HPLC_School_Bas_2_仪器介绍

Waters液相色谱仪器介绍
1.e2695 2. 3.
柱温箱 检测器
分离模块
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1
Waters仪器介绍
e2695 Separation Module
分离单元
注射器箱门 柱温箱 溶剂配 比单元
2
前面板显示 屏和键盘 样品室门 溶剂输送单 元进入门
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溶剂脱气装置选件
4
通道独立脱气
GPV
梯度选择阀
3
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溶剂管理器
四元单泵低压梯度 系统
收集活塞室 主活塞室
灌注/排放阀
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密封清洗马达
在线过滤器
4
2

溶剂管理器流路
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2695分离单元:溶剂管理系统
依靠创新设计从根本上提高性能 – 全新设计的流路 – 先进的高速比例阀 – 双压力传感器 – 溶剂进口在柱塞正面 – 线性柱塞驱动装置 – 流速精度达到0.075% – 不需阻尼器或梯度混合器， 不需阻尼器或梯度混合器， 真正降低系统体积
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3

Pump 工作原理
主柱塞 蓄积柱塞
柱塞与流速方向相同
送液(+)
进样点 预压缩
蓄积柱塞送液(0.4)
主柱塞传递溶液 两柱塞之差送向系统(0.4)
0.4 重复 柱塞速度
相对速度 (0)
主柱塞停止 吸液(-) 柱塞与流速方向相反 主柱塞吸液
时间 (秒)
蓄积柱塞吸液
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灵敏度 = 信号与噪音之比
信噪比（ 信噪比（S/N）= 峰高与噪音之比
通过增加峰高增加 S/N 通过降低噪音增加 S/N
6:1
3:1
8:1
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8
4

平稳流速提高灵敏度: 平稳流速提高灵敏度 :示差检测
Waters Alliance
系统
0.85mV S/N = = 40 0.022mV
色谱条件： 色谱条件： Waters 高效糖分析柱 示差折光检测器 样品:葡萄糖和蔗糖各2.5μg 进样:各8次 峰面积重现性(%RSD) ： Alliance 传统色谱泵
1.925 1.659 6.373 2.930 75/25=CH3CN/H2O 1.4 ml/min Waters 410
传统HPLC系统
S/N = 0.8mV = 10 0.08mV
5.00 Minutes
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10.00
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梯度滞后: 梯度滞后 :系统体积的影响
低 压 梯 度
?
?B ?A ?C ?D
?
比例阀
溶剂输送 系统(泵)
?
阻尼器 混合器
?
进样器
?
色谱柱
?
检测器
滞后(系统)体积 /谱带展宽体积 注意∶滞后体积包括进样器、 滞后体积包括进样器、阻尼器、 阻尼器、 ?死体积 (无色谱柱时) 混合器及其管路 ?滞后(系统)体积 ? 溶剂输送 高 ? ?色谱柱 系统(泵) 压 ?进样器 ?检测器 梯 ?溶剂输送 度 系统(泵) ?梯度混合器
?
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5

样品管理器流路
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样品管理系统:特点
全电子设计,除电源外不需其 它任何动力 极佳的线性范围及进样重现 性 交差污染极小(全自动进样针 内、外清洗装置) 低维护成本
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样品管理器
样品瓶位置检测 光纤
Flashing red LED
Internal Diameter .005” .009” .010” .020” .030” .040”
μL/Inch 0.3 1.04 1.29 5.15 11.58 20.6
μL/cm 0.118 0.41 0.507 2.03 4.06(+/-) 8.1
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样品管理系统
样品瓶数目: 120, 分装于5个样品盘(24瓶/盘) 进样次数: 每瓶可连续进样1 到99次 标准样品瓶: 2 mL 定量环标配: 100uL 进样体积: 标准配置0.1 到100 uL 定量环选件: 0.1到2000 uL 样品注射器： 样品注射器：250 微升注射器为标准配置,选配2500 微升的样品注射器。 微升的样品注射器。 最小样品量: 10 uL, 用低体积的内插式小瓶(Insert) 最小进样量: 0.1 uL 样品室温控(选件): 4 到40°C ,增量 1
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柱温箱:
色谱柱加热器： 色谱柱加热器：高于环境温度(最低 20°C)5°C 至60°C 之间。 之间。 选件: 色谱柱加热器/冷却器： 冷却器：4°C至 65°C之间， 之间，设定的温度范围为环境温 度减去15°C 或 4°C（取其中较大值） 取其中较大值）至 65°C，增量为 1°C。 样品加热器/冷却器： 冷却器：4°C 至 40°C 之间， 之间，设定的温度范围为环境温 度减去 25°C或 4°C (取其中较大值)至 40°C，增量为 1°C。 色谱柱选择阀(选件)
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检测器 – 定义
检测器是什么 : – 它是色谱系统中的一个组成部分, ,能够感受流过流通池的化合物的存 它是色谱系统中的一个组成部分 在, 并且给出一个能被记录仪或计算机数据工作站接受的电信号. 并且给出一个能被记录仪或计算机数据工作站接受的电信号. 输出通常是一个 “峰” – 一个色谱峰. 一个色谱峰.
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背景吸收对线性范围的影响
理想的
2
Absorbance
实际的
1
0
Concentration
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背景吸收对线性范围的影响
理想的
2
Absorbance
1
实际的
背景吸收会降低线性范 围 大多数流动相都有吸收 ／或干扰
1
0
背景吸收或噪音
0
Concentration
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Waters 2489 检测器
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吸光度检测器 (UV/Vis)
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2489 248 9的显示屏幕
通道
吸光度
灯开/关
Shift
波长 灵敏度
开/关 单/双波长 键盘锁开/关 诊断开/关 自控/遥控 运行时间(分) 下一画面
AUFS(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位
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传统流通池与TaperSlit分析池的比较
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初始化
显示启动诊断屏幕后， 显示启动诊断屏幕后，检测器将在大约5分钟时间内依次显示以下信息： 分钟时间内依次显示以下信息：
初始化光栅 初始化 点亮灯 剩余预热时间:n分钟 复位光学滤光器 搜索656纳米 优化系统性能 查找校正峰 恢复上次设定 完成初始化
初始化结束后检测器将显示吸光度屏幕。 初始化结束后检测器将显示吸光度屏幕。为了让检测器正常发挥功能， 为了让检测器正常发挥功能，操 作前应至少要预热30分钟。 分钟。
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2489 248 9的面板及操作
主屏幕
单/双波长， 双波长， 自动调零
方法调用， 方法调用，A/B 通道切换 设置及诊断 监视色谱图 第二功能键
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选项移动键 分屏显示键 屏幕对比度 回车键
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运行/停止键
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2489 248 9的面板操作
用面板上DIAG功能,检查灯能量及检测池透光性 用面板上LAMP功能,开灯或关灯并得知灯的使用时间 用面板上SCAN功能,可进行UV光谱扫描
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Waters 2998 PDA 检测器
PDA(PhotoDiode Array):
光电二极管矩阵
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二极管阵列检测器
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由软件设定检测器参数
只需设定如下参 数即可采集数据
— —
操作极为简便 不需费神选择参 比波长及其带宽
波长范围 分辨率 — 每秒采集的光 谱数
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Waters 2475荧光检测器
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荧光检测
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荧光检测的基本原理
发荧光的化合物吸收光(UV或Vis),其分子达到激发态,其返回到基态时 发射光的现象即荧光
激发态 基态
S1
振动能级(2) 激发(1) 发射(3)
S0
(1) 分子在吸收UV 分子在吸收UV或可见光后进入激发态 UV或可见光后进入激发态， 或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能量状态 (2) 电子失去过剩的能量成为振动能， 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态 (3) 电子失去能量达到基态时发出荧光 共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象
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2475的主显示屏
通道选择 增益 波长
发射/能量 灯开/关
开/ 关 单/多波长 键盘锁/开 面板/软件控制 运行时间(分) 下一页
Shift
灵敏度
诊断键开/关
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2475的面板及操作
光谱扫描 开／关灯
主屏幕
自动调零 运行/停止键
方法调用， 方法调用， 通道切换 设置／ 设置／诊断 监视色谱图 第二功能键
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选项移动键 屏幕亮度调节 分屏显示键 回车键
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2475 荧光检测器的扫描功能
扫描功能
– –
由面板功能执行 由Empower软件执行
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荧光检测器使用注意事项
不是所有化合物都有荧光， 不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生 检测器对溶解气体及其它“淬灭” 淬灭”物质敏感,流动相最好能在线脱气 Ex及Em的最佳λ易受温度、 易受温度、溶剂极性和粘度、 溶剂极性和粘度、pH及样品浓度影响 检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通 设置的发射波长至少要比激发波长高10nm
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流动相脱气与否的信号比较
Breeze? with Fluorescence
ColumnWaters PAH Column, @ 27o C Eluent A: Water Eluent B: Acetonitrile Gradient: 60% B to 100% B using curve 9 in 12 minutes Hold 11 minutes Back to initial conditions Flow Rate 1.2 ml/min Injection: 20ul Time programmed wavelength changes
1. Benzo(b)flouranthene – 400 ppb 2. Benzo(k)fluoranthene - 200 ppb 3. Benzo(a)pyrene - 200 ppb
脱气
1000 MV
未脱气
2
3
1
20.5
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21.0
22.0
Minutes
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样品浓度对激发和发射波长的影响
~10–5 M
在庚烷中
~10–3 M
射 发 激发 λ
λ
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荧光检测器的应用及优点
?0.50
环境中的污染物
– –
O
?6.894
CH 3
O
食品中的毒素； 食品中的毒素；例如： 例如：黄曲霉毒 素 – 维生素及氨基酸（ 维生素及氨基酸（衍生） 衍生）
食品、饮料、生物技术及制药
多环芳烃(PAH)，多酚， 多酚，氨基甲 酸酯等
?0.40
H 2N
CH3 HN
O
?9.639 ?0.30
H3C O
?0.20 ?mV ?0.10 ?0.00 ?-0.10 ?5.00
增加选择性 增加灵敏度 – pg到fg范围 低背景技术
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?6.00
?7.00
?8.00
?9.00 ?Minutes
?10.00 ?11.00 ?12.00 ?13.00
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Waters 2424 ELSD
Waters 2424 ELSD
小型、 小型、可堆放型设计 – 所有流路在前面板 – 可用Empower及MassLynx控制 – 亦可单独使用 可存储10个方法
–
o
特点：
蒸发光散射检测器
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ELSD – 基本原理
雾化 — 用氮气作为载气将流动相转化为气溶胶 脱溶剂
—
检测
— —
随着喷射流通过预热室溶剂液滴被蒸发 — 蒸发的溶剂被移出检测器 — 比溶剂挥发性低的溶质变成粒子束与光束交叉 被粒子散射的光被光电倍增管(PMT)收集 光电倍增管的输出与溶质的量有一定的比例关系
到检测池 3. 检测区
1.
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雾化区
2.
脱溶剂区(蒸发)
40
20