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第5章 植物基因工程

第5章植物基因工程

我国科学工作者,用转基因技术,可以转变矮牵牛花的花色,使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。

1、目的基因分离和鉴定

2、植物表达载体的构建

3、繁殖扩增重组DNA

4、目的基因向植物细胞的转化

5、转基因植株的筛选和鉴定

(一)植物基因工程的基本路线

第一节植物基因工程基本技术

(二)外源基因导入植物的方法

方法简便,细胞毒性低,但转化效率低,需要设备,不易再生。

原生质体

电激法

适用多种植物、转化率低、转化费用高、不易获得再生植株愈伤组织、幼胚、细胞器、悬浮细胞基因枪转化法使用最广泛,主要用于双子叶植物,近年来在单子叶中也获得了

突破。

再生效率高,大多为单拷贝转移。

植物组织、幼胚、花粉细胞农杆菌介导法

特点

受体细胞

转化方法(三)植物表达载体——Ti质粒衍生的载体Ti质粒

形状及大小:环状DNA 分子, 分子量90~

150×106D, 其长度约200~250kb。类型:章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。

组成:üT-DNA区:决定肿瘤的形态和冠瘤碱的合成,两端25bp同向重复序列(左臂和右臂)。

ü毒性(vir) 区:位于T-DNA 左侧, 长约35kb,分virA~J 至少10个操纵子,基因的产物直接参与T-DNA加工和转移过程。ü结合转移区(con):调控Ti质粒在农杆菌之间的结合转移。ü

复制起始区(ori):调控Ti质粒的自我复制。

Ti质粒Ti质粒衍生的双元载体

植物表达载体pBI121强启动子:35S 抗性标记:Kan 融合表达:GUS

Ti 质粒转化植物细胞的机理:

①细菌对植物敏感细胞的识别和吸附并对信号物质的感受;

②Ti 质粒上的vir 基因被激活;

③T-DNA 切割和T-DNA 复合物形成; ④T-DNA 复合物由农杆菌进入植物细胞;

⑤T-DNA 整合到植物染色体上并进行表达。

(四)转基因植物的筛选与检测

u 通过报告基因进行检测

报告基因:编码易于检测的产物的基因,包括抗性基因(抗生素、抗除草剂)、酶基因(如gus)和发光基因(如gfp)等。

转基因植物中的报告基因:

磷酸化乙酰转移酶(PAT),使除草剂PPT的自由氨基乙酰化。Bar基因ppt r 莽草酸合成酶抑制剂。

epsps基因

草甘膦r

链霉素磷酸转移酶,适用于叶绿体转化。spt基因Stp r β-葡萄糖苷酶,分解底物gluc产生蓝色水解产物,可用于组织化学分析。gus基因潮霉素磷酸转移酶。

aphIV基因hyg r 新霉素磷酸转移酶,使卡那霉素、新霉素和G418等失活。Npt-Ⅱ基因neo r (kan r )荧光素酶。

luc基因

绿色荧光蛋白

gfp基因编码产物

基因型抗生素或除草剂

类型

u 分子生物学检测

1)PCR技术检测2) 分子杂交

Southern杂交:检测外源基因是否已经整合到植物基因组中。Northern 杂交:判定外源基因是否能转录。Western杂交:检测外源基因是否翻译。

u 生物学性状检测

根据外源基因的特性,对相应的生物学性状进行检测。如对基因植株进行抗虫性、抗旱性等的研究。

Pns11是一个细胞核定位蛋白

RDV S11编码的非结构蛋白Pns11定位在细胞核内,在细胞质中表达呈现点状分布。

A

C6A

C6A C3A

水稻矮缩缩病毒S9编码蛋白Pns9可能定位于内质网

转基因拟南芥幼苗、花器与果实的组织化学染色(五)提高外源基因表达水平的策略

p基因转入后不表达的现象,称为基因沉默

(gene silencing),产生的原因有:位置效应、

DNA甲基化、重复序列诱导、共抑制(co-

suppression )。

p提高外源基因表达水平的策略

l选择合适载体(启动子、终止子)

l选择合适转化方法

l使用信号肽

l消除甲基化影响

l使用植物偏爱的密码子

l使用MAR(基质结合区)序列

(一)农作物基因工程

ü提高抗性

ü性状控制

(二)植物生物反应器

第二节植物基因工程技术的应用提高农作物抗性

抗病性:

(1)抗病基因;

(2)抗病毒基因;

(3)病程相关蛋白类基因。

抗虫性

?毒蛋白基因,如苏云金芽孢杆菌(Bt) 毒蛋白基因等;

?蛋白酶抑制剂基因,如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cp TI)

等;

?淀粉酶抑制剂基因,如菜豆a2淀粉酶抑制剂基因等;

?昆虫特异性神经毒素基因,如蜘蛛毒素基因等。

The Freedom II squash has a

modified coat protein that

confer resistance to zucchini

yellows mosaic virus and

watermelon mosaic virus II.

Scientists are now trying to

develop crops with as many

as five virus resistance genes

Virus resistance gene

introduced

Papaya infected with the

papaya ringspot virus

转抗病毒基因植物转基因玉米提高对害虫的抗性

Corn hybrid with a Bt gene Corn hybrid susceptible to

European corn borer

转除草剂基因植物

抗自然灾害

(1)逆境诱导的植物蛋白激酶基因;(2)编码细胞渗透压调节物质基因;(3)超氧化物岐化酶(SOD)基因;(4)防止细胞蛋白质变性的基因。

抗除草剂

(1)草甘膦(2)草丁膦(3)2 ,4-D 1、延长存储期:多聚半乳糖醛酸酶基因;乙烯合成酶基因。

2、改善营养品质和技术性状:高赖氨酸基因;高分子量谷蛋白亚基(HMW) 基因。

3、代谢分配的调节:木质素生物合成酶基因AD、OMT

性状控制

Normal rice

Transgenic technology produced a type of rice that accumulates beta-carotene in rice grains. Once inside the body, beta-carotene is converted to vitamin A.

More than 120 million children in the world suffers from vitamin A deficiency. Golden Rice has the potential to help prevent the 1 to 2 million deaths each year caused by a deficiency in this vitamin.

转β胡萝卜素

的水稻

Golden Rice

转基因小麦提高产量

转以基因改善农作物性状

(二)植物生物反应器

植物生物反应器是指通过基因工程途径,以农作物作为“化学工厂”,通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。1、可食用植物疫苗:食用含有抗原的新鲜水果,使食用者肠道免疫系统激发对病原体的抗病能力,如乙肝、艾滋病等。

2、利用植物生产抗体:利用植物合成细菌(突变链球菌,引起龋齿)抗体。

3、植物营养品:水稻中过量表达维生素A霍植物甾醇类,可减少人体内的胆固醇。

世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草,1983年得以培植出来。

番茄中表达人胰岛素

林芝和烟草中表达血红蛋白

1994年,美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后,我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄,以满足人们的需求。

甜椒在栽培的过程中,容易受病毒的感染。我国科学工作者,采用转基因技术,培育出抗病毒的甜椒。

油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40%左右。通过转基因技术,培育出来的油菜籽,可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。

从植物体中分离出合成赖氨酸的基因,把这基因转入小麦植株中,培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉,更适合用来烤面包,而且面粉中赖氨酸含量高,这种面包的营养价值高。

玉米是主要粮食之一,又可以提炼油脂,也可以用作食品和工业的原料以及作饲料,浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米,品质更好,产量更高。

(一)安全性的最大威胁——标记基因

编码蛋白及降解物是否有毒性?编码蛋白及降解物是否有过敏性?编码蛋白对宿主代谢的影响?

抗生素标记基因是否会水平转移到肠道微生物或上皮细胞中?抗生素剂量失效?

消除办法:

无标记基因

更安全的标记基因

转基因后切除标记基因

第三节转基因植物的安全性

(二)安全性评价

环境安全性生存竞争

生殖隔离距离

与近源野生种的可交配性对非靶生物的影响

病毒异源重组或异源包装食品安全性过敏

标记基因的潜在风险

对人及动物健康的影响

动植物产品中的外源基因在肠道微生物或上皮细胞中的表达目的基因表达之外的改变

练习题:

1、名词解释:Ti质粒、T-DNA、双元载体系统、报告基因

2、回答植物基因工程技术实施的基本策略。

3、简述农杆菌介导的植物转基因技术的基本原理。

4、植物转基因中用到的报告基因有哪些?

5、什么是基因沉默,导致转基因发生失活的原因有哪些?

6、植物基因工程技术的应用有哪些方面。

7、谈谈你对转基因植物的安全性的认识。

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