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用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

第5卷第3期食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 3

2014年3月

Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014

*通讯作者: 梅晓宏, 副教授, 主要研究方向为食品生物技术及转基因食品的安全性研究。E-mail: xhmei0719@https://www.sodocs.net/doc/353419826.html,

*Corresponding author: MEI Xiao-Hong, Associate Professor, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural Un-iversary, No.17, Qinghua East Road, Haidian District, Beijing 100083, China. E-mail:xhmei0719@https://www.sodocs.net/doc/353419826.html,

用GAP 启动子在毕赤酵母中组成型表达重组

猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

曹东艳, 韩诗雯, 陈董鑫, 柳倩, 贺晓云, 许文涛, 梅晓宏*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 100083)

摘要: 目的构建组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kiwi pectin methylesterase inhibitor, kwPMEI)的毕赤酵母(P. pastoris )GS115工程菌株, 探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)对重组菌表达kwPMEI 的影响, 纯化kwPMEI 并鉴定其对番茄果胶酶的抑制活性。方法应用PCR 方法从P. pastoris GS115染色体中扩增了三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP), 以其取代诱导型表达载体pPIC9K-kwPMEI 上的醇氧化酶启动子(pAOX1), 构建了组成型表达载体pGAP9K-kwPMEI, 并转化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE 和Western blot 分析目的蛋白表达情况, 镍柱亲和层析纯化目的蛋白, 并用凝胶扩散方法鉴定其抑制活性。结果重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达了kwPMEI, 48 h 即达到最大表达水平, 表达量约为66 mg/L 。并且以甘油为碳源时kwPMEI 表达量最高。成功分离纯化了kwPMEI, 并经凝胶扩散方法检测表明其具有抑制活性。结论成功构建了组成型分泌表达kwPMEI 的毕赤酵母菌株, 为kwPMEI 在果蔬汁中的进一步应用奠定了基础。

关键词: 组成型表达; 三磷酸甘油醛脱氢酶启动子; 猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂; 碳源; 毕赤酵母

Constitutive expression of kiwi pectin methylesterase inhibitor in

Pichia pastoris using the GAP promoter

CAO Dong-Yan, HAN Shi-Wen, CHEN Dong-Xin, LIU Qian, HE Xiao-Yun,

XU Wen-Tao, MEI Xiao-Hong *

(College of Food Science and Nutritional Engineering , China Agricultural University , Beijing 100083, China )

ABSTRACT: Objectives To construct P. pastoris strains GS115 which can constitutively express recombi-nant kiwi pectin methylesterase inhibitor (kwPMEI) and to explore the effect of carbon source (glucose, glycerol and methanol) on the expression of kwPMEI, purify kwPMEI, and identify its inhibitory capacity to the tomato PME. Methods The GAP gene promoter was amplified from P . pastoris GS115 using PCR, and used to replace the AOX1 promoter (pAOX1) on pPIC9K-kwPMEI, resulting in plasmid pGAP9K-kwPMEI, which was subse-quently transformed into P . pastoris GS115. KwPMEI was identified by Tricine-SDS-PAGE and Western blot, and purified by nickel affinity chromatography. The inhibitory capacity of kwPMEI was verified with a gel diffusion assay. Results The combinant P . pastoris strain constitutively expressed kwPMEI successfully, and the peak concentration of kwPMEI (66 mg/L) was obtained only after a 48-h fermentation. In addition, glycerol was the best carbon source for producing kwPMEI. Finally, KwPMEI was successfully purified, and it showed an inhi-bitory capacity by gel diffusion assay. Conclusion The P . pastoris strains constitutively expressing kwPMEI were

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constructed successfully, which built up the foundation for the further application of kwPMEI in juice industry.

KEY WORDS:constitutive expression; GAP promoter; kiwi pectin methylesterase inhibitor; carbon source;

P. pastoris

1引言

天然的新鲜果蔬汁一般会呈现出均一稳定、分散良好的浑浊态。浑浊态在保持果蔬汁的颜色、风味及质地等感官品质方面有着非常重要的作用, 但是, 随着时间的延长, 果蔬汁往往会发生浑浊态消失的现象, 这主要是由于植物内源性果胶甲酯酶(PME)对果胶的脱甲酯化作用而造成的[1]。而果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)对PME有很强的抑制活性, 可有效解决浑浊态消失问题。但是直接从植物中提取PMEI产量很低, 而利用毕赤酵母表达系统就可大量生产重组PMEI, 以满足果蔬汁加工业发展的需要。

毕赤酵母表达系统具有很多优点, 是目前应用最为广泛的外源基因表达系统之一[2]。截止到2005年, 已有500多个基因在毕赤酵母中成功表达[3]。pAOX1作为一种诱导型启动子[4], 其构成的毕赤酵母诱导型表达系统只有以甲醇作为唯一碳源时, 才能表达和分泌外源蛋白。但是甲醇是一种有毒的物质, 并且在大规模生产过程中易燃、易爆, 很不安全。除此之外, 在高密度发酵过程中, 把碳源从甘油更换到甲醇也很不方便。最近十几年来, 科学家们一直致力于寻找新的组成型启动子来替代pAOX1。1997年, Waterham等[5]首次发现并分离了pGAP。自此以后, 揭开了用pGAP构成的组成型表达系统表达外源蛋白的新篇章。该组成型表达系统不需要把碳源从甘油更换到甲醇, 因此避免了储藏和运输甲醇的花费和危害, 更适合大规模生产外源蛋白。除此之外, 该表达系统相对于诱导型表达系统大大缩短了发酵周期, 提高了生产率。

梅晓宏等[6]利用毕赤酵母pAOX1系统首次诱导表达了猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kwPMEI), 但是应用毕赤酵母组成型分泌表达kwPMEI的研究, 国内外尚未见报道。本文首次构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母表达菌株, 在pGAP调控下, 成功组成型分泌表达了kwPMEI, 促进了其在果蔬汁加工业中的应用。2材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与载体

毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9K-kwPMEI 由作者实验室保存; E.coli DH5α及克隆载体pGEM-Teasy购自天根公司。

2.1.2 酶与试剂

高保真的Pfu DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购于大连宝生物公司; T4连接酶购于Promega公司; DNA胶回收试剂盒购于康为试剂公司; 抗His6-Tag-AP单克隆抗体、山羊抗小鼠单克隆抗体购于碧云天公司; 其他试剂均为进口或国产之分析纯。

2.1.3 仪器

PCR仪(美国Bio-Rad公司); 高速冷冻离心机和电转仪(德国Eppendorf公司); 镍柱(美国GE公司); 电泳仪(北京六一仪器厂); 凝胶成像系统(美国UVP 公司); 酶标仪(美国Thermo公司); 紫外可见分光光度计(上海尤尼柯有限公司)。

2.1.4 培养基

YPD培养基: 1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%的葡萄糖; LB培养基: 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠; MD培养基: 1.34%YNB、2%葡萄糖、4×10-5%生物素。固体培养基再加2%的琼脂粉。

2.2 方法

2.2.1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI的构建

根据发布的pGAP序列[5], 设计上游引物(5′-GCGAGCTCCCTTTTTTGTAGAAATGTC-3′; 划线的为Sac I酶切位点)和下游引物(5′-CGGGATCCTGTGTTTTGATAGTTGTTC-3′; 划线的为BamH I酶切位点), 由上海生工公司合成, 以P．pastoris GS115基因组为模板, 用PCR扩增pGAP 片段, 并将其克隆到载体pGEM-Teasy上, 构建了载体pGEM-Teasy-pGAP。用Sac I和BamH I同时双酶切载体pGEM-Teasy-pGAP和pPIC9K-kwPMEI, 胶回收目的片段后, 通过T4连接酶连接, 构建了载体

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pGAP9K-kwPMEI。

2.2.2 毕赤酵母宿主菌转化及阳性转化子的筛选

用Sal I单酶切质粒pGAP9K-kwPMEI, 经胶回收后, 通过电转化的方法转化到P.pastoris GS115基因组中。用含1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD 平板筛选高拷贝转化子。毕赤酵母基因组中目的基因kwPMEI的拷贝数越多, 对抗生素G418的抗性就会越强, 表达目的蛋白kwPMEI的量也就会越高。因此, 从G418浓度最高的平板上挑取转化子进行组成型表达kwPMEI。

2.2.3 组成型表达kwPMEI

将用4.0 mg/mL G418筛选的高拷贝重组毕赤酵母菌株在新鲜YPD平板上划线, 于30 ℃, 倒置培养2天。挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基中, 过夜培养, 按1%接种量取2 mL菌液接种于20 mL YPD 培养基中, 用250 mL三角瓶进行培养, 培养条件为: 28 ℃、摇床转速为200 r/min。每隔24 h补加甘油至终浓度1%, 培养72 h。每隔12 h取样, 用于测定菌体密度OD600, 蛋白浓度和进行Western blot分析。蛋白总浓度用Bradford法[7]测定, 而kwPMEI的浓度用BandScan软件结合蛋白总浓度进行计算。

2.2.4 补加碳源的优化

按1%接种量将菌液接种于20 mL YPD培养基后, 每隔24 h分别补加不同的碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)至其终浓度为1%, 在最佳发酵时间收集发酵上清液, 并测定kwPMEI的浓度。

2.2.5 kwPMEI的纯化及抑制活性鉴定

发酵上清液经离心后, 用5 mL镍柱进行亲和层析纯化。结合液为: 50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH 8.0; 洗脱液为: 50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑, pH 8.0。纯化的kwPMEI用Tricine-SDS-PAGE进行分析。kwPMEI对于番茄果胶甲酯酶的抑制活性用凝胶扩散方法[8]进行检测, 其中用硫酸铵沉淀法[9]提取番茄果胶甲酯酶。

3结果与分析

3.1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI的构建

根据发布的pGAP序列设计引物, 以P．pastoris GS115基因组为模板, 用PCR方法扩增出了约500 bp左右的pGAP片段(图1A), 与预期结果一致。测序结果证实, 克隆到载体pGEM-Teasy-pGAP上的pGAP片段正确。通过酶切连接的方法构建了重组质粒pGAP9K-kwPMEI, 其具体构建过程如图1B所示。重组质粒pGAP9K-kwPMEI经Sac I和BamH I双酶切鉴定, 可见两条电泳条带9000 bp和500 bp(图1C), 其大小正确。测序证实pGAP9K-kwPMEI构建成功。

3.2 组成型表达kwPMEI

不同时间kwPMEI的表达水平及重组菌的生长状况分析结果(图2)表明: 在pGAP的调控下, kwPMEI很快就开始表达, 并且随着时间的延长kwPMEI表达量逐渐增加, 在48 h时产量达到最高值, 之后随着时间的延长kwPMEI的表达量下降, 这可能是因为蛋白酶的降解[10]。由此, 确定了最佳发酵时间为48 h。kwPMEI的C段融合了His6标签, 能与抗His6-Tag-AP单克隆抗体结合, 如图2B所示, Western blot分析显示在20 kDa左右处有一蛋白条带, 其大小稍大于其原本大小(17 kDa)[11], 可能是由于毕赤酵母中翻译后的糖基化修饰。

3.3 碳源对组成型表达kwPMEI的影响

发酵48 h后离心收集上清液, 并测定蛋白浓度。如图3所示, 当补加甘油时, kwPMEI的表达量最高。而补加甲醇时kwPMEI的表达量最低。研究表明, 有的蛋白在补加甘油时表达量高于葡萄糖[12], 而有的蛋白在补加甘油时表达量却低于葡萄糖[5], 这主要由表达的蛋白种类而定。

3.4 kwPMEI的纯化及抑制活性检测

蛋白电泳Tricine-SDS-PAGE分析结果显示(图4A), 通过镍柱亲和层析后, 能够得到单一的kwPMEI条带, 表明该方法能够成功分离纯化kwPMEI。经过凝胶扩散分析(图4B), 组成型表达的kwPMEI能够有效抑制番茄PME的活性, 表明纯化后的kwPMEI仍然具有活性, 同时也说明镍柱亲和层析能够有效地保持蛋白的活力, 不会使蛋白失活。

4讨论

虽然P.pastoris的pAOXl系统广泛地应用于生产重组蛋白[13-15], 但由于该系统需用危险性高的甲醇作为碳源, 发酵时间长, 并且生产过程中需要进行碳源转换等缺点, 制约了其在外源蛋白大规模生产中的应用。自从Waterham等[5]首次发现并分离pGAP 以后, 陆续有报道称用pGAP构成的组成型表达系统

第3期

曹东艳, 等: 用GAP 启动子在毕赤酵母中组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂 967

图1 重组质粒pGAP9K-kwPMEI 的构建

Fig. 1 Construction of recombinant vector pGAP9K-kwPMEI

注: A: 以酵母基因组为模板扩增pGAP, 1: 阴性对照, 2: 扩增的pGAP; B: pGAP9K-kwPMEI 的具体构建过程;

C: Sac I 和BamH I 双酶切鉴定pGAP9K-kwPMEI, 1: 双酶切结果, 2: 质粒pGAP9K-kwPMEI 。

成功表达了外源蛋白[16-19]。另外, GAP 启动子衍生的巴斯德毕赤酵母组成型表达系统可以采用连续发酵的模式, 避免了pAOX1诱导型表达系统分批发酵的不便。Goodrick 等[20]利用高密度发酵组成型表达了人几丁质酶, 发现采用分批发酵策略表达人几丁质酶时容易降解, 而用连续发酵策略表达时没有观察到酶的降解, 表明pGAP 表达系统更适合大规模生产外源蛋白。

毕赤酵母表达系统中的大部分启动子在表达外源蛋白时都受到碳源的控制, 优化碳源是提高毕赤酵母组成型表达外源蛋白产量的重要策略之一[21]。

D ring 等[22]利用pGAP 系统表达兔肾肽转运蛋白时, 发现以葡萄糖为碳源时其表达量是甘油的2倍。而Menendez 等[23]的研究结果及本文结果表明以甘油为碳源能获得更多的产物。不同碳源对不同蛋白表达的影响各不相同, 只能通过具体的实验来确定最佳碳源。

毕赤酵母表达中常遇到的另一个问题是由于宿主蛋白的存在, 经常使产物不稳定, 影响表达量。为避免表达产物被蛋白酶降解, 所以要优化表达时间或加入蛋白酶抑制剂, 或选择蛋白水解酶缺陷型菌株。此外, 源于pGAP 的毕赤酵母组成型表达系统对

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图2 不同时间kwPMEI的表达水平及重组菌的生长状况

分析

Fig. 2 Analysis of the expression level of kwPMEI and the

cell growth status

注: A图中n=3, B为Western blot分析

图3 碳源对表达kwPMEI的影响(n=3) Fig. 3 Effect of carbon source on kwPMEI expression

于某些蛋白的分泌并不能达到理想的效果, 而且只能表达对细胞没有毒害的外源蛋白, 这都在一定程度上限制了毕赤酵母组成型表达系统的应用。但是, 随着发酵工艺的不断完善和对毕赤酵母组成型表达

图4 kwPMEI的纯化及抑制活性检测Fig. 4 PurificationkwPMEI and detection its inhibitory

activity

注: A: Tricine-SDS-PAGE分析, 1: 表达上清, 2: 镍柱纯化kwPMEI 结果; B: 1: 番茄PME, 2: 番茄PME+纯化的kwPMEI; 其中凝胶

中含有0.1%的果胶。

系统的深入研究, 此组成型表达系统将会拥有更美好的未来。

本研究用pGAP表达系统成功表达并分离纯化了有活性的kwPMEI, 为kwPMEI的进一步优化表达和发酵罐发酵奠定了基础; 构建的适合工业化生产kwPMEI的酵母工程菌株具有良好的产业化应用前景, 为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用打下了铺垫。

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(责任编辑: 张宏梁) 作者简介

曹东艳, 硕士研究生, 主要研究方向

为食品生物技术。

E-mail: caody2012@https://www.sodocs.net/doc/353419826.html,

梅晓宏, 副教授, 主要研究方向为食

品生物技术及转基因食品的安全性研究。

E-mail: xhmei0719@https://www.sodocs.net/doc/353419826.html,

毕赤酵母实验操作技巧介绍材料

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权，陈薇，来大志，于长明，王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)

毕赤酵母表达实验手册

xx酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制：每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：

配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）

酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的

毕赤酵母重组子的MDMM签定方法

培养基的配方： YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）； MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂 MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖操作方法：用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。用点MM、MD平板点方法。准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。 MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。酵母菌可以利用有机物和无机物作为氮源，有机氮源有酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨等，无机氮源有尿素、醋酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵等铵盐。

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主

毕赤酵母表达手册

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型：缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。蛋白胞内及分泌表达：外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分制作者：陈苗商汉桥

酵母表达体系

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，

一：分子克隆 1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml

毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第3期 ·综述与专论· 收稿日期：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人才支持计划（NCET -04-0837），海南省重点学科建设项目专项与海南省教育厅高等学校科研项目（Hjkj200719）作者简介：高炳淼（1982-），男，安徽明光人，硕士研究生，研究方向：海洋药物通讯作者：罗素兰，Tel ：0898-********，E -mail ：luosulan2003@https://www.sodocs.net/doc/353419826.html, 从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一直是个难题。对于基因重组蛋白纯化技术来说，选择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白。毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体。毕赤酵母能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于提纯。纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、反相层析等。 1酵母表达体系巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是在酿酒酵母表达体系的基础上，用其他的酵母菌株构建的、可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养型酵母（Methy -lotrophicyeast ）表达系统[1]。作为第2代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处[2]。巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性[3]。另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化高炳淼长孙东亭罗素兰安婷婷（热带生物资源教育部重点实验室海南大学海洋学院材料与化工学院海南大学生物技术实验中心，海口570228）摘要：随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。关键词：毕赤酵母重组蛋白质分离纯化 Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in Pichia pastoris Expression System Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting （Key Laboratory for Tropical Biological Resources ，Ministry of Education Ocean College College of Materials &Chemical Engineering Center for Experimental Biotechnology ，Hainan University ，Haikou 570228） Abstract ：Along with fast development of the gene recombinant technology ，the application of genetic engineering product is getting widespread ， but the cost of the separation and purification approximately have been being high.So it is essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost.This review focused on progress of Pichia pastoris yeast expression system ，the technique of separation and purification of the recombinant proteins recently. Key words ：Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification

毕赤酵母表达操作手册(精译版)

毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式

毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点 GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或 aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。 2. 基因替换AOX1位点

在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交换事件(取代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表型。基因取代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基因插入His4位点 GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之间发生单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或 aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，还是很容易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统（1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。（2）存在的问题在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统（1）特点自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲

毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)

重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验一、实验目的 1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。二、毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。

毕赤酵母表达手册(详细)

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，