ＳｒＤＮＡ片段特异性的扩增并测序，把测序结果进行多态性分析，从而将待测酵母正确的分类［５］。
１．３５．８Ｓ－ＩＴＳ
ＩＴＳ１与ＩＴＳ２属于间隔区，利用ＩＴＳ１和ＩＴＳ２的保守序列设计引物（ＩＴＳ１：５＇－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３＇，ＩＴＳ４：５＇－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３＇），扩增ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ｒＤＮＡ序列，扩增产物大小在３５０￣１０００ｂｐ不等。通过扩增产物多态性分析对酵母进行分类。Ｒｏｓａ在对Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．中的各个种的确定中也也发现了这个缺陷，在将ＰＣＲ扩增产物比对时发现２６ＳｒＤＮＡＤ１／Ｄ２序列的特异性没有５．８Ｓ－ＩＴＳ的效果好。
１．４ＩＧＳｒＤＮＡ基因序列
ＩＧＳｒＤＮＡ处于转录间隔区，由于该区段选择压力相对较小，在进化过程中存在着比表达序列更为丰富的变异。序列差异较好地反映了种属间的系统发育关系。根据ＩＧＳｒＤＮＡ的保守区域设计引物：（２６ＳＦ：５＇－ＡＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＴＧＡ－３＇，５ＳＲ：５＇－ＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＴＣＧＧ－３＇），５７℃退火进行扩增，得到大小各异的ＩＧＳ１片段，根据片段的同源性对酵母进行分类。利用ＩＧＳ１来鉴定遗传距离近得菌株能够更加有效的将其快速便捷的分类，其种间分辨能力远大于ＩＴＳ鉴定。目前，这一方法的应用仍旧相对较少，在对同源性非常接近的种属研究中，这一方法有很大的研究前景［６］。
核糖体ＤＮＡ多态性分析越来越广泛的应用于各种微生物的鉴定工作中。其中，研究最为广泛的是２６ＳｒＤＮＡ大亚基。通过Ｋｕｒｔｚｍａｎ和Ｆｅｌｌ的努力，将子囊菌和担子菌中的大部分酵母的２６ＳＤ１／Ｄ２序列测定出来进一步的确证，并在相应数据库中公布了相关的数据资料，够迅速有效的对未知的酵母进行快捷的分类鉴定。但是２６ＳｒＤＮＡＤ１／Ｄ２序列的研究的精确性却不如５．８Ｓ－ＩＴＳ、ＩＧＳ方法。由于ＩＧＳ是处于转录间隔区，其遗传的稳定性相对较弱，从而使其在种与种之间的特异性增强，以达到快速准确鉴定的目的。现在对于ＩＴＳ和ＩＧＳ的信息有待进一步的完善。
２ＤＮＡ指纹图谱鉴定法
２．１ＩＴＳ／ＲＦＬＰ
只利用５．８Ｓ－ＩＴＳ扩增结果对于酵母进行鉴定，
图１真核生物中编码核糖体的序列（５＇－３＇）
唐玲等：酵母的分子生物学鉴定８５
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需要了解这段序列的一级结构。如果用ＣｆｏＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨａｅＩＩＩ限制性内切酶酶切，通常经过３种内切酶酶切后的ＤＮＡ片段大小显示出来的电泳结果的多态性就可以将不同种属的酵母进行归类。Ｅｓｔｅｖｅ－Ｚａｒｚｏｓｏ［７］利用这种方法对包括子囊菌类酵母和担子菌类酵母的２５个属中的１３２株菌种成功的进行了鉴定，并提供了一个初级的酵母ＩＴＳ／ＲＦＬＰ数据库。除Ｃｒ．ａｌｂｉｄｕｓ和Ｋ．ｌａｃｔｉｓ等少数种类以外，大多数的酵母都可以利用这个方法进行鉴定。但是有的种需要用特殊的限制性内切酶进行切割协助鉴定工作。Ｒｏｓａ［８］采用这个方法将Ｃａｎｄｉｄａ的１６３个种进行了分类鉴定，初步获得了ＩＴＳ／ＲＦＬＰ在酵母分类鉴定的应用的数据库。这种方法对于研究自然发酵过程中酵母的有性无性世代及过程中的优势种的研究有很重要的作用。
现在这一方法已经广泛的用于酵母的鉴定及其他的真菌的鉴定工作中，并获得了较好的效果。但是由于已公布的５．８Ｓ／ＲＦＬＰ的序列信息相对还比较少，尽管限制性图谱可以反映各种属的特异性，但对于单个的酵母细胞的快速鉴定还有一些困难。而且凡是可以引起酶切位点变异的突变均可导致ＲＦＬＰ的产生，从而影响图谱的特异性，进而影响鉴定的结果。
２．２ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）技术
利用约１０个碱基随机组成的片段作为引物对基因组的ＤＮＡ或者直接用单菌落进行ＰＣＲ扩增，根据基因组ＤＮＡ的多态性来检测菌株间基因组ＤＮＡ内核苷酸序列存在的微小变异。利用这些差异的大小来对相应菌种进行分类鉴定。选取合适的引物是ＲＡＰＤ技术成功的关键。ＣＸ５：５＇－ＡＣＡＣＴＧＣＴＴＣ－３＇和ＰＳＴ：５＇－ＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧ－３＇［９］对临床上的非白色念球菌类假丝酵母快速鉴定有很好的作用。Ｇｏｍｅｓ等［１０］利用ＲＡＰＤ对从巴西燃料酒精产品和啤酒产品中分离到１０种具有代表性的酵母菌株进行了研究，利用ＯＰＢ－０２（ＴＧＡＴＣＣＣＴＧＧ），ＯＰＢ－１０（ＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣ），ＯＰＢ－１１（ＧＴＡＧＡＣＣＣＧＴ），ＯＰＢ－１２（ＣＣＴＴＧＡＣＧＣＡ），ＯＰＢ－１３（ＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴ），ＯＰＢ－１７（ＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧ）和ＯＰＢ－２０（ＧＧＡＣＣＣＴＴＡＣ）作为引物扩增对酿酒工业酵母种类进行鉴定。ＲＡＰＤ和ＫＴＳ（Ｋｉｌｌｅｒｔｏｘｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）技术联用在对亲缘关系较近的酿酒酵母进行分类研究有很重要的作用［１１］。Ｃｏｎｓｕｅｌｏ等［１２］用ＲＡＰＤ技术对致病性Ｃａｎｄｉｄａｓｐｐ．进行了快速有效的检测。目前，这种方法常用于酿酒工业酵母以及临床早期的感染源的检测。２．３基于ＤＮＡ重组探针的指纹图谱
利用重复性的微卫星ＤＮＡ作为单一探针进行ＰＣＲ反应，扩增产物形成特异的指纹图谱，通过指纹图谱的特异性来鉴定酵母。这种方法所得到的反应产物较之普通的探测菌种ＤＮＡ多态性的方法具有更丰富的多态性；检测容易、重复性较好，适合于进行自动化分析。可以用于这种方法的重组序列包括（ＧＴＧ）５、（ＧＡＣＡ）４、Ｍ１３核心序列（ＧＡＧＧＧＴＧＧＸＧＧＸＴＣＴ）［１３］、（ＣＡ）８、（ＣＴ）８等。Ｗｉｅｌａｎｄ［１４］利用此法勒获得Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ的指纹图谱。该方法适合于数量少，退化严重的流行病相关微生物的分类研究。
３其它
３．１脉冲电场凝胶电泳（ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）鉴定法
依靠有规律地改变电场的方向而使大分子ＤＮＡ得以分离。目前，已能分辨出高达６０００ｋｂ乃至１００００ｋｂ以上的ＤＮＡ片段［１５］。染色体条数及其大小代表了一个生物所含有的遗传物质的多少及其组织形态的特征随物种的分化而改变，因而具有特定的系统分类学意义。遗传学上的连锁群分析技术曾被用来研究一些有性型真菌，包括一些酵母菌的染色体条数。白逢彦［１６］利用这个方法对利用形态和生理生化形状没有办法鉴定的部分疑难酿酒酵母菌株进行了脉冲电泳核型比较分析，发现这些菌株的电泳核型有明显的不同。但ＰＦＧＥ不能应用于无性型真菌或难以进行有性生殖的种类。染色体组成多态性的存在虽然使脉冲电泳核型分析在种内菌株间遗传差异的显示上具有一定价值，但却影响了其作为种间鉴别特征的直观性。而且无论是ＲＡＰＤ还是核糖体ＤＮＡ都比核型图谱的分辨能力要高。
３．２实时ＰＣＲ
实时ＰＣＲ是近１０年发展起来的技术，通过在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累
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实时监测整个ＰＣＲ进程的定量分析方法。该方法被认为是现在检验低丰度的ＤＮＡ病原体的临床样本的最灵敏的方法，故在流行病的早期探测和分类有很重要的作用。利用实时ＰＣＲ系统和种属特异酶来对ｃａｎｄｉｄａｓｐ．和果汁腐坏酵母进行检测和鉴定中应用前景广阔［１７，１８］。为了使检测更加有效，在探测和鉴定的过程中研究者通常利用特异性的基因序列的表达情况来帮助判断，Ｔｒａｍａ［１９］首次通过实时ＰＣＲ与焦磷酸测序联用的方法来对Ｃａｎｄｉｄａｖａｇｉｎｉｔｉｓ相关ｃａｎｄｉｄａｓｐ．进行探测和研究，并证实了２种方法联用在对Ｃａｎｄｉｄａｖａｇｉｎｉｔｉｓ相关ｃａｎｄｉｄａｓｐ．的研究中的重要作用。
３．３基因芯片
随着人们对酵母基因组全序列的信息的掌握，研究者搜集到大量的探针并将其固定在一定的介质上，这些探针能够扩增出基因组上的ＯＲＦ或者原位表达一些序列以达到检测和鉴定的目的。目前Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ的基因芯片的研究已经初见成效［２０］。４展望
随着分子生物学的发展，越来越多的方法被广泛应用于酵母分类鉴定的工作中，大多数的酵母可以通过其中的一些方法快速准确的鉴定出来，但是对于一些通过一种方法难于鉴定的种类，可以利用两种或多种技术联用以达到鉴定的目的。对致病性酵母（如Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．）的检测和鉴定研究则多利用灵敏度更高、检测更加快捷的方法。如实时ＰＣＲ、基因芯片等方法。随着技术的进步，用于酵母鉴定的数据、资料在不断的更新和完善，酵母的分类和鉴定将会更加快速精确。
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唐玲等：酵母的分子生物学鉴定８７