植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书 微量法

植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号:BC3125

规格:100T/48S

产品内容：

试剂一：粉剂×2瓶。使用前加少量水溶解，定容至50mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。

试剂二：液体100mL×2瓶，4℃保存。

试剂三：乙酸乙酯，自备。

产品说明：

生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase,PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。

受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（TriphenylFormazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。

试验中所需的仪器和试剂：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。

操作步骤：

一、样品处理：

称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。

二、测定步骤：

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。

2、操作表：取5mLEP管依次加入

对照管测定管

样品（g）0.10.1

试剂一（mL）1

试剂二（mL）21

充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样品，置于研钵/匀浆器中。

试剂三（mL）11

充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取200μL上清至微量

玻璃比色皿或96孔板中，测定485nm下的吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。

三、脱氢酶活力计算

A:用微量玻璃比色皿（光径，1cm）测定的计算公式如下

酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.01为一个酶活单位。

脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.01÷T÷W=33×ΔA÷W。

B:用96孔板（光径，0.5cm）测定的计算公式如下

酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.005为一个酶活单位。

脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.005÷T÷W=66.7×ΔA÷W。

T：反应时间，3h；W：样品鲜重，g。

注意事项：

1.配制好的试剂一避光保存于4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。

2.试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。

3.反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。

4.如果测定出来的吸光值较大，需把样品适当稀释再进行测定，注意计算公式乘以稀释倍数。

5.如果用96孔板进行检测，建议不要使用聚苯乙烯/聚丙烯材质的96孔板。