imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ：

2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O）

3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit

4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限

大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I）

5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说

得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate

在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK

点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：

如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale

点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK

7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements

在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold （这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK

8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）

滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set

在弹出来的界面点击OK

9、测量：Analyze>Measure（热键为Ctrl+M或直接按M）

10、记录数据并计算：

结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD（光密度的总和）。

结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。

用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：18854/179252=（/pixel）

同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。

以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：

从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

物流管理定量分析模拟试题

物流管理定量分析模拟 试题 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）

《物流管理定量分析方法》模拟试 题 一、单项选择题（每小题3分，共18分） 1. 若某物资的总供应量（ B ）总需求量，可增设一个虚销地，其需求量取总供应量与总需求量的差额，并取各产地到该销地的单位运价为0，则可将该不平衡运输问题化为平衡运输问题。 (A) 等于 (B) 小于 (C) 大于 (D) 不超过 2. 某物资调运问题，在用最小元素法编制初始调运方案过程中，第一步安排了运输量后，其运输平衡表（单位：吨）与运价表（单位：百元/吨）如下表所示： 运输平衡表与运价表 第二步所选的最小元素为（ C ）。 (A) 1 (B) 2 (C) 3 (D) 4 3．某物流公司有三种化学原料A 1，A 2，A 3。每斤原料A 1含B 1，B 2，B 3三种化学成分的含量分别为0.7斤、0.2斤和0.1斤；每斤原料A 2含B 1，B 2，B 3的含量分别为0.1斤、0.3斤和0.6斤；每斤原料A 3含B 1，B 2，B 3的含量分别为0.3斤、0.4斤和0.3斤。每斤原料A 1，A 2，A 3的成本分别为500元、300元和400元。今需要B 1成分至少100斤，B 2成分至少50斤，B 3成分至少80斤。为列出使总成本最小的

线性规划模型，设原料A 1，A 2，A 3的用量分别为x 1斤、x 2斤和x 3斤，则化学成分B 2应满足的约束条件为（ A ）。 (A) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3≥50 (B) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3≤50 (C) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3＝50 (D) min S ＝500x 1＋300x 2＋400x 3 4. 设? ? ????=??????-=721,7421x B x A ，并且A ＝B ，则x ＝（ C ）。 (A) 4 (B) 3 (C) 2 (D) 1 5．设运输某物品的成本函数为C (q )＝q 2＋50q ＋2000，则运输量为100单位时的成本为（ A ）。 (A) 17000 (B) 1700 (C) 170 (D) 250 6. 某产品的成本函数、收入函数、利润函数分别为C (q )，R (q )，L (q )，则下列等式成立的是（ C ）。 (A) )0(d )()(0C q q L q L q +'=? (B) )0(d )()(0 C q q C q C q -'=? (C) ?'=q q q R q R 0 d )()( (D) )0(d )()(0 L q q L q L q -'=? 二、填空题（每小题2分，共10分） 1. 设某平衡运输问题有4个产地和5个销地，则用最小元素法编制的初始调运方案中填数字的格子数为 8 。 2．某物资调运方案如下表所示： 运输平衡表与运价表 则空格(A 2，B 1)对应的检验数为__4__。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min

↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin

切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)

荧光定量PCR实验中的策略及注意事项

荧光定量PCR实验中的策略及注意事项 前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon 的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman 和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法 选择单通道实验还是多通道实验？ 这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ： 2、 3、 4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们 5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里 在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK 点击OK后会跳出校正后的光密度曲线： 如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages 6、 量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK 7、 只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK 在弹出来的界面点击OK 9、 10、记录数据并计算： 结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD （光密度的总和）。 结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。 （/pixel）用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即： 同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。 以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比： 从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

物流定量分析试题

一、选择题 1．若某物资的总供应量（ C ）总需求量，可增设一个虚销地，其需求量取总供应量与总需求量的差额，并取各产地到该销地的单位运价为0，则可将该不平衡运输问题化为平衡运输问题。 A、等于 B、小于 C、大于 D、不等于 2．某企业制造某种产品，每瓶重量为500克，它是由甲、乙两种原料混合而成，要求每瓶中甲种原料最多不能超过400克，乙种原料至少不少于200克。而甲种原料的成本是每克5元，乙种原料每克8元。问每瓶产品中甲、乙两种原料的配比如何，才能使成本最小？为列出线性规划问题，设每瓶产品中甲、乙两种原料的含量分别为x1克、x2克，则甲种原料应满足的约束条件为（ C ）。 A、x1≥400 B、x1＝400 C、x1≤400 D、 min S＝5x1＋8x2 3．某物流公司有三种化学原料A1，A2，A3。每公斤原料A1含B1，B2，B3三种化学成分的含量分别为0.7公斤、0.2公斤和0.1公斤；每公斤原料A2含B1，B2，B3的含量分别为0.1公斤、0.3公斤和0.6公斤；每公斤原料A3含B1，B2，B3的含量分别为0.3公斤、0.4公斤和0.3公斤。每公斤原料A1，A2，A3的成本分别为500元、300元和400元。今需要B1成分至少100公斤，B2成分至少50公斤，B3成分至少80公斤。为列出使总成本最小的线性规划模型，设原料A1，A2，A3的用量分别为x1公斤、x2公斤和x3公斤，则目标函数为（ D ）。 A、max S＝500x1＋300x2＋400x3 B、 min S＝100x1＋50x2＋80x3

C 、 max S ＝100x 1＋50x 2＋80x 3 D 、min S ＝500x 1＋300x 2＋400x 3 4．设，并且A ＝B ，则x ＝（ C ）。 A 、4 B 、3 C 、 2 D 、 1 5．设??????--=?? ?? ??????-=413021,430421B A ，则 A T －B ＝（ D ） 。 A 、???? ??????--831650 B 、212130-?? ??????-?? C 、??????--815360 D 、223110-????-?? 6．设某公司运输某物品的总成本（单位：百元）函数为C (q )＝500＋2q ＋q 2 ，则运输量为100单位时的边际成本为（ D ）百元/单位。 A.、107 B 、202 C.、10700 D 、 702 7．设运输某物品q 吨的成本（单位：元）函数为C (q )＝q 2＋50q ＋2000，则运输该物品100吨时的平均成本为（ A ）元/吨。 A 、170 B 、250 C 、1700 D 、17000 8．已知运输某物品q 吨的边际收入函数为MR (q )，则运输该物品从100吨到300吨时的收入增加量为（ D ）。 A 、 B 、 C 、 D 、 9．由曲线y ＝ln x ，直线x ＝2，x ＝e 及x 轴围成的曲边梯形的面积表示为（ D ）。 A. e 2 ln d x x - ? B. ln d x x ? C. 2 e ln d x x ? D. e 2 ln d x x ? 二、计算题：

荧光定量实验报告(作业)

RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异 一、实验目的 1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。 2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。 二、实验原理 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA 结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。 三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪 实验材料：MCF7细胞 实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒 四、实验步骤 4.1 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus） 1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA； 2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直至 裂解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟； 3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈 乳白色，室温静置5min； 4)12,000 g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三 层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。 5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 6)向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀

细胞免疫荧光步骤

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

《物流管理定量分析》作业试题(doc 24页)

《物流管理定量分析》作业试题(doc 24页)

《物流管理定量分析》 第一次作业 （物资调运方案的优化的表上作业法） 1．将下列某物资的供求不平衡运输问题（供应量、供求量单位：吨；单位运价单位：元/吨）化为供求平衡运输问题： 供需量数据表 销 地产地I II III IV 供应量

2．将下列某物资的供求不平衡运输问题（供应量、供求量单位：吨；单位运价单位：元/吨）化为供求平衡运输问题： 供需量数据表 销 地产地I II III IV 供 应 量 A 15 18 19 13 50 B 20 14 15 17 40 C 25 16 17 22 60 需 求 量 70 60 40 30 解因为供小于求，所以增设一个虚产地，得供求平衡运输问题如下： 销I II III IV 供 应

量 地 产 地 A 15 18 19 13 50 B 20 14 15 17 40 C 25 16 17 22 60 D 0 0 0 0 50 需 70 60 40 30 200 求 量 3．甲、乙两产地分别要运出物资1100吨和2000吨，这批物资分别送到A,B,C,D四个仓库中收存，四仓库收进的数量分别为100吨、1500吨、400吨和1100吨，仓库和发货点之间的单位运价如下表所示： 运价表单位：元/吨 收 A B C D 点发

点 甲15 37 30 51 乙20 7 21 25 试用最小元素法确定一个初始调运方案，再调整寻求最优调运方案，使运输总费用最小。 解用最小元素法编制初始调运方案如下： 运输平衡表与运价表 收 点发 点 A B C D 发货量 A B C D 甲10 10 00 1100 1000 1 5 3 7 3 5 1 ⑤ 乙15 00 40 10 2000 500 100 2 7 2 1 2 5 ④ 收货量10 15 00 40 11 00 10 00 3100 ②①③

相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

相对定量方法实际操作 （常用方法） 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看 家基因平均 Ct值 对照组目的 基因平均Ct 值 对照组看家 基因平均Ct 值 — 待检样品目 的基因平均 Ct值 ——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例： 如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的

免疫荧光方法

（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠

血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治

物流管理定量分析方法试卷(答案)

1. 若某物资的总供应量大于总需求量，则可增设一个（ A ），其需求量取总供应量与总需求量的差额，并取各产地到该销地的单位运价为0，可将不平衡运输问题化为平衡运输问题。 (A) 虚销地 (B) 虚产地 (C) 需求量 (D) 供应量 2．某物流企业用甲、乙两种原材料生产A ，B ，C 三种产品。企业现有甲原料30吨，乙原料50吨。每吨A 产品需要甲原料2吨；每吨B 产品需要甲原料1吨，乙原料2吨；每吨C 产品需要乙原料4吨。又知每吨A ，B ，C 产品的利润分别为3万元、2万元和0.5万元。为列出获得最大利润的线性规划问题，设生产A ，B ，C 三种产品的产量分别为x 1吨、x 2吨和x 3吨，则目标函数为（ D ）。 (A) max S ＝30x 1＋50x 2 (B) min S ＝3x 1＋2x 2＋0.5x 3 (C) min S ＝30x 1＋50x 2 (D) max S ＝3x 1＋2x 2＋0.5x 3 3. 设?? ? ???=??????-=721,7421x B x A ，并且A ＝B ，则x ＝（ B ） 。 (A) 1 (B) 2 (C) 3 (D) 4 4. 设某公司运输某物品的总成本（单位：百元）函数为C (q )＝500＋2q ＋q 2，则运输量为100单位时的总成本为（ C ）百元。 (A) 202 (B) 107 (C) 10700 (D) 702 5. 已知运输某物品q 吨的边际成本函数（单位：元/吨）为MC (q )＝200＋5q ，则运输该物品从100吨到300吨时成本的增加量为（ D ）。 (A) 100300(2005)d q q +? (B) (2005)d q q +? (C) 300100 (2005)d (0)q q C ++? (D) 300100 (2005)d q q +? 6. 设???? ? ?????-=??????=101201 , 4321B A ，求：AB T ?? ????--=??????-??????=41032411100214321T AB 7. 设5e x y x =，求：y ' 5545()e (e )(5)e x x x y x x x x '''=?+?=+ 8. 计算定积分：3 1 1(e )d x x x -? 3 33111(e )d (e ln ||)e e ln3|x x x x x -=-=--? 9. 试写出用MA TLAB 软件计算函数y = >>clear; >>syms x y;

imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ： 2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O） 3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit 4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限 大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I） 5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说 得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate 在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK 点击OK后会跳出校正后的光密度曲线： 如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale 点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK 7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements 在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold （这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK 8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T） 滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set 在弹出来的界面点击OK

免疫荧光双标法

免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈

《物流管理定量分析方法》模拟试题

《物流管理定量分析方法》模拟试题 一、单项选择题（每小题3分，共18分） 1. 若某物资的总供应量（ ）总需求量，可增设一个虚销地，其需求量取总供应量与总需求量的差额，并取各产地到该销地的单位运价为0，则可将该不平衡运输问题化为平衡运输问题。 (A) 等于 (B) 小于 (C) 大于 (D) 不超过 2. 某物资调运问题，在用最小元素法编制初始调运方案过程中，第一步安排了运输量后，其运输平衡表（单位：吨）与运价表（单位：百元/吨）如下表所示： 运输平衡表与运价表 第二步所选的最小元素为（ ）。 (A) 1 (B) 2 (C) 3 (D) 4 3．某物流公司有三种化学原料A 1，A 2，A 3。每斤原料A 1含B 1，B 2，B 3三种化学成分的含量分别为0.7斤、0.2斤和0.1斤；每斤原料A 2含B 1，B 2，B 3的含量分别为0.1斤、0.3斤和0.6斤；每斤原料A 3含B 1，B 2，B 3的含量分别为0.3斤、0.4斤和0.3斤。每斤原料A 1，A 2，A 3的成本分别为500元、300元和400元。今需要B 1成分至少100斤，B 2成分至少50斤，B 3成分至少80斤。为列出使总成本最小的线性规划模型，设原料A 1，A 2，A 3的用量分别为x 1斤、x 2斤和x 3斤，则化学成分B 2应满足的约束条件为（ ）。 (A) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3≥50 (B) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3≤50 (C) 0.2x 1＋0.3x 2＋0.4x 3＝50 (D) min S ＝500x 1＋300x 2＋400x 3 4. 设?? ????=??????-=721,7421x B x A ，并且A ＝B ，则x ＝（ ）。 (A) 4 (B) 3 (C) 2 (D) 1 5．设运输某物品的成本函数为C (q )＝q 2＋50q ＋2000，则运输量为100单位时的成本为（ ）。 (A) 17000 (B) 1700 (C) 170 (D) 250 6. 某产品的成本函数、收入函数、利润函数分别为C (q )，R (q )，L (q )，则下列等式成立的是（ ）。 (A) )0(d )()(0 C q q L q L q +'=? (B) )0(d )()(0C q q C q C q -'=? (C) ? '= q q q R q R 0 d )()( (D) )0(d )()(0 L q q L q L q -'= ? 二、填空题（每小题2分，共10分） 1. 设某平衡运输问题有4个产地和5个销地，则用最小元素法编制的初始调运方案中填数字的格子数为 。 2．某物资调运方案如下表所示： 运输平衡表与运价表

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)

荧光定量PCR实验指南一

荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因

为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。