基因 英文
The Study of MHCⅡ DQA exon 2 amplification and sequence analysis in the Muntiacus crinifrons
Abstract: The major histocompatibility complex (MHC) has gained the more and more theoretical evidences of the relevance in pathogen resistance. Particularly the DQ, DR genes, which the level of polymorphism indicated the potential evolutionary ability to some extent. As a genetic marker of functional gene, it used a lot in non-model species in natural populations. The distribution of the wild populations of Black Muntjac (Muntiacus crinifrons), an endangered species endemic to China, is very narrow and its number is decreasing. In this study, we amplified partial MHC class II DQA exon 2 sequences from M. crinifrons. As a result, three alleles were detected in 51 investigated samples, which differ from each other by sever to 20 nucleotide substitutions (four to 14 amino acid substitutions). No a single individual obtained more than two alleles, which suggests these sequences may be from a single locus. A significantly higher rate of non-synonymouse substitutions (dN=0．156±0.059) than synonymous substitutions (dS=0.012±0.011) in antigen-binding site (ABS) codons indicated positive selection in the DQA locus.
Key words: Muntiacus crinifrons； Cervidae；MHC ；DQA；sequence analysis
黑麂Ⅱ类MHC DQA基因第二外显子扩增及序列分析
摘要：主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因在机体对病原体免疫方面的联系已经得到越来越多的理论支持，特别是其Ⅱ类的DQ, DR基因，其多态性水平在一定程度上衡量着种群的进化潜力。作为一种功能基因遗传标记，其在非模式物种自然种群中的运用越来越多。黑麂(Muntiacus crinifrons)为中国特有的濒危鹿科动物，其野生种群分布范围和数量正逐步缩小。本文扩增了51个黑麂样品的MHC-DQA 第二外显子部分序列，结果得到3个等位基因，彼此之间的核苷酸差异从7到20个（氨基酸差异从4到14个）。没有一个个体获得两个以上等位基因，这说明这些序列可能来自单座位。抗原结合位点(antigen-binding site ABS）上的非同义替代（dN=0.156±0.059）显著大于其同义替代率(dS=0.012±0.011)，这暗示着DQA基因曾遭受正选择作用。
关键词：黑麂；鹿科；MHC； DQA；序列分析
1. The guide said:
Black suede (Muntiacus crinifrons), Artiodactyla (Artiodactyla) Cervidae (Cervidae) suede (Muntiacus), for our country unique animals, is a typical subtropical mountain forest animals. Is listed as a national level to protect animals in China, the convention on international trade in endangered species of wild fauna and flora species (CITES) and the international union of conservation of nature and natural resources (IUCN) list was listed in the appendix Ⅰrespectively and dangerous level (VU), has been recognized as the world one of the most rare cervid family. Black suede is only distributed in south anhui, zhejiang and the border of jiangxi and fujian local mountains, wild population is rare (cheng and Lin, 1987). Use neutral molecular markers on the species of wild three population genetic structure analysis found that, historically, black muntjac species has experienced significant bottlenecks, the local population and huangshan, and there have been significant genetic differentiation between populations in western, the gene flow between populations of blocked (Wu et al., 2006, 2007). Hefei wildlife park of black suede captive populations began in 1987 and 1989 under the condition of captive breeding success,
populations of most nearly 50 head from birth to other regions of the output of the individual (including), genetic analysis results show that the population genetic diversity was far below the wild population, build a group of individuals there are considerable differences in their genetic contribution to future generations, allele frequency severe deviation (Wu and Fang, 2005; Ni et al., 2009). The captive populations affected by a variety of disease in recent years, the number dropped significantly, there is an obvious sign of recession.
Major histocompatibility complex (major histocompatibility complex, MHC) are closely related to immune responses in vertebrate kind of polygene family (Klein, 1986). MHC class Ⅱmolecules responsible for monitoring the extracellular environment, mainly to the CD + 4 T cell on exogenous antigen (Germain and Margulies, 1993). Especially among which from the first double son encoding antigen binding site (ABS), often because of its direct participation in present antigen and was given the choice of a certain advantage to show high levels of polymorphism (Racioppi et al., 1991; Apaniuset al. 1997; Hedrick and Kim, 2000; Hughes and Yeager, 1998). Used to think that, the higher the MHC gene polymorphism, the body against pathogens and parasitic infection ability is stronger,
therefore, the height of the MHC gene polymorphisms, gives the evolution of the vertebrates cope with complex internal and external environment potential (Potts and Slev 1995). Compared with neutral marker, protect the geneticist at the research results of MHC more attention, especially its populations may be related to individual fitness, closely related to save energy, and other important biological properties, it is only through study the genetic variation can truly understanding of the role of natural selection adaptive evolution process of the target species (Hedrick, 2001). This does not mean that the MHC genes can replace neutral tags, but more and more scholars think MHC genes is the best candidate so far in this paper, the vertebrate adaptive evolutionary tag (Sommer, 2005).
At present, the study of MHC and mostly concentrated in common with DRB gene polymorphism, the study of the DQA is relatively small, and mostly on model animal or high economic effect of the species. There is more thorough research is the DQA cattle and sheep, were detected three cattle DQA DQA seat seat and two sheep, and has high polymorphism (Andersson and Rask, 1988; Scott et al., 1991). And about black muntjac MHC even suede subfamily MHC report all zeros, due to assess the level of population genetic diversity of species protection
strategy is of great importance.
This paper, by using PCR - SSCP, cloning and sequencing technology, analyzes the wild and captive populations of a total of 51 samples of black suede MHC class Ⅱ DQA show part of the sequence, the first double at the same time also hope to study the evolution of the MHC mechanism provides information from suede subfamilies.
2. Materials and methods
2.1 the experimental materials
In this paper, used to detect the black suede samples, a total of 51, were collected from southern anhui mountain and west zhejiang (39), 12 samples taken from the hefei wildlife park in captivity, including the skin, blood and muscle samples.
2.2 genomic DNA extraction
Using the phenol - chloroform method "(Sambrook et al., 2002), from the skin of black muntjac, blood and muscle samples extracted genomic DNA.
At present, the study of MHC and mostly concentrated in common with DRB gene polymorphism, the study of the DQA is relatively small, and mostly on model animal or high economic effect of the species. There is more thorough research is the DQA cattle
and sheep, were detected three cattle DQA DQA seat seat and two sheep, and has high polymorphism (Andersson and Rask, 1988; Scott et al., 1991). And about black muntjac MHC even suede subfamily MHC report all zeros, due to assess the level of population genetic diversity of species protection strategy is of great importance.
2.3 primer design and PCR amplification
Two pairs from Ballingall et al., 1997, two pairs of design. All primer information see Table 1.
Table 1. Primers tested in this study
引物
名
引物序列（5’→3’）引物来源
QA005 ATTGTGGC(T,G)GACCAC(G,A)T TGGC Ballingall et al., 1997
QA006 CACTTACCATTGATAACAGG Ballingall et
al.,1997
QA007 CATACTGTTGGTAGCAGCA Ballingall et
al., 1997
QA010 GAGACTTGGAAAACACAGTC Ballingall et
al.,1997 DQAF1 AGGTGGACACTTACCGTTG 自行设计
(Ta=56℃)
DQAR1 TTGGCTCCTATGGCACAG 自行设计
DQAF2 CGTTGATAACAGGGGTAAAG 自行设计
(Ta=55℃)
2.3.1 PCR amplification
First use of primers QA005 / QA010 (Ta = 60 ℃) amplification DQA1 and DQA2 Shared fragments, amplification products as template, then use primer for QA005 / QA007 (Ta = 55 ℃) and QA005 / QA006 (Ta = 55 ℃) amplification DQA1 and DQA2 respectively. Reaction volume 40 mu l, which contains 50-100 ng template DNA, 0.3 mu M primers, MgCl2 2 mM, 0.2 mM dNTP, 10 x Exbuffer and 1.5 U ExTaq DNA polymerase. PCR reaction conditions: 95 ℃ modified 5 min, 30 cycle (94 ℃ modified 30 s, 30 s, appropriate temperature annealing 72 ℃ extended 50 s), all the end of the cycle, extend 72 ℃ for another 5 min, 8 ℃.
2.3.2 PCR reaction system
Template DNA 50-100 ng
Primer 0.3 microns
MgCl2 2 mM
DNTPs each 0.2 mM
10 x Exbuffer 4 mu l
ExTaq 1.5 U
40 mu l DdH2O added to the total system
2.3.3 the PCR reaction conditions
95 ℃ for 5 min
94 ℃ for 30 s
60 ℃ for 30 s 30 cycle
72 ℃ 50 s
72 ℃ for 5 min,
8 ℃ save
The first additional 2.4 black muntjac DQA genes show SSCP parting
Take steps PCR amplification product 2.3 2-3 mu l, and a moderate amount of sample buffer ((98% 98% formamide, 10 mM EDTA, bromophenol blue, xylene cyanol) - 0.025%) mixed, 95 ℃degeneration 3 min transpose the ice cooling, adding 8% ((37.5:1)) of modified polyacrylamide gel (containing 10% glycerine), at 8 ℃, 300 v voltage, in 0.5 x TBE electrophoresis 10 to 15 h (Bio - Rad, DcodeTM Universal Mutation Detection System). After electrophoresis, the silver nitrate staining with Nikon D80 single camera (Nikon) digital camera taking pictures under natural light. Will represent different SSCP band type stripe tapping recycling.
Against 2.4.1 polyacrylamide gel preparation
First makes up 40% of acrylamide/methylene acrylamide (37.5:1), 4 ℃ after filtering
Acrylamide is 38.93 g
Methylene acrylamide 1.07 g
DH2O to 100.0 ml
Then according to the following formula makes up 8% of polyacrylamide gel:
40% Acr - Bis (37.5 :1) 8 ml
10 x TBE 2 ml
TEMED 40 mu l
400 mu l 10% Ammonium persulfate
dH2O to 40 ml
2.4.2 electrophoresis
Take the PCR purification product 5 mu L mixes with isometric point sample buffer, on the bio - rad DNA amplification in 95 ℃degeneration after 5 min in the ice, which in turn with 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Among them, the electrophoresis parameters of 15 w, 11 hour, electrophoresis using Beijing mean electrophoresis apparatus.
2.4.3 silver stain
1. The preparation process of silver stain the fixed liquid, liquid silver dyeing and color.
Fixed liquid: glacial acetic acid, 100 ml, 900 ml dH2O;
1 g dyeing liquid silver: silver nitrate, 1.5 ml, formaldehyde dH2O to 1000 ml;
Developer: 30 g sodium carbonate, sodium thiosulfate 10 mg/ml * 200 mu l, dH2O to 1000 ml.
2. With a gel is a small glass plate fixed in the fixed liquid 20 min.
3. The fixed liquid, the steam bath 3 times, 2 minutes at a time.
4. With dyeing liquid for 30 min.
5. Abandon the dyeing liquid, the double steam for a quick rinse water 10-20 s.
6. Put rubber sheet in developer (3% sodium carbonate to join before with formaldehyde and sodium thiosulfate, make its final concentration formaldehyde 500 mu l/l respectively, sodium thiosulfate 2 ㎎/ l), under low temperature (4 C) DHS enhancement. When banding just show in developer once.
7. Developer, with fixed liquid 5 min.
8. Finally with double evaporate water to clean 2 min. Dry.
9. Take pictures.
Heavy 2.4.4 PCR amplification
A knife to cut the polyacrylamide gel after allele fragments, DNA recovery kit with polyacrylamide gel recovery after
purification. Take 5 mu L recycled products as a template, with reference to the front of the PCR reaction system and the application of PCR amplification, single-stranded DNA into double-stranded DNA, and agarose tapping purification of PCR products. Set aside.
2.4.5 screening positive clones
Heavy PCR amplification products by DNA agarose gel recovery kits (treasure biological engineering co., LTD), purified and pMD18 -t cloning vector (treasure biological engineering company) connection, and then transformed into e. coli JM109 strains, 37 ℃ training for the night. Pick a white monoclonal colony, 37 ℃ culture, PCR detection.
2.3.4.6 DNA sequencing
Positive clones take confirmation for the bacteria liquid, add 200 mu l LB culture medium, 37 ℃ 200 RPM shaking culture 1-2 h, and then sent to nanjing sequencing genscript biotechnology co., LTD.
2.5 the data statistical analysis
By using Clustal X software (Thompson et al., 1997) for sequence alignment, application of MEGA 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version) (Tamura et al., 2007) will be translated into the amino acid sequence, nucleic acid sequence
and nucleic acid site and amino acid site mutation detection. Using the BLAST search engine from NCBI GenBank data homologous sequences. According to Brown (1993) and (1996) such as Paliakasis method that antigen binding site of amino acid sequence, using MEGA 4.0 software based on Nei and Gojobori (1986), the method of calculate antigen binding site (ABS) with the antigen binding site of synonymous substitution rate (synonymous substitution rate, dS) and non synonymous substitution rate (non - synonymous substitution rate, dN), and use the Jukes, Cantor and standard calibration (1969). Using PAML4.0 b (Yang, 1997) package of CODEML program to detect the selection pressure of amino acid level. The software according to select the parameters of the omega (omega = dN/dS), the size of the target sequence whether subjected to selection pressures, if omega significantly greater than 1 indicates there is choice. Studies have shown that these two models restructuring interference ability stronger than other model (Anisimova et al., 2003), therefore, in this paper, we compare M7 and M8 model calculation results of the data set. First, calculate the best likelihood values of each model, because the best likelihood value differences between the 2 times Δ L (2) basic follow the chi-square distribution, then according to the
chi-square test, the likelihood ratio test (likelihood thewire test, LRT) (Yang and Swanson, 2000) in this paper, the data set which is more suitable for model, if the result shows that the M8 is better than the M7, showed significant positive selection effect. In addition, this article USES CODEML experience bayesian path in software (empirical Bayes method, BEB) accurately detect what site experienced is choosing a role (Nielsen andYang, 1998; Wong et al., 2004).
Using the method of the adjacency MEGA4.0 (Neighbour - joining, NJ) based on Kimura double parameter model to construct the DQA exon 2 allele system. Including system analysis in this paper, the isolated black muntjac DQA three alleles, and downloaded from GenBank moose (Alces Alces) DQA (AF458952 AF458953), sika deer DQA1 (AY679433 ~ AY679444) and DQA2 (AY679445 ~ AY679460), bovine DQA1 (Z48190 Z48191, Z48193 - Z48196 D50454) and DQA2 (U80866 U80862, U80861, Y07820, Z79515, Z79516, Z79518), sheep DQA1 (Z28418, AY230210 M33304, AY230209, AF317617, AY230208) and DQA2 (AY312375 - AY312379 AY312397) and pig DQA (EU195154 EU195193, EU195194 EU195198 - EU195200), in cotton rats (Sigmodon hispidus) DQA (AF155914) sequence as the outgroup.
3. The results
3.1 primer amplification and SSCP
Using bovine DQA loci combination primers to nested black muntjac genome DNA amplification, the result found with QA005 and QA010 amplification products as templates, primers QA005 and QA006 won a single target product, and primers QA005 and dispersion QA007 amplification products, no obvious target band. For QA005 after cloning sequencing and QA007 amplification products, designed two pairs of black suede DQA site specific primers (DQAF1 / R1 and DQAF2 / R1), amplification product size 254 bp and 240 bp respectively. Use this two pairs of primers for PCR amplification, 51 black suede samples results are only 36 samples are the product of the stability of the single, and no obvious target of 14 other samples stripe. Because the two pairs of primers only exists in the amplification product length difference, and no differences in other amplification efficiency, so only the amplification in the follow-up work length of 254 bp DQAF1 / R1 is analyzed. Using the product of the primer PCR SSCP technology for genotyping, will represent different SSCP bands for cloning sequencing, the results obtained from 36 in black suede samples of 3 different sequence (GenBank accession number: GQ870429 - GQ870431), respectively named Mucr DQA * 01, Mucr DQA * * 03 02, Mucr - DQA (figure 1). Don't have a sample with two or more sequences
at the same time, the vast majority of the samples are homozygous, just two individuals at the same time with the two sequences. In this paper, all the individual sequences are different or the same clone of at least two independent PCR
product validation. Received three DQA sequence, Mucr - DQA01
highest frequency (19/36), followed by Mucr - DQA02 (16/36),
and Mucr - DQA03 only be detected in a sample.
2 3 4 5 6 7 8
0 0 0 0 0 0 0
Mucr-DQA*0101 ALYQSHGPSGQYTQEFDGDELFYVDLGKKETVWRLPMFSQFAGFDPQRALSNIATAKHN LDILTKRSNFTPVI
Mucr-DQA*0102
E....Q.........................................G...E....... ..............
Mucr-DQA*0201
DF....R.T........................W.............N...E.T.L...
..VM..C.....AV
+ + + + +++ + +++
+ + + ++ ++ +
Figure 1 black muntjac MHC class Ⅱ DQA genes show children the first double arrange part amino acid sequence alignment, sequence Numbers above the reference person DQ alpha chain determine amino acid sites of the serial number. Dots representation and DQA01 sequences of the same amino acids, plus said reference person DR1 (Brown et al, 1993) and DQ alpha (Paliakasis et al, 1996) and determine the ABS site.
Fig.1 Alignment of partial MHC class II DQA exon 2 amino acid sequences of M. crinifrons. The numbers above the aligned sequences refers to the human DQα chain. A dot indicates identical amino acids and a cross indicates putative sites involved in peptide binding as proposed for the human DRA (Brown et al, 1993) and human DQα molecules (Paliakasis et al, 1996).
3.2 sequence variation and selection of balance test
This paper expanded the black suede DQA after the first double show subsequence to remove primer 219 bp long (retained downstream primers of two bases), via Mega4.0 software translated into containing 73 amino acid sequence of polypeptide, found no insert (missing) or termination codon (figure 1). After homologous comparison with cattle, sheep and sika deer DQA2 gene of the first double show high homology. Mutation loci were detected in 21 nucleotides (9.6%) and 15
amino acid mutation loci (20.5%). Sequence base differences
between the range of 7 to 20, amino acid variation range of 4
to 14. DN value can be seen from table 2, ABS area significantly
greater than the dS, Z test P value is 0.009, rather than ABS
area, although non synonymous substitution is greater than the synonymous substitution, but Z test did not reach significant
level. CODEML M7 and M8 in program model of testing data, this
paper found the model M8 than M7 is more appropriate for this
data set, indicates that the black suede DQA genes had
significantly positive selection effect (P = 0.024) (table 3). In order to more accurate detection is choosing sites, to
increase the use of empirical bayes method, four amino acid
sites were detected by are choosing 14,61,65,69 (locus),
including 14, 21 and 65 loci in ABS.
Table 2 Rates (±standard error) of non-synonymous (dN) and synonymous (dS) substitutions for ABS and non-ABS. P values are
the probability that dN and dS are different using a Z test.
非同义替换dN 同义替换
dS
dN/
dS
P值
ABS 0.166±
0.075 0．011±
0.012
15.
10
0.0
24
Non-AB0.061±0.029± 2.10.3
S 0.022 0.020 0 14
表3 模型M7和M8的似然率检验正选择的结果比较及估计的相关参数
Table3 Likelihood ratio test (LRT) comparing the models M7–M8 for evidence of positive selection and model parameters estimates.
模
型Model
似然值LnL 估计参数Estimate parameters （LRT 值）2△L M7 -404.450 p=4.24381 q=0.00500 9.644 M8 -399.628 p0=0.63378
p=0.00500 q=3.68622 (p1=0.36622) w=11.43774
注：自由度df=2，p=0.01、χ2值为9.21。
Note: The χ2 value under the significant level of p=0.01 (df=2) is 9.21.
4. Some
Ballingall etc. (1997) using the nested primers amplification out cattle DQA1 and DQA2 two loci, the primer in sika deer are successful spread out DQA two loci (hwa wu, 2004), however, using the same expansion strategy, this article only gain a DQA sites, according to the homologous comparison, and cattle, sheep, deer DQA2 sequence has a high degree of homology. Based
on black muntjac DQA sequence design of two pairs of specific primers, of all 51 samples of 36 individuals has good expansion as a result, but another 15 individuals without PCR products, this kind of phenomenon implies that the primer amorph may exist in the black suede, or the primer amplification DQA loci in part of the black suede individuals lack. As described in the preface, by virtue of the size of the DQA loci exist in cattle and sheep in different individual variation (Ballingall et al., 1997; Hickford et al., 2000), sheep 11-18% of the MHC haploid type lack DQA1 loci (Hickford et al. 2000). Bryja etc. (2006) with several rats DQA gene polymorphism in research found the same phenomenon. Black suede part of this article, therefore, the individual DQA sites appear invalid amplification phenomenon is likely to DQA site number and other animals in similar variation between individuals, the black suede some individuals may lack the site, it still needs further research to provide more evidence.
Use primer design in this paper, from 36 black muntjac individuals of the communist party of China by 3 DQ A sequence of exon 2, all individuals are not more than two sequences, and as A result, the primer amplification products on behalf of the black suede DQA genes in A single site. After translated into
基因治疗
基因治疗 基因治疗的发展 基因治疗的设想始于1967年，1973年一名美国研究人员和几位医生在德国进行了世界上第一例基因治疗试验，接受治疗的患者为两姐妹，研究人员将一种名为肖普氏乳头瘤的病毒(这种病毒携带有一种酶基因可能会使人本身的酶分泌正常)注射到患者体内,结果是既没有产生任何疗效,也没有出现不良反应。1980年随着外源基因导入小鼠实验的成功，美国的另一名医生对两名地中海患者进行了第二例基因治疗，结果同样没有取得成功。 20世纪80年代初，美国科学家Anderson基因治疗的前景和发展方向。此后的几年之中，一大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移实验和基因标记实验，为以后基因治疗的临床应用积累了许多经验，也奠定了临床应用的理论基础。1990年，美国国立卫生研究院的Blaste R.M.和Anderson W.F.用腺苷酸脱氨酶（ADA）基因导入一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁患者的淋巴细胞中，治疗取得了成功，转入这种可以产生腺苷酸脱氨酶能力的淋巴细胞后，患者症状得到明显缓解。第二例接收同样方法治疗的的SCID患者是一名九岁的小女孩，治疗也同样取得成功。1991年，美国科学家Rosenberg的研究小组对50名黑色素瘤晚期患者进行了基因治疗，将外源性肿瘤坏死因子转入肿瘤中的浸润淋巴细胞,结果这种转化的TIL能集中在肿瘤所在部位并杀伤肿瘤细胞,治疗也取得了一定效果。此后世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮，1991年美国国立卫生研究院连续批准了包括肿瘤坏死因子基因导入肿瘤细胞在内的11项人类基因治疗的实验方案。2001年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，成为基因治疗开展近十年来科学家取得的最大成功。目前基因治疗主要集中在美国，其次是欧洲。基因治疗的适用范围也越来越广，其中，癌症居基因治疗首位，其次是单基因疾病，心血管病，传染性疾病和其他疾病。 我国的基因治疗的研究工作开展的也相对较早，且获得了很好的疗效。1991年7月，中国复旦大学与第二军医大学长海医院合作，从一批自愿接受基因治疗的凝血因子IX基因缺陷血友病B患者中选择了两兄弟开始进行基因治疗临床研究。研究人员将凝血因子IX基因导入患者皮肤成纤维细胞，再将转化的皮肤成纤维细胞回输到患者体内。经过几次转化细
基因治疗的概念
基因治疗的概念 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预。细胞可以体外修饰，随后再注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞内发生遗传学改变。这种遗传操纵的目的可能会预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病。 基因治疗的类型 根据目的 基因治疗：治疗或预防疾病 基因增强：增强人的性状和能力 根据干预对象 体细胞：基因转入体细胞内 生殖细胞：基因转入生殖细胞或早期胚胎。 体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗、 体细胞基因增强、生殖细胞基因增强 治疗简要过程 1. 体外法(ex vivo)：患者细胞经体外遗传处理后，再移入患者体内进行治疗。 2. 体内法(in vivo)：把基因通过载体（如病毒）直接转入患者病患部位，进行治疗。 3. 基因治疗使用的载体 （1）病毒 1.1 反转录病毒：RNA病毒，其基因可整入受体基因组 1.2 腺病毒：双链DNA病毒，形成核外DNA，不遗传，需多次施用 1.3 腺相关病毒：单链DNA病毒，可近100%插入19号染色体的特殊位点。感染人和灵长类，不致病，宿主免疫原性小。携带DNA小，难以制造 1.4 病毒壳蛋白形成的假病毒：“魔法子弹” （2）非病毒载体：易于制造、低免疫，但感染和表达少 2.1 裸DNA ：表达效率低；电转移和基因枪转移 2.2 多核苷酸：合成的小分子核酸，使体内基因的表达失活 2.3 脂质体和多聚体：用脂质体和多聚体分子包裹DNA，使DNA被细胞吞入，提高转移效率 （3）复合方法：如脂质体加病毒 （4 ）多晶体：含有核酸（DNA、RNA）的多晶体可以增强基因的转移效率、毒性小 用腺病毒进行基因治疗 Fragile-X 的基因治疗 癌症的基因治疗 基因在癌细胞中表达，引起癌细胞凋亡，从而达到治杀死癌细胞，治愈癌症的目的。 今又生Ad-p53腺病毒注射液 小分子核酸的抑制基因表达和治疗的机制 从DNA到蛋白质，小分子核酸进入细胞后剪切mRNA使基因不能翻译
2020年细胞和基因治疗CDMO行业研究报告
2020年细胞和基因治疗CDMO行业研究报告 一、细胞和基因治疗：创新疗法的新方向 （一）细胞治疗：CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型，例如肌肉，骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能，疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下，这种缺失是不可逆的，也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内，以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代，而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月，法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖，标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后，细胞治疗迅速兴起，在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验，被Science杂志评为2013 年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人体内，以达到
修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得，致癌风险也很低，同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题，被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗，主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增，同时加强其靶向性和杀伤力，最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括NK细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗，根据所使用的的免疫细胞不同，分为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞（NK）疗法、 DC-T 细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后
2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告
2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告 1 细胞和基因治疗：创新疗法的新方向 （一）细胞治疗：CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型，例如肌肉，骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能，疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下，这种缺失是不可逆的，也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内，以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代，而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月，法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖，标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后，细胞治疗迅速兴起，在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验，被Science杂志评为2013年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。 干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得，致癌风险也很低，同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题，被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗，主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 干细胞的全能型可以被用于细胞治疗 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增，同时加强其靶向性和杀伤力，最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括NK细胞、T细胞、B 细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗，根据所使用的的免疫细胞不同，分为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞（NK）疗法、DC-T细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫治疗主要分为三大类：一种方法是利用从患者的肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），在实验室中扩大其数目，然后再注入患者体内；第二种方法是改造从患者身上收获的T细胞，使其表达肿瘤抗原特异性T细胞受体（TCR），以便T细胞可以识别和攻击表达这种抗原的肿瘤细胞；第三种方法与TCR类似，区别在于其在T 细胞上构建的是一个嵌合型抗体受体（CAR），从而让免疫T细胞不仅能够特异性地识别癌症细胞，同时可以激活T细胞杀死癌症细胞。 目前CAR-T是唯一被FDA批准的过继性免疫疗法。TIL和TCR治疗只能靶向和消除在特定情况下（当抗原与主要组织相容性复合物或MHC结合时）呈递其抗原的癌细胞。而CAR的主要优势在于，即使不通过MHC将抗原呈递到表面，
基因治疗的发展及其应用
基因治疗的发展及其应用 【摘要】基因治疗一种很有发展前途的高新技术。基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、心血管病、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，本文通过国内外相关文献的分析，从基因治疗(基因治疗的现状、肿瘤的基因治疗)、基因预防、基因治疗技术、基因治疗存在的问题和未来发展等进行综述。 【关键词】基因治疗;基因预防;基因治疗技术;现状;问题和未来发展 人类的疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关。近年来，基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段，在一定程度上取得了重大进展。 1 基因治疗 基因治疗(Genethrapy)是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的，通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。简而言之，基因治疗是指通过基因水平的操纵而达到治疗或预防疾病的疗法。 1.1 基因治疗的现状 生物医学的深入研究表明，人类的各种疾病都直接或间接与基因有关[1]。因此，可认为人类的一切疾病都是“基因病”。故人类疾病可分为三大类。一类是单基因病。这类疾病只需一个基因缺陷即可发生，如腺苷脱氨基酶(ADA)缺陷症。二是多基因病。此类疾病的病因大多比较复杂，不但涉及各个基因，往往还与环境因素(包括自然环境、社会环境、生活方式等)有关。基因缺陷和疾病表型都具有明显的多样性。Ⅰ型糖尿病、肿瘤、心血管疾病等皆属此类。三是获得性基因病。此乃病原微生物入侵所致，如艾滋病、乙型肝炎等。因此，理论上，人类所有的疾病都可采用基因治疗。 1.2 肿瘤的基因治疗 目前治疗癌症的基因疗法种类颇多，主要集中在免疫基因治疗、药物敏感性基因治疗、肿瘤抑制基因治疗治疗三个方面。 1.2.1 免疫基因治疗 常用方法有：①细胞因子基因治疗：将某些细胞因子基因如IL 2、IL 4、IL 6、B7 1，GM CSF等转染肿瘤细胞后，增强机体对肿瘤细胞的免疫反应。②肿瘤抗原基因免疫治疗：将某些肿瘤抗原基因如MHC基因等转染肿瘤细胞，增强肿瘤细胞免疫原性。②反义基因治疗：应用反义核酸在转录和翻译水平，通过碱基互补原则封闭某些异常基因的表达，反义核酸被称为信息药物[3]。④用抗体抑制癌基因的产物杀灭肿瘤细胞。
未来30年_基因治疗能否广泛应用_
科技日报/2008年/12月/24日/第004版 科技改变生活 未来30年,基因治疗能否广泛应用？ 实习生梁鑫刘飞 未来，当一个婴儿刚刚出生，人们就能预知他的将来可能会得什么病，这要归功于基因诊断和治疗。这个新技术的实现需要等待多少年？有专家预测，2030年生物医疗与基因改良竞赛将出现。请关注——未来30年，基因治疗能否广泛应用？ 编者按：就像我们30年前无法想象今天的生活一样，未来的30年，我们的生活又将变成什么样呢？最近美国《未来学家》杂志对未来世界的发展提出了预测：也许到了2030年，汽车时代将结束、每个人将拥有独一无二的IP地址、城市化程度将达到60%、生物医疗与基因改良竞赛将出现……未来30年的世界真是这样的吗？本版从今日起推出系列报道，与国内有关专家共话未来。 美国《未来学家》杂志近日对世界未来发展提出预测：像上个世纪的太空竞赛那样，2030年将出现生物医疗与基因改良竞赛。而IBM公司最新公布的“未来5年的5项创新”计划则指出：未来5年，你将拥有一张基于你的DNA基因图。医生为您预测健康风险、提出治疗建议，医药公司的“对人制药”都将成为可能。 医药研制真能实现个性化吗？未来30年，我们能否用基因去治病？ 基因治疗：个人的“医药工厂” 随着生命科学与技术的发展、人们对疾病的认识不断加深，越来越多的证据表明许多疾病与人体遗传基因的结构或功能改变有关。因而，人类开始从基因方面治疗疾病。 “简单地说，基因治疗是指在人体内开一个‘医药工厂’，将特定基因作为‘药物’输送到患者体内，用以治疗疾病的一种分子治疗技术。”上海复旦大学生命科学学院遗传学研究所卢大儒教授说。中国科学院北京基因组研究所中心实验室主任胡松年解释说：“通俗地说，基因治疗跟人们吃药原理相似。例如，一个人可能由于遗传因素或者是基因突变等原因，患上某种疾病。而利用基因治疗就可以对致病基因进行替换或补充，使基因恢复正常，从而预防或治疗人类疾病。基因治疗的实现需要依靠大量的人类基因组数据研究，并对其进行信息解析。” 卢大儒认为，基因治疗与常规治疗的区别在于：“一般常规治疗方法针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病根源异常的基因本身。因此，基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾病，譬如：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病等）。” 基因治疗可以实现有效的个性化治疗吗？胡松年说：“利用基因技术可以找到个体致病的靶点，针对不同的靶点采用不同的药物，从而达到真正精准的治疗，使疾病治疗向个体方向发展。” 据了解，IBM的研究人员正在开发一种系统，可以为医生提供相关的工具，帮助其预测艾滋病患者对防逆转录酶病毒疗法的反应，从而帮助医生针对任何艾滋病病毒的基因突变选择最好的药物或药物组合。“这是一种预测防逆转录酶病毒疗法对某一种特殊的艾滋病病毒治疗效果的创新方法，这种方法利用了滤过性病毒基因的数据，并整合了欧洲最大的艾滋病数据库的一些治疗反应数据。”IBM中国研究院院长李实恭表示。 基因治疗：将会提高治愈率 复旦大学生命科学学院遗传学研究所副教授朱焕章博士指出：“若要使基因治疗技术成为临床的一个常规治疗手段，乐观估计可能需要20—30年时间。” “在未来，利用基因治疗，人类疾病的治愈率将会提高，人们的身体素质会越来越好，人类
第二十三章 基因治疗——复习测试题
第二十三章基因治疗——复习测试题 （一）选择题 A型题 1. 全世界第一例基因治疗成功的疾病是 A. β地中海贫血 B. 血友病 C. 重症联合免疫缺陷症 D. 高胆固醇血症 E. 糖尿病 2. 理论上讲，基因治疗最理想的策略是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 3. 目前基因治疗所采用的方法中，最常用的是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 4. 利用反义核酸阻断基因异常表达的基因治疗方法是
A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 5. 将白细胞介素-2基因导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的表达水平，进行抗 肿瘤辅助治疗。这种基因治疗方法是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 6. 下列哪种方法不是目前基因治疗所采用的方法 A. 基因缺失 B. 基因置换 C. 基因替代 D. 基因失活 E. 免疫调节 7. 基因治疗的基本程序中不包括 A. 选择治疗基因 B. 选择载体 C. 选择靶细胞 D. 将载体直接注射体内 E. 将治疗基因导入靶细胞
8. 下列哪种方法不属于非病毒介导基因转移的物理方法 A. 电穿孔法 B. 脂质体法 C. DNA直接注射法 D. 显微注射法 E. 基因枪技术 9. 下列哪种方法属于非病毒介导基因转移的化学方法 A. 电穿孔法 B. 基因枪技术 C. DNA直接注射法 D. 显微注射 E. DEAE-葡聚糖法 10. 将外源治疗性基因导入哺乳动物细胞的方法不包括 A. 显微注射法 B. 电穿孔法 C. 脂质体法 D. CaCl2法 E. 病毒介导的基因转移 11. 目前在基因治疗的临床实施中，最常使用的载体是 A. 逆转录病毒载体 B. pBR322 C. λ噬菌体 D. pUC18 E. YAC
基因治疗
基因治疗 【摘要】研究发现，以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致可分为三类：单基因病、多基因病和获得性基因病。随着现代生物科学的发展，基因工程已在多个领域得到广泛应用。基因治疗是利用基因工程技术向有功能缺陷的人体细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其疾病缺陷，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，已经在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和艾滋病等疾病的治疗方面取得进展。它在一定程度上改变了人类疾病治疗的历史进程，被称为人类医疗史上的第四次革命。本文就基因治疗的载体以及基因治疗在肿瘤、艾滋病治疗方面取得的成就作出介绍，并就基因治疗的现状和问题对基因治疗的未来作出展望。 【关键词】基因治疗、载体、肿瘤、p53、IAP、艾滋病、CCR5 【正文】 一、基因治疗背景及概念 1990年9月，美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案，对一名患有重度联合免疫缺陷症（SCID）的女童进行基因治疗并获得成功，从而开创了医学的新纪元。自此以来，基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病，给人类的医疗事业带来革命性变革。 基因治疗（gene therapy）是指通过一定的方式，将正常的功能基因或有治疗作用的DNA 序列导入人体靶细胞去纠正基因突变或表达失误产生的基因功能缺陷，从而达到治疗或缓和人类遗传性疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。 基因治疗包括体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。但由于用生殖细胞进行治疗会产生伦理道德问题，因此通常采用体细胞作为靶细胞。其基本内容包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项。根据功能及作用方式，用于基因治疗的基因可分为三大类：（1）正常基因：可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的功能，常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病；（2）反义基因：通过其与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤mRNA互补，从而阻断其表达，常用于治疗病毒感染或肿瘤疾病；（3）自杀基因：能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化合物，用于治疗癌症。 二、基因治疗载体
当前基因治疗的现状和一般性技术路线
当前基因治疗的现状和一般性技术路线 基因治疗是当前医学领域研究的热点和前沿问题，本文论述了基因治疗的现状和一般性技术路线，供相关领域的研究人员和一般科学工作者参考。 标签：基因治疗CGT CAR-T 基因治疗目前作为一种非常规疗法，对于彻底治疗一些具有罕见破坏性遗传病，如交界性大疱性表皮松解症（junctional EB，JEB），和一些罕见的进行性神经肌肉功能损坏性遗传病，如Ι型脊髓性肌萎缩症（SMAΙ），和一些常见的延迟发病的神经功能退行性疾病，如帕金森病（Parkinson’s disease，PD），还有特定的病毒感染性疾病（如艾滋病，AIDS）和某些种类的恶性肿瘤（如急性淋巴白血病，ALL），都已经表现出了光明的前景。细胞和基因治疗领域（Cell and Gene Therapy，CGT）也是当今生物医学研究的重要的前沿和热点课题。 一、当前基因治疗的现状 当前基因治疗技术还不是很成熟的治疗方式，总体上还处在实验探索的阶段，还具有一定的风险性，其安全性和有效性还需要有很大的提高。往往是在没有很好的常规治疗方式前提下，对于一些危害性较大的疾病的一种试验性治疗。对于不同的疾病，其治疗效果往往相差很大；不同的机构对于同一种疾病，其治疗的过程也有较大差异。另外，基因治疗前期要投入大量人力、物力和时间，所面对的又是小范围内的患者，所以导致了其高昂的治疗费用。 二、当前基因治疗的一般性技术路线 当前基因治疗的主要有三种情况： 第一种，外源基因基因直接导入法 虽然说是基因直接导入，却不是直接将基因片段导入靶器官，因为直接导入，基因无法整合到靶细胞基因组里面，也就得不到表达。常用的方法就是将腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AA V）作为载体，然后导入靶器官。为了实现更高的目的蛋白质表达量和降低免疫毒性，往往还需要对载体进行改造，对目的基因进行密码子优化。根据《自然·通讯》报道，英法合作团队以狗为动物试验模型地开发出了较为成功的针对杜氏肌营养不良症（DMD）的基因疗法。DMD患者均为男性，患者在几岁时就会表现出肌无力症状，后来会恶化到无法自己行走，随后各种肌无力问题相继出现。一种抗肌萎缩蛋白有关的基因变异影响了抗肌萎缩蛋白的生成，进而影响肌肉的功能，导致了DMD。研究小组将抗肌萎缩蛋白基因进行了“压缩”，制作出功能性缩微版抗肌萎缩蛋白，并成功利用AA V载入12只DMD狗的体内。他们仅对这些狗进行注射治疗了一次，两年来这些狗的病情被成功抑制，不但临床症状稳定，肌肉功能还得到了很大程度的改善。
基因治疗的困难与前景
基因治疗的困难与前景 基因治疗是利用遗传学的原理治疗人类疾病的新手段，传统意义上的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞的基因发生基因重组，成为宿主细胞的一部分，从而可以稳定地遗传下去，并达到疾病治疗的目的。 目前，基因治疗主要的策略有4种。基因置换是利用正常的基因整个地替换突变基因，使突变基因永久地得到更正。基因修正是将突变基因的突变碱基序列用正常的序列加以纠正，而其余未突变的正常部分予以保留。相比前面两种策略，基因修饰则是间接利用目的基因的表达产物来改变宿主细胞的功能。而基因失活是利用反义技术来封闭某些基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。就技术方面而言，基因置换是最常用的策略之一。 基因治疗的发展和实施，要依赖于相关的技术和研究。其中最为重要的是人类基因组计划（HGP）和基因工程技术。美国国会于1990年批准了这一项目，并决定从1990年10月1日组织实施。计划耗资30亿美金，历时15年完成。这个浩大繁杂的计划成为了国际合作项目。美国，英国，日本，法国，德国和中国6个国家相继加入到计划中。HGP最终任务是要破译人体遗传物质DNA分子所携带的所有的遗传信息。HGP的实施，使人们对自身基因的认识达到一个质的飞跃。使人们进一步认识各种基因的生物学
功能以及与遗传病之间的关联，认识遗传病的分子缺陷的基础知识，为遗传病的基因治疗奠定基础。 HGP为基因治疗提供了基础知识，而真正的成功操作则要依赖基因工程技术。其中最重要的是基因治疗的载体构建。病毒载体是常用的载体之一。如：逆转录病毒载体，腺病毒载体等。而非病毒载体主要为显微注射法和电穿孔DNA转移法。 从1967年Nirenbery提出基因治疗实施。在1990年9月，美国FDA批准了人类首例基因治疗，针对于SCID的病例的基因治疗研究。同年9月14日第一位基因治疗的患者被成功回输带有矫正基因的T细胞。 基因治疗的基础研究虽然已经有近半个世纪，但基因治疗的成功案例并不多，所涉及的疾病领域也不广。其中的问题还存在很多。其中伦理问题和技术安全问题是最受关注的。 对生殖细胞的操作有不可预知性，有可能使后代产生缺陷。就目前的技术还不能做到避免外源基因的插入引起的生殖细胞的基因突变。这种改变是否符合我们后代的最佳利益。这就提出了一个新的伦理问题。我们是否有权这样做。我们对后代的责任是什么。基因治疗还面临着很大的社会风险，通过遗传筛查可以不让可能患遗传病的人出生，以此来预防遗传病。这会鼓励强迫性的优生规划和对
2020年中国细胞和基因疗法市场分析报告
2020年中国细胞和基因疗法市场分析报告 简介:全球范围内，细胞和基因疗法（CGT）不仅改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，同时也正在颠覆整个制药生态圈。至2019年底，全球共推出超过27种CGT产品，约990家公司从事下一代疗法研发和商业化，全球CGT市场规模有望在2025年超过119.6亿美元。 对于志在赢占中国细胞和基因疗法市场的国内外企业，必须采用独特的商业模式解决这些本土问题在强有力的政策支持下，中国已经成为全球CGT 发展的沃土，2017年至2019 年期间共有 1,000 多项临床试验已经开展或正在进行，中国政府授予数千项相关专利，位居全球第二。45 家本土企业以及四家合资公司引领中国CGT 生物技术行业蓬勃发展，并拥有获批的CGT 新药临床试验申请（IND）。 尽管CGT行业繁荣发展，但外商投资监管、报销时间的不确定性、技术和知识产权本土化要求、医疗服务机构的能力差异等中国CGT生态圈的多个环节，均为CGT产品的顺利商业化带来重大挑战。对于志在赢占中国细胞和基因疗法市场的国内外企业，必须采用独特的商业模式解决这些本土问题，并且需要围绕市场准入、监管、产品组合与知识产权、以及商业化能力建立卓越发展框架，制定相应战略并衡量成效。此外，这些企业还应考虑如
何有效获取日益丰富的本土创新技术，培养专业能力，依托生态圈合作在全球开发此类知识产权。 本文将探究影响中国 CGT 行业的关键因素和主要趋势，助力投资者、企业和研究人员塑造不断创新且可持续发展的中国CGT行业，并且从中受益。 一、应对新冠疫情危机 随着全球新冠疫情危机继续蔓延，并将持续数月或更长时间，预计将为CGT行业带来如下影响： CGT基础生物医学研究相关的资金支持会继续增加。CGT不仅可能治疗甚至治愈非传染性的疑难杂症，例如遗传疾病或晚期肿瘤，也有可能通过恢复人体的自然免疫力防治新型传染病。例如，一家致力于为遭受威胁生命的病毒性疾病患者开发细胞疗法的波士顿公司AlloVir近期宣布，和美国贝勒医学院合作开发针对新冠病毒的异体T 细胞疗法。 在中国推动CGT产品商业化的企业将面临更多不确定性。正在开展或计划中的临床研究可能会被中断，与国家药品审评中心的沟通和监管审批或将推迟，涉及CGT生产原材料进出口的供应链可能受到影响，而且市场准入相关事宜也将延期。 企业需要重新调整其产品发布时间安排，基于对监管审批流程、供应链应对能力和目标医院在降低新冠病毒影
基因工程之基因治疗
基因治疗 摘要： 生物技术在生命科学领域扮演者重要的角色，基因治疗在治疗方面，将新的遗传物质转移到某个个体的体细胞内使其获得治疗效果；在基因工程方面，将正常的有功能的基因置换或增补缺陷基因。近些年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。 关键词：基因工程基因治疗基因 一、基因治疗的历史 随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据证明，多种疾病与基因的结构或功能改变有关，因而萌生了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。 早在1968年，美国科学家发表了“改变基因缺损：医疗美好前景”的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。1989年美国批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案。1990年美国NIH的Frenuch Anderson博士开始了世界上第一个基因治疗临床试验，用腺苷酸脱氨酶基因治疗了一位ADA基因缺陷导致的严重免疫缺损的四岁女孩，并获得成功[1]。 1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。2000年，法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，取得了基因治疗开展近十年最大的成功[2]。 2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑[3]。迄今报道已有数千例基因治疗患者，病种主要是恶性肿瘤、艾滋病、血友病B、病毒性肝炎等等。 二、基因治疗的概念 基因治疗是指向有功能缺陷的细胞补充相应的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。 广义的说，基因治疗就是应用基因或基因产物治疗疾病的一种方法。狭义的说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，治疗疾病的一种手段。
基因治疗的研究现状以及应用前景分析
基因治疗的研究现状以及应用前景分析 摘要： 基因治疗是一种通过基因水平的操作而达到治疗或预防的高新技 术。可治疗包括遗传性疾病、癌症、感染性疾病、心血管疾病和自身 免疫性疾病在内的多种疾病。近几年来基因治疗在全球范围内虽然取 得了快速发展，但也遇到了很多技术、伦理以及法律问题。未来基因 治疗的主要目 标是在法律和伦理要求范围内，开发更加安全高效的基因导入系统， 更好的服务于人类。本文主要论述了基因治疗的研究现状，并在此基 础上分析了其应用前景。 关键词：基因治疗，研究现状，应用前景 Abstract： ?Gene therapy is a new technology by which people can cute and prevent many diseases at the level of genes, such as,genetic disease,infectional disease,cardiovascular disease and autoimmune disease.At the past years , gene therapy has been developed all around the world , however , it has also come across some probloms , including technology ,laws and ethics. At the future , the main aim of gene therapy is to develop more safe and efficient gene delivery system within the limits of laws and ethics .The research status and application prospect of gene therapy are discussed in this paper.
基因治疗案例
基因治疗的临床案例及研究进展 视网膜疾病：[2014.1]，英国牛津大学RobertMacLaren教授领导的专家利用基因治疗的方法在6名无脉络膜患者的视网膜上通过重建有缺陷的基因使患者重见光明，在英国医学界引
起了轰动。该项研究日前发表于《柳叶刀》。 肺癌：[2014]，中国医学科学院肿瘤医院联合国内肺癌领域等专家已于今年制定出“中国EGFR突变和ALK融合基因阳性非小细胞肺癌的诊断和治疗指南（2013版）”。采用现代分子生物学技术探索新的基因突变位点、针对性的靶向基因治疗药物。如吉非替尼和厄洛替尼只能选择性地作用于EGFR基因突变型的肺癌细胞，但对 EGFR基因不突变的却没有作用，克唑替尼则可延长携带ALK基因突变的肺癌患者的生存期。 肺癌：[2014]，在中国工程院院士孙燕的支持下，中国医学科学院肿瘤医院副院长、肿瘤内科主任石远凯教授召集国内肺癌领域知名临床、病理专家，结合自身基因靶点检测结合靶向药物临床试验的实践经验，已于今年制定出“中国EGFR突变和ALK融合基因阳性非小细胞肺癌的诊断和治疗指南（2013版）”。 “EGFR-TKI的疗效依赖于患者的肿瘤细胞是否具有EGFR基因19或21外显子突变，而且这类患者只占中国非小细胞肺癌患者的30%~40%，具有这些基因突变的患者采用EGFR-TKI 的有效率可达80%，但不具有这类突变的患者疗效甚微。”上海交通大学附属胸科医院副院长、肺内科主任韩宝惠表示，针对ALK研发ALK激酶抑制剂“赛可瑞”（克唑替尼）用于存在上述基因重排的NSCLC 患者的治疗。III期临床试验的数据表明，克唑替尼可延长携带ALK基因突变的患者的生存期。
人基因治疗申报临床试验指导原则
人基因治疗申报临床试验指导原则 1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以后，国内外基因治疗的临床前及临床研究进展很快。为了我国基因治疗的正常开展管理，特起草本指导原则，作为申报人基因治疗临床试验的试行办法。凡国内单位以及国外单位或中外合资单位所研制的人基因治疗制剂在我国境内进行临床研究，均须按本指导原则进行申报和审批。 Ⅰ引言 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生殖细胞。基因治疗的申报范围，是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的，不包括应用化学药物改变基因表达。后者应纳入化学药物治疗的申报范围。 基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入体内（ex vivo）及体内导入（in vivo）两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是将基因通过适当的导入系统直接用于人体。所用导入系统包括病毒与非病毒型。因此，申报资料不可能用一个模式来概括，必须按方案及其技术路线而异。本指导原则只可能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体申报的内容。根据国内外基因治疗的进展，基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险性，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。为此，希申请者加强咨询和论证，提出一个确保安全
有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终制品的制备，务必制订标准操作规程，并予严格实施。 Ⅱ申报资料内容 一、基因治疗制剂简介 （一）申请表（见附表） （二）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果： 1.应提供国内及国外已开展的同样或同类疗法的资料，包括所选择的病种、有效性、安全性及必要性。须着重指出申请方案与国外或国内已批准的方案的不同处、特点及其优越之处。凡属新的方案，应说明其优越性及安全性的依据。 2.须说明可能出现的副作用或危害，并提出如何避免和减少其危害性或副作用的措施。 3.利弊的权衡。根据该治疗方案可能达到的疗效及可能出现的风险，提出总体的利弊权衡的估价。这种估价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。 （三）制剂的制备工艺简介： 简要说明该制剂（或产品）的制备工艺流程及其对安全性的保证。 二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控 （一）治疗用的目的基因及其质粒的组建： 不论何种导入形式，首先应说明基因治疗所用的目的基因及其来源（尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料）、分离的材料方法、克隆步骤、DNA序列分析结果以及重组体质粒组建详细步骤及鉴定结果。
基因治疗在疾病防治中的应用
基因治疗在疾病防治中的应用 120311102 张宇鑫 [摘要] 传染病是目前人类所面临的一类重大疾病，在某些疾病状态下，人类还未寻找到理想的治疗方法，如病毒感染等。现代基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理，对人类疾病进行治疗的新疗法。主要是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、基因药物进行疾病治疗的方法。经过多年的发展，技术逐步走向成熟，在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景。传染性疾病的基因治疗包括：基因疫苗、RNA干扰、反义技术、药物靶向治疗等。 [关键词] 基因疫苗反义技术药物靶向治疗 一、现状 1.1我国传染病预防现状 21世纪人类依然面临着传染病的挑战，就全球而言，艾滋病是当前首恶，由于其病毒极易发生变异，所以到目前为止疫苗仍在试验阶段，缺乏理想的特效药物，免疫损伤治疗难度大。我国2003年比2002年发病率上升44．39%，人类免疫缺陷病毒检出率提高了55％。并且防治工作面临来自传统传染病和新发传染病的双重压力：传统传染病威胁持续存在，新发传染病不断出现。近10年来，我国几乎每一两年就有1种新发传染病出现，许多新发传染病起病急，早期发现及诊断较为困难，缺乏特异性防治手段，早期病死率较高。其次，人口大规模流动增加了防治难度，预防接种等防控措施难于落实。三是环境和生产生活方式的变化增加了传染病防治工作的复杂性。一些地区令人堪忧的城乡环境卫生状况，以及传统的生产生活方式，使一些人畜共患病持续发生。 1.2基因治疗研究的现状 (1) 复合免疫缺陷综合征的基因治疗 1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）采用反转录病毒介导的间接法导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩，大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25%，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。 (2)黑色素瘤的基因治疗 对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL－2/肿瘤细胞方案，即分别将IL－2基因肿瘤坏死细胞（TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL－2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。
浅谈基因治疗的优势和缺陷
浅谈基因治疗的优势和缺陷 【摘要】生物基因治疗是一种新兴的、具有显着疗效的肿瘤治疗模式，生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。与传统的治疗方法不同，生物治疗主要是调动人体的天然抗癌能力，恢复机体内环境的平衡，相当于中医的“扶正培本，调和阴阳”，是一种自身免疫抗癌的国际最新治疗方法。对于患有肿瘤的病人来说，这无疑是一大喜讯。 【关键词】DNA 基因治疗优势缺陷 基因治疗是运用生物分子学技术和细胞工程技术对中晚期肿瘤和转移、复发实体瘤患者（包括肝癌、淋巴癌、乳腺癌、肠癌等恶性肿瘤），在CT和B超精准定位下，对实体瘤进行有效地生物免疫冲击，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异味性效应细胞和分子，让实体瘤缩小甚至消失，迅速使肿瘤各项指标下降或恢复正常，达到最终清除癌症的目的。 要真正正确地从基因的角度对肿瘤进行治疗，我们必须得先清楚基因的结构特征，当然，人类为此也付出了很多辛勤的汗水。 一、什么是基因 基因是具有遗传效应的DNA片段。那什么又是DNA呢？ DNA（为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。带有遗传信息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现。 二、DNA的结构特点 沃森和克里克两位科学巨匠提出DNA双螺旋结构，揭示了遗传信息的储存以及传递。DNA是反向平行的右手螺旋双链结构，具有严格的碱基互补配对关系（A—T，G—C）。互补碱基的氢键及碱基平面间的疏水性碱基堆积力维系DNA双螺旋结构的稳定。DNA在双螺旋的结构基础上，可进一步折叠为超螺旋结构。DNA的基本功能是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板。 DNA具有变性与复性的性质。变性是指DNA分子中的两条链分开形成单链的过程，而复性则是指分开的单链分子按照碱基互补原则重新形成双链的过程，该性质死核酸分子杂交的基础。DNA解链过程中紫外吸收A260增加，称为DNA的增色效应。DNA在热变性过程中紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称溶解温度（Tm），此时，DNA分子内50%的双链结构被解开。DNA分子的Tm值的大小和分子中所含碱基的G+C含量呈正相关。 三、什么是基因治疗 基因治疗（gene therapy）是指用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，它们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。其治疗方法主要可分为：1．DNA矫正。DNA矫正指将致病DNA链的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。 2．DNA置换。DNA置换就是用正常DNA通过体内DNA同源重组，原位替换病变细
基因治疗
基因治疗 名词定义 中文名称：基因治疗 英文名称：gene therapy 定义1：将正常基因导入造血干细胞或其他组织细胞，以纠正其特定的遗传性缺陷，从而达到治疗目的的方法。 应用学科：免疫学（一级学科）；免疫病理、临床免疫（二级学科）；肿瘤免疫（三级学科） 定义2：在基因水平上治疗疾病的方法。包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：在基因水平上治疗疾病的方法。其手段包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义4：将缺陷基因的野生型拷贝引入患者细胞内以治疗疾病的方法。 应用学科：遗传学（一级学科）；经典遗传学（二级学科） 基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。 基本信息 gene therapy 遗传病的基因治疗(gene therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因 的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。 基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾