非病毒基因载体

概述

定义

非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。

特点

非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。

与病毒载体相比较，具有毒性低、免疫反应低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点。

然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。

2常用材料

脂质体或脂类复合物

脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来, 众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有1~2条由12~ 18个碳原子组成的疏水链, 使其在水性介质中形成双层结构, 并包裹DNA;另一端为亲水性的N+, 通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。

脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄, 蛋白质主要在肺内皮细胞中表达，通常表达时间较短,一般在给药后4~ 24h即达峰, 1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药选择性差的缺点。

目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体, 但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别, 而且转染效果还取决于给药途径。因此, 只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体, 这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。

阳离子多聚物

1、多聚赖氨酸：聚L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移, 其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明，在有或无靶向配体的情况下，多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。

2、聚乙烯亚胺( polyethylenimine, PEI) ：PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构, 疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性, 保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量, 在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。

3、树突状聚合物：树突状聚合物系一定Mr 范围的聚酰胺和含磷树状聚合物的末端氨基通过静电力与DNA结合形成的一种阳离子多聚物非病毒基因载体，聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解,可使基因转染率增加50倍, 其原因可能是水解增加了聚合物的柔韧性。故一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。

壳聚糖载体聚合物

壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物,通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解, 完全进入细胞。作为基因载体, 壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点。

壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳

米微球和壳聚糖自聚体-DNA。有研究表明，壳聚糖的Mr、DNA复合物的N/P值、DNA 复合物颗粒大小和对壳聚糖的改性及其改性程度是影响这类DNA复合物对细胞的转染效率和是否对特定细胞具有靶向性的主要因素。壳聚糖载体对质粒DNA有效的凝聚作用和保护DNA不被核酸酶降解是其它高分子载体无法比拟的。

无机纳米粒子载体

应用于基因转运的无机纳米粒子主要包括硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子、量子点等。无机纳米粒子主要通过穿过细胞膜将药物或生物分子转运到生物体中而起到治疗疾病的作用, 其发挥转染功能的大致过程有：首先,将DNA和RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,通过内吞入胞等方式被转运至细胞内并且被释放。其次,将DNA导入细胞核并发挥功能。

但目前没法确定DNA进入细胞核的确切途径,学者们主要倾向于两种主要理论: 一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解, 然后释放DNA转运进核; 另一种是携带DNA的纳米粒子直接到达细胞核表面,然后DNA转运进核。

3非病毒载体介导基因治疗需克服的屏障

非病毒载体克服的基因转染效率很低。这主要是非病毒载体介导基因治疗需要克服3道屏障：细胞膜、内涵体-溶酶体系统、核膜。

要提高非病毒载体基因转染效率，就必须要使载体能有效的跨越细胞膜即增强细胞对复合物的摄取; 其次要保护基因不受内涵体溶酶体系统酸性环境的破坏降解，并能使内涵体溶酶体有效的释放基因; 最后，基因要进入细胞核表达目的蛋白就必须要能有效的跨越核膜。

提高细胞对载体--基因复合物的摄取

为提高摄取率，就要提高复合物的细胞靶向性，增强与细胞膜的作用。

1、连接靶向配体

在非病毒载体骨架上接上配体，与相应的细胞表面受体特异性结合，加强复合物的细胞靶向，增加细胞对复合物的摄取，从而增加基因的表达。

转铁蛋白是一种内源性的糖蛋白，多数肿瘤细胞过表达转铁蛋白受体，在载体上接入转铁蛋白可提高纳米复合物的癌细胞靶向性，增加细胞对复合物的摄取率从而增强基因的表达。2、载体材料的结构修饰

载体材料是携带基因达到靶细胞的运输工具，其结构影响复合物达到靶细胞的效率通过载体材料的修饰可以改善其溶解性，屏蔽其过多的表面电荷，降低细胞毒性另外载体材料结构修饰可以更好的包裹基因，保护基因不被破坏，提高细胞靶向性，增强与细胞膜的作用。聚乙二醇(polyethyleneglycol ，PEG ) 是亲水性很强的聚合物，常用来修饰纳米粒载体以改善其水溶性或者屏蔽其表面电荷，但PEG修饰后的纳米粒细胞摄取率很低，这很大程度上限制了PEG在纳米载体上的运用。为了克服低转染效率问题运用低聚PEG修饰载体，这样可以减小空间位阻有利于细胞的摄取。

3、赋予纳米粒“隐形”的特性

基因转染效率要高，首先要求纳米粒能有效的集中于靶细胞，增强靶细胞的摄取但一般的纳米粒粒径较大，进入体循环后很容易被体内的单核细胞吞噬系统(MPS) 所吞噬，并在网状内皮系统（RES）中聚集，这使得达到靶细胞的纳米粒的量极少，导致体内转染时效率极低。目前发展的隐形纳米粒具有粒径小，水溶性高的特点，能有效的避免MPS的吞噬，减少体循环中的降解。而这种隐形作用，主要取决于纳米粒的粒径大小和水溶性纳米粒半径控制在100nm以下，并采用亲水材料修饰形成亲水层，可以避免或者减少体内单核细胞吞噬系统的吞噬，使其在体循环中存在时间更长，能有效地转运到靶器官或组织。

促进载体基因复合物从内涵体溶酶体释放

内涵体溶酶体系统的酸性环境往往导致基因的破坏，其中的核酸酶则会导致基因的降解这都

使基因转染效率大大下降。因此，保护基因在内涵体溶酶体系统的完整性和促使基因从该系统中的释放是提高非病毒载体基因转染效率的行之有效的方法。

1、加入溶酶体酶倾向剂

增加载体基因复合物在内涵体吞噬泡中释放的一种可行措施是在转染时加入溶酶体酶倾向剂，如氯喹。研究显示氯喹能增加基因转染效率可能包括3种机制：①缓冲吞噬泡中的；②替代复合物中的载体；③改变释放后核酸的生物物理学特性。

2、三元复合物载体材料

为了提高基因转染的效率可以在原有的纳米载体基因复合物的基础上再接入另一种质子缓冲材料，形成三元复合物，缓冲溶酶体中的酸性环境，提高基因转染效率。由于接入材料的理化性质，在保护基因不受降解同时使基因易于从内涵体溶酶体中释放到细胞质中从而提高转染效率。

提高目的基因的跨膜转运

基因治疗的第三道屏障是核膜，目的基因能否有效地进入细胞核直接关系到基因的转染效率。非病毒载体介导的基因转染效率不高，主要是外源基因难以有效的导入到细胞核，导致基因在细胞质中被核酸酶降解。

核蛋白定位信号（NLS）是一种富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的短肽，能有效的介导蛋白或者核酸的跨核膜转运。目前常用的NLS有鱼精蛋白，低相对分子质量的鱼精蛋白，SV40大T蛋白非病毒载体通过NLS修饰后，不仅可以协助基因的跨核膜转运，同时可以提高细胞摄取率

以上部分来自于百度百科

非病毒基因治疗载体的研究进展

人类基因组草图的绘制完成及深入研究将为基因治疗打下坚实的基础，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，基因治疗药物将对医药工业产生深远的影响。自从1990年Anderson等首次成功地进行基因治疗的临床研究以来，迄今已完成了500多例基因治疗临床研究，但其结果尚不尽人意，其最大困难在于开发无毒、高效的基因治疗载体。虽然80%的研究仍采用转染率较高的病毒载体，但尚存在的非导向性、有限的携带能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题，如2000年美国宾州大学以重组病毒为载体的基因治疗药物在临床研究中造成一个18岁受试者死亡的悲剧以及腺病毒有选择性的促肾上腺皮质作用的报道，因此，近年来非病毒基因治疗载体倍受关注，也正是当前药剂学研究的前沿课题。为此，本文就其研究进展作一概述。

1 裸DNA

将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单

的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞对裸DNA较为敏感。肌内注射后可直接诱导相应的免疫反应，也可检测到DNA的明显表达。电穿孔（electroporation）技术和微粒子轰击法（microparticle bombardment, 此法也称作基因枪）的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且使DNA可直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。目前使用的DNA疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。虽然将裸DNA直接用于病变组织是可行的基因转移策略，但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然给予裸DNA是无效的。最近，Yoshiakit等还使用高频、低强度的超声波转染荧光素酶质粒DNA到培养的人血管平滑肌细胞和内皮细胞。结果显示，在这两种细胞中的荧光素酶活性显著增加。同样用超声法把抗原癌基因（P53）质粒DNA转染到兔颈动脉以治疗血管损伤后再狭窄，结果表明P53蛋白显著增加，且没有明显的不良反应，如炎症反应。

2 脂质体或脂质复合物

自从1987年Felgner等率先用脂质体作为基因转移载体以来，相继合成了许多阳离子脂质。所有这些阳离子脂质的一端皆拥有1～2条由12～18个碳原子组成的疏水链，使其在水性介质中形成双层结构，并包裹DNA；另一端为亲水性的N＋头部，通过静电力与DNA 结合以形成脂质复合物。构效关系研究表明，增加分子中N＋数目以及N＋与疏水链的距离，则有利于基因转移。脂质体或脂质复合物经静脉注射后，很快被血浆清除以及在肺组织中积蓄，蛋白质表达主要在肺内皮细胞，表达时间短，一般在给药后4～24 h达峰，1周后消失。因此，阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药的靶向困难，如：气管内给药可使肺泡上皮细胞中的β-半乳糖苷酶基因表达，给予P53凋亡诱导基因可使早期肺肿瘤缩小。另外，通过喷雾给药可有效地防止脂质复合物中DNA的降解。还报道用单糖、双糖或PEG作冻干保护剂，采用冷冻干燥法可改善脂质复合物的稳定性。虽然，在阳离子脂质构效关系研究的基础上，合成了一些新的脂质载体，但离理想的脂质载体还相距较远，其困难在于体内外转染条件的差别，而且转染效果还取决于给药途径。为此，一个理想的载体不得不根据实际的临床应用而个性化设计，这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物已在临床研究中用于治疗癌症和囊性纤维病变，但还无长期安全性报道。早期的动物和临床研究表明，脂质体或脂质复合物是无毒的，而且若给予小剂量，其诱导的炎症反应很小。然而，现在有研究表明小鼠呼吸道吸入脂质复合物后，可诱导产生剂量依赖性的肺部炎症反应并伴随细胞因子的产生。若静脉注射给予DNA阳离子脂质复合物，发现可激发高水平的细胞因子如INF-γ和TNF-α产生。这些细胞因子不仅引起所治疗小鼠的毒性，还抑制外源基因的表达。阳离子脂质起一个协同作用，诱导细胞因子产生的主要成分是质粒DNA中未甲基化的胞苷磷酸鸟苷（cytidyl phosphate guanosine, CpG）二核

苷酸。目前，解决上述问题的办法在于修饰质粒DNA以减少CpG数目和使用免疫抑制剂。另外，增加载体的组织特异性和降低含CpG DNA与免疫细胞的非特异性相互作用，也能降低免疫反应的发生。

3聚合物

3.1聚-L-赖氨酸

1987年首次报道与去唾液酸糖蛋白连接的聚-L-赖氨酸偶合物用于肝细胞的基因靶向转移。聚合物用作基因载体的早期研究工作主要集中在如何偶联上靶向配体或抗体以增加靶细胞的摄取。研究发现，如果既不连接靶向配体或抗体，又不添加吞噬泡或溶酶体溶解剂（如氯喹），其基因转染效果较阳离子脂质体差，这是双亲性阴离子脂质与可溶性聚合物——聚-L-赖氨酸的重要区别。这种聚合复合物（polyplexes）的细胞摄取和基因转染在有或无靶向配体的情况下，皆依赖于聚合复合物正电性的存在。将组氨酸连接到聚-L-赖氨酸中L-赖氨酸的δ-残基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-赖氨酸混合物更有效，这是由于在pH 6以下，质子化的组氨酸提供了额外的内吞缓冲能力。因此，组氨酸的使用似乎有助于避免DNA在吞噬泡中被降解。研究还表明，用半胱氨酸和色氨酸残基替代聚-L-赖氨酸中的一些氨基酸残基，也会增强此聚合复合物的基因转染效果，表明DNA的释放可能受细胞内二巯键的还原所激发。虽然，聚-L-赖氨酸像脂质体一样能阻止血清中核酶对DNA的降解，但是，若经静脉注射，聚合物与血浆蛋白结合后仍将迅速从血浆中清除。

3.2聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）

与聚-L-赖氨酸不同的是这种支链或线形PEI阳离子聚合物由于其自身的内吞缓冲特性，在不需要吞噬泡或溶酶体溶解剂的情况下显示出更好的基因转染效果。PEI和阳离子脂质体一样也具有细胞毒性作用，不同相对分子质量（M r）或异构体(支链或线形)的PEI，在体内基因转染的效果和毒性是不同的。PEI的M r对转染活性的影响报道不一，可能理想的M r 大约在19.9 ? 103～70.0 ? 103。PEI是一种非常有效的基因转移载体，但若静脉给药，其基因表达跟阳离子脂质体一样也主要在肺泡上皮细胞，因此，以前的研究多采用直接应用到靶组织。PEI已用于不同给药途径的基因转移如吸入、肾动脉内给药、脑内注射和静脉注射，其基因表达也较短暂，给药后14天已不能检出。如果在此聚合物偶联上靶向配体将会增强其转染能力。若用PEG包衣能使其在肺外组织、肝的基因表达增加，而且还能调节PEI的毒性，但是体外摄取有所降低。不论是静脉注射，还是气管内给药，线形PEI的基因表达量皆优于阳离子脂质体。

3.3树状聚合物

一定分子量范围的聚酰胺和含磷树状聚合物已被用作基因传递系统，其末端氨基通过静电力与DNA结合，增加末端氨基的数目则能增加其基因转染的效果。聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解，可使基因转染率增加50倍，其原因可能是增加了聚合物的柔韧性。研究还发现，这种增加的柔韧性对吞噬泡的膨胀至关重要。一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。

3.4其它聚合物

聚（二甲氨基）乙基甲基丙烯酸酯、聚-L-组氨酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、壳聚糖、明胶等皆被用作基因传递系统的载体材料。纳米粒由于它的超微小体积，能穿透组织间隙，具有良好的细胞摄取效果而将DNA导人到胞浆内；能控制DNA的释放而延长其体内、外的作用，因此，纳米粒作为基因转移载体得到了广泛的关注和研究。壳聚糖纳米粒是首次报道的口服基因传递系统的载体材料，这将为口服疫苗提供新的机遇。李拥军等用聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载特异性反义单核细胞趋化蛋白-1基因制得的纳米粒，在体外的释放时间为2周左右，可将目的基因转移至平滑肌细胞基因组中，其效果与阳离子脂质体相当；体内可实现局部基因转染和表达，发挥相应的效应，其作用比阳离子脂质体介导的基因转染稍强；但该载体的包理率仅有0.9%。Goetting等在用带正电荷的聚苯乙烯纳米粒装载带负电荷的寡核苷酸的实验中，测定了寡核苷酸的含量对纳米粒稳定性的影响。结果表明，随着寡核苷酸含量的增大，所形成的纳米粒先变得不稳定，后趋于稳定。这是由于纳米粒的极性造成的，而当纳米粒达到电中性时，凝固作用也达到最大。另外，研究还表明，转基因纳米粒对靶细胞的转染效果与细胞类型、纳米粒的粒径大小、细胞孵育的时间以及纳米粒的浓度有关。

4复合载体

4.1脂质复合物

将DNA与聚-L-赖氨酸、聚乙烯精胺或聚乙烯咪胺等形成复合物，再包封于阴性或中性脂质体中形成的脂质复合载体系统毒性更小，而且在某些情况下，由于更大程度上保护DNA 免遭核酸酶降解而在体外基因转染中比阳离子脂质体更有效。脂质体或脂质复合物、聚合物或复合载体一般可以通过以下手段以增强载体的靶向性和提高转染率。①由于阳离子脂质或聚合物是通过静电力与DNA形成复合物，只有在阳离子过量时才能有效地浓聚DNA，而这种正电荷在体内易与血浆蛋白（特别是白蛋白）相互作用并激活补体系统，从而引起复合物的去稳定性、非特异性清除及不良反应。因此，通过PEG修饰、包裹或羟丙基甲基丙烯酸包衣后的脂质复合物或聚合复合物体，可屏蔽复合物所带的电荷，减少它与血浆成分的相互作用，从而避免免疫系统的清除，增加循环时间；减少与非靶细胞因电荷引起的相互作用；

聚合物——质粒DNA复合物多呈不规则状，包裹或包衣后可使其成为球形结构；增加靶组织中蛋白质的表达，但体外的细胞摄取量有所降低。②通过共价或非共价连接靶向抗体或配体如：肝细胞特异性的去唾液酸糖蛋白、肿瘤细胞特异性的转铁蛋白等来增加靶组织细胞中的转染率。

4.2拟病毒颗粒

用中性或阴性脂质体包裹偶联有核定位肽、两性分子肽的阳离子多聚物——DNA复合物，再加入未端有跨膜型疏水区的配体寡肽，插入脂质体双分子层中，形成一个功能齐全且有保护作用的穿梭载体，类似于病毒颗粒。这种拟病毒颗粒一般应用中性或阴性脂质体，因阳离子脂质体在血浆中不能维持胶体的稳定性。导向配体采用具有介导内吞作用的配体，如碱性细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。

5 基于抗体的靶向基因传递系统

为了获得DNA与特异性细胞的靶向结合，早期的研究是将不同的质粒DNA与各种单克隆抗体结合，在体内外转染小鼠淋巴细胞实验中，证明有一定的效果。Durrbach等用高度特异性的G250单克隆抗体与DNA的结合物转染肾癌细胞也取得了较好的内化效果，还发现外源DNA从吞噬泡中逃逸是其转入细胞核所必需的。为了进一步提高DNA进入细胞核的能力，有报道在引入靶向抗体的同时，将质粒DNA与组蛋白H1非共价连接，其中组蛋白H1起到DNA载体的作用而降低核酸酶的降解，则有利于进人静止期细胞的细胞核；再把一种能使吞噬泡膜不稳定的膜去稳定性多肽（两性分子肽）连接上去，则有利于DNA从吞噬泡逃逸而进入细胞质。实验证明，这种新型基因载体不仅能在体外特异性地转染靶细胞，而且在体内经静脉注射后能在肾癌细胞中有效表达。

总之，非病毒载体转导的外源基因不会整合入宿主细胞的染色体中，不会使插入位点附近的基因过度表达或失活，也无插入突变的危险，因此，其安全性可能优于病毒载体。但非病毒载体的研究尚处于婴儿期，还存在靶向困难、转染效率低、有效表达时间短等问题。因此，还必须深入研究外源基因进入细胞的各种屏障及其细胞和分子机制。随着显像和标记技术的进展，这方面已进行了一些研究。细胞摄取是外源基因进入细胞的第一道屏障，虽然，有研究提示脂质体或脂质复合物可直接穿过细胞膜，但主要还是通过内吞作用进入细胞。虽然细胞表面与脂质复合物相互作用有关的生物分子尚未完全确定，然而细胞膜上的糖蛋白似乎起着重要作用。因为如果细胞膜上的糖蛋白合成缺陷，基因转移则更困难。基因转染的第二道屏障是质粒DNA从吞噬泡到胞质的转运。吞噬泡中的酸性环境及水解酶的存在可导致DNA的降解，而使转运效率降低。如果在载体系统中加入膜去稳定性多肽，如流感病毒血凝素N端寡肽、鼻病毒VP-1蛋白和pH敏感的两性多肽等可使转染效率提高10～

1000倍。基因转染的第三道屏障是质粒DN A尚不能有效地转入细胞核，而且其转运机制还不清楚，到达细胞核的命运还知之甚少，但有研究提示DNA进入细胞核主要取决于DNA 的大小，其次是其结构。线形DNA似乎比其它类型的DNA更有效地被转入细胞核中。如果在载体系统中连接上核定位信号多肽可显著提高转染效率。由于体内基因转移的机制随给药途径的不同而不同，比如：当静脉给予脂质复合物后，在其到达靶组织之前，其大小、结构和静电荷等物理特性将显著改变，其程度取决于与生物体液的相互作用。因此，还必须根据临床应用的实际来个性化设计基因转移的载体制剂。

可以相信，通过对非病毒基因载体基础和应用的深入研究以及各学科的共同努力下，将会使非病毒基因载体的基因治疗取得最大的疗效，同时最大限度地降低不良反应。

这部分来自于生物谷

病毒载体概述

病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助

病毒性肝炎的基因治疗

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/307232768.html, 病毒性肝炎的基因治疗 作者：丁雯 来源：《健康必读（上旬刊）》2018年第03期 摘要：病毒性肝炎严重威胁人类健康。全球慢性病毒性肝炎患者众多，而现有的抗病毒治疗只在少数患者显现疗效。探索更为有效的治疗方法已成为迫切需要。基因治疗可以调节病变组织的生物学功能，因此成为一种强大且可塑性极强的治疗工具。越来越多的实验室和临床研究显示了基因治疗在病毒性肝炎治疗中的潜力。本文就近年来病毒性肝炎的基因治疗策略进行综述。 关键词：病毒性肝炎；基因治疗 中图分类号：R51 文献标识码：A 文章编号：1672-3783（2018）03-0134-01 病毒性肝炎是严重危害人类健康的常见传染病，慢性病毒性肝炎可导致肝硬化和肝癌等终末期肝病，部分患者可发生肝细胞大量坏死所导致的暴发性肝衰竭，病死率高达80%～90%。病毒性肝炎严重危害人类的生命健康，但目前尚缺乏十分理想的治疗方法。干扰素α仅对不到40%的慢性HBV感染者和20%～30%的慢性HCV感染者有效。 目前广义的基因治疗是指体细胞基因治疗，即将具有防治潜能的外源基因（目的基因）通过合适载体转移到患者的相关器官组织（靶组织）的细胞内，并获得适当表达，替代、修正、补偿缺陷基因的功能或封闭、抑制异常表达的基因，以达到防治或减轻疾病的目的。因此基因治疗的对象不再局限于单基因缺陷遗传病，还包括传染性疾病在内的多种类型的疾病。研究者对病毒性肝炎基因治疗的研究也取得了许多进展。 1 反义核酸与核酶 早期利用核酸作用于靶RNAs并使其降解的方法是通过DNA寡核苷酸与互补RNAs杂交，从而引起核糖核酸酶H介导的降解作用，也就是众所周知的“反义技术”。继而人们又发现了具有催化活性的RNA分子，即核酶。目前人们可以通过设计各种反义核酸或核酶来降解靶序列。 Nash等将针对HBV衣壳包装信号、X抗原和表面抗原mRNA的锤头状核酶和反义序列克隆于lenti病毒载体，并导入表达HBV的肝细胞中，整合载体持续表达超过4个月，以HBs mRNA为靶标的反义RNA可有效降低转录子的水平，针对X抗原和表面抗原mRNA的核酶 也可有效降低HBV mRNA水平。 通过导入反义核酸或核酶的长效表达载体并使其与宿主基因组整合，一定比例的肝细胞（及其子代细胞）就会被赋予抵抗病毒感染的特性。由于这部分细胞比那些已被病毒感染的细

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展

专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列

非病毒基因载体

概述 定义 非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。 特点 非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。 与病毒载体相比较，具有毒性低、免疫反应低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点。 然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。 2常用材料 脂质体或脂类复合物 脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来, 众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有1~2条由12~ 18个碳原子组成的疏水链, 使其在水性介质中形成双层结构, 并包裹DNA;另一端为亲水性的N+, 通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。 脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄, 蛋白质主要在肺内皮细胞中表达，通常表达时间较短,一般在给药后4~ 24h即达峰, 1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药选择性差的缺点。 目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体, 但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别, 而且转染效果还取决于给药途径。因此, 只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体, 这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。 阳离子多聚物 1、多聚赖氨酸：聚L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移, 其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明，在有或无靶向配体的情况下，多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。 2、聚乙烯亚胺( polyethylenimine, PEI) ：PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构, 疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性, 保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量, 在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。 3、树突状聚合物：树突状聚合物系一定Mr 范围的聚酰胺和含磷树状聚合物的末端氨基通过静电力与DNA结合形成的一种阳离子多聚物非病毒基因载体，聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解,可使基因转染率增加50倍, 其原因可能是水解增加了聚合物的柔韧性。故一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。 壳聚糖载体聚合物 壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物,通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解, 完全进入细胞。作为基因载体, 壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点。 壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体

基因治疗

基因治疗 【摘要】研究发现，以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致可分为三类：单基因病、多基因病和获得性基因病。随着现代生物科学的发展，基因工程已在多个领域得到广泛应用。基因治疗是利用基因工程技术向有功能缺陷的人体细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其疾病缺陷，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，已经在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和艾滋病等疾病的治疗方面取得进展。它在一定程度上改变了人类疾病治疗的历史进程，被称为人类医疗史上的第四次革命。本文就基因治疗的载体以及基因治疗在肿瘤、艾滋病治疗方面取得的成就作出介绍，并就基因治疗的现状和问题对基因治疗的未来作出展望。 【关键词】基因治疗、载体、肿瘤、p53、IAP、艾滋病、CCR5 【正文】 一、基因治疗背景及概念 1990年9月，美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案，对一名患有重度联合免疫缺陷症（SCID）的女童进行基因治疗并获得成功，从而开创了医学的新纪元。自此以来，基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病，给人类的医疗事业带来革命性变革。 基因治疗（gene therapy）是指通过一定的方式，将正常的功能基因或有治疗作用的DNA 序列导入人体靶细胞去纠正基因突变或表达失误产生的基因功能缺陷，从而达到治疗或缓和人类遗传性疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。 基因治疗包括体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。但由于用生殖细胞进行治疗会产生伦理道德问题，因此通常采用体细胞作为靶细胞。其基本内容包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项。根据功能及作用方式，用于基因治疗的基因可分为三大类：（1）正常基因：可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的功能，常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病；（2）反义基因：通过其与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤mRNA互补，从而阻断其表达，常用于治疗病毒感染或肿瘤疾病；（3）自杀基因：能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化合物，用于治疗癌症。 二、基因治疗载体

人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则

人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 一、引言 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。 基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为体外基因导入（exvivo）及体内基因导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复（混）合物。基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前，一些基因治疗研究相对比较成熟，而一些则不够完善，更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此，研究者应加强咨询和论证，提出一个科学可行的研究方案，最终获得确保安全有效的基因治疗制品。 在向国家药品监督管理局申报临床试验时，除须按本指导原则中"研究内容和制品质量控制"准备材料外，同时需提供下述材料： （1）国内外研究现状和进展（综述）。包括： 1．所用基因的研究现状和进展； 2．所用载体的研究现状和进展； 3．所用基因导入系统和方法的研究现状和进展； 4．该研究或制品相关的体外有效性实验资料； 5．该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料； 6．该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料； 7．该研究或制品的生产工艺现状； 8．该研究或制品的质量控制现状；

用于基因治疗的慢病毒载体(一)

用于基因治疗的慢病毒载体(一) 基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。 理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文即对该类载体的研究进展做一简介。 1HIV-1基因组的基本结构〔6〕 HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。 2构建HIV-1载体系统的基本原理〔7〕 HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5＇LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3＇LTR换成SV40polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种〔1〕。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 3HIV-1载体系统的改进 近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力〔8〕、筛选抗病毒药物〔9〕、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用〔10〕等。而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果〔1～3〕，主要包括以下几方面的改进。 3.1包膜蛋白 最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等〔1〕设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎

基因治疗用腺病毒载体研究进展

基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准

基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择

基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择 摘要：1989年Rosenberg等利用逆转录病毒载体实施第一例人类基因治疗实验，此后基因治疗研究在全球范围内逐渐展开。2017年，基因治疗在癌症和罕见遗传病的治疗 中接连取得了巨大成功，本文梳理了这一系列的标志性事件，重点讲述基因治疗中的载体选择。2017年11月8日，Nature 发表论文：Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells，通过逆转录病毒载体基因治疗，一位7岁的交界性大疱性表皮松解症（JEB）患者全身约80%的皮肤获得重建，且皮肤功能完全正常（图1）。图1 2017年11月2日，NEJM发表论文：Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy，以腺相关病毒9型（AAV9）为载体的基因疗法成功延长了15位1型脊髓性肌萎缩症（SAM1）患儿的生命（图2）。图22017年8月30日，诺华公司治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的以慢病毒为载体的CAR-T疗法Kymriah获FDA批准上市，成为FDA批准的第一款基因疗法（图3）。图3以上三个基因治疗的标志性案例，使用了三种不同的基因治疗载体，分别是逆转录病毒（RV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）。基因治疗载体分为两大类：病毒载体（主要包括慢 病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等），非病毒载体

（主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等）在讲基因治疗载体前，我们先讲一下基因治疗中的两个概念：in vivo和ex vivo。in vivo：活体直接转移,将带有遗传物质的载体直接注射到实验动物或人体内。适用载体：腺相关病毒、腺病毒、非病毒载体等。ex vivo：在体转移,将实验对象的细胞取出,体外培养并导入重组基因,而后将这些经遗传修饰的细胞重新输回实验动物体内。适用载体：慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等。接下来我们介绍以下常用的基因治疗载体基因治疗中的病毒载体 逆转录病毒（RV）：单链RNA病毒，可高效地感染多种类型细胞，可以将外源基因随机插入并稳定整合到宿主细胞基因组中持续表达。其中γ-逆转录病毒载体最早被改造的且广泛地被应用到基因治疗中，并取得了不少巨大的成功。不足之处：①不能感染非分裂细胞；②转录终止能力相对较弱，从而有可能造成转录通读；③可能产生有复制能力的病毒； ④可能造成插入性突变，例如使用逆转录病毒载体治疗的10例X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)患者中，有4例因载体整合在原癌基因LMO2等的附近，激活下游基因的表达而罹患白血病。逆转录病毒的插入位点是随机的，但更偏向于插人基因的第一个内含子和转录起始位点。此后人们开始重新审视基因治疗载体的使用所带来的风险，此次使用逆转录病毒治疗JEB后，研究团队通过全基因测序确定了插入位

病毒载体

基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2、介导外源基因的转移和表达； 3、对机体不致病。 然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。 基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。 然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型： 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。

病毒载体的应用

病毒载体的应用 关键词：病毒标准物质标准物质网北京标准物质网 随着病毒载体的发展，病毒载体的应用也越来越广泛，尤其在人类疾病的基因治疗中发挥着重要作用。 1.在肿瘤基因治疗中的应用 根据肿瘤的类型和分布，可采用多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。复制缺陷型和条件复制型腺病毒载体已经应用于肿瘤的生物治疗，这主要是通过病毒载体将肿瘤抑制基因、免疫激活基因或凋亡基因导入靶细胞中来实现的。例如腺病毒载体ONYX-015已经应用于多种肿瘤的治疗中，并已经用于Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因缺失的病毒载体能够在动物肿瘤模型和肿瘤组织中抑制肿瘤的生长。痘苗病毒载体可以传递很多的肿瘤特异性抗原，并诱导机体产生很强的针对该肿瘤抗原的细胞免疫。 慢病毒介导的RNA干扰、免疫基因的激活也应用于肿瘤的基因治疗中。 2.在疫苗中的应用 腺病毒载体可以迅速刺激机体产生高水平的免疫反应，故常应用于HIVH5N1等病原体疫苗的研制中。如腺病毒载体Ad5就应用于研制HIV疫苗。 美国Merck公司开发的HIV疫苗(MRK Ad5)即采用了Ad5腺病毒载体。虽然Ad5疫苗最终失败，但是为后续的HIV疫苗研制积累了宝贵的经验。现在又开发出了DNA-腺病毒联合免疫的方法，它将腺病毒载体与其他载体联合起来，以实现持久、有效的免疫保护。将外源基因插入疱疹病毒的非必需基因的位置，构建出来的疱疹病毒载体可用于疫苗的研制。HSV最早应用于构建乙肝(HBV)表面抗原的表达，并成功研制出HBV的疫苗。 3.在神经生物学中的应用 疱疹病毒是一种嗜神经性病毒，它在感染外周神经后可逆行进入中枢神经系统，并可建立无细胞毒性的隐性潜伏感染，然后高效、长期地表达外源基因，而不影响神经细胞的功能，所以可利用疱疹病毒载体将外源基因导入中枢和外周神经系统柬治疗神经紊乱和神经疾病。此外，慢病毒载体可以转染非分裂细胞并可以长期表达外源基因。慢病毒载体也被用于神经疾病病理模型的建立，以及表达神经生长因子以促进神经损伤后的修复治疗等。

病毒基因治疗中有效的载体系统

病毒——基因治疗中有效的载体系统 肖英华　李雅轩　郑继刚(首都师范大学生物系北京100037) 摘要　基因治疗面临的首要问题是如何选择适当的基因载体将具有治疗价值的基因导入靶细胞并使其有效表达,以达到治疗疾病的目的。目前基因治疗临床试验中采用的载体大多数为病毒载体。本文主要介绍基因治疗中常用的4种病毒载体的生物学特性,以及各个载体在基因治疗中的优缺点。 关键词　基因治疗　病毒载体 在基因治疗中,病毒已成为一种有效的载体系统。基因治疗就是将外源基因导入目的细胞并使其有效表达,从而达到治疗疾病的目的。作为当代医学和生物学的一个新的研究领域的基因治疗始于20世纪80年代。直到1990年美国成功地应用基因治疗手段对ADA(腺苷脱氨酶)缺陷病进行治疗,才标志着基因治疗时代的开始。目前,基因治疗已从遗传病扩展到非遗传病领域,例如:传染病,肿瘤,神经系统疾病,免疫缺陷病等。 有效的基因治疗依赖于外源基因在目的细胞中高效、稳定的表达,而这在很大程度上取决于基因治疗采用的载体系统。目前基因治疗中所用的载体可分为两大类:病毒载体和非病毒载体。其中应用最广泛的是病毒载体,约85%的基因治疗临床项目采用的均是这种载体,因其充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性。从理论上讲,各种类型的病毒都可改成为载体,但是由于人们对许多病毒的生活周期,分子生物学认识不够,所以现在只有少数病毒能够改造成为基因治疗所需要的载体。其中反转录病毒,腺病毒,腺相关病毒,单纯疱疹病毒是基因治疗中最常用的4种病毒载体。 1　反转录病毒载体 反转录病毒是一种RNA病毒,基因组大小在8～11kb之间。反转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞,然后在自身基因组编码的反转录酶的作用下,以基因组RNA为模板反转录出双链DNA。双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上,随着寄主细胞的复制而复制。 从W ei等(1981年)构建第1个反转录病毒载体以来,已相继构建了一系列的载体。尤其在1990年美国成功应用反转录病毒载体进行ADA患儿的基因治疗以来,反转录病毒载体的研究和应用受到了极大的重视。目前临床上运用最多是反转录病毒载体。这种病毒载体大多基于禽类或兽类病毒,现在主要以小鼠白血病病毒(一种肿瘤反转录病毒)为基本骨架构建反转录病毒载体,这种基因载体具有以下优点:1)宿主细胞广泛,能够感染不同生物种类的多种类型细胞;2)能高效的感染分裂细胞,感染率高达100%;3)能使外源基因完全整合到宿主细胞染色体上。但也有明显的不足,主要表现在以下几个方面:1)不能感染非分裂的细胞;2)可能产生具有复制能力的病毒;3)由于是随机整合,可能会引起“插入诱变”;4)包装外源DNA能力有限,小于8kb;5)要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体。 慢病毒载体的研究和应用是近几年来反转录病毒载体研究领域的最新研究进展。慢病毒属于反转录病毒的1个亚类,包括各种灵长类病毒(如,H I V21,H I V2 22人类免疫缺陷病毒,S I V2猴免疫缺陷病毒)和非灵长类病毒(如,M VV2羊进行性间质肺炎病毒,F I V2猫免疫缺陷病毒,E I A V2马传染性贫血病毒)。与肿瘤反转录病毒相比,慢病毒有着复杂的基因组,因其基因组中存在核定位信号序列,它能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞(除G0期),例如:神经细胞,巨噬细胞,肝细胞,心肌细胞。这些不同类型的细胞作为基因治疗的靶细胞在临床上具有重要价值。慢病毒载体中开发较早研究较多的是以H I V21为基础构建的载体。 2　腺病毒载体 腺病毒为线性双链的DNA病毒,基因组为30～36kb。腺病毒与宿主细胞细胞膜上的特异受体结合经内吞作用进入细胞,其外壳在内粒中降解,其病毒DNA则进入细胞核。在细胞核中腺病毒并不整合到宿主细胞染色体上,而是以染色体外成分存在。腺病毒对上皮细胞,角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的嗜向性。腺病毒在自然界分布广泛,在许多哺乳动物和禽类中都发现有存在。自1953年第一次分离到腺病毒以后,至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒,其中人的腺病毒有50种以上。与临床疾病相关的腺病毒通常较温和,很少危及生命。 腺病毒载体首次运用到临床,进行的是囊性纤维化病的治疗,即利用腺病毒载体转移囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)基因到患者体内,使其在呼吸道上皮 — 6 1 —生　物　学　通　报 2003年第38卷第11期

基因治疗载体的最新研究进展

基因治疗载体的最新研究进展 在生命进化的漫长历程中，生物体通过基因的突变来适应环境的改变，所以说生物突变是生物体进化的基础［1］。同时，不利的突变会造成细胞形状和功能的改变，从而导致疾病甚至死亡。人类的某些疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关，从而就引起了人们考虑从基因的角度来治疗某些用常规方法无法治疗的疾病。基因治疗（genethrapy）是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的，通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。20世纪80年代初，Anderson首先阐述了基因治疗的概况;1990年美国国立卫生研究院的Blease等成功地进行了世界上首例临床基因治疗，即腺脱氨酶（ADA）缺陷病的人体基因治疗;1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得成功。近年来，一领域的研究取得了重大进展，基因治疗作为安全新的疾病治疗手段，将在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程。纵观基因治疗的整过程，目的基因导入靶细胞并使之表达是其关键环节，因此介导的载体选择便显得格外有意义了。本文介绍了基因治疗的常用载体以及其最新的研究进展。 1 常用的基因治疗的方法 基因治疗常用方法有两种，即体内疗法（in vivo）和体外疗法（ex vivo）。体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是基因转染率较低。研究和应用较多的还是体外疗法，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的。最常用的技术则有三种:（1）体外处理疗法:将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内;（2）原位疗法:使用载体将目的基因直接导入靶细胞;（3）体内疗法:将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。 2 基因 治疗常用的载体有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。基因治疗载体可分两大类:病毒性载体［2］和非病毒性载体［3］。 2.1 病毒性载体病毒性载体如逆转录病毒retrovirus、腺病毒adenovirus、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当深入，目前仍被广泛应用。慢病毒lentivirus

基因治疗的概念知识分享

基因治疗的概念

基因治疗的概念 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预。细胞可以体外修饰，随后再注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞内发生遗传学改变。这种遗传操纵的目的可能会预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病。 基因治疗的类型 根据目的 基因治疗：治疗或预防疾病 基因增强：增强人的性状和能力 根据干预对象 体细胞：基因转入体细胞内 生殖细胞：基因转入生殖细胞或早期胚胎。 体细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗、 体细胞基因增强、生殖细胞基因增强 治疗简要过程 1. 体外法(ex vivo)：患者细胞经体外遗传处理后，再移入患者体内进行治疗。 2. 体内法(in vivo)：把基因通过载体（如病毒）直接转入患者病患部位，进行治疗。 3. 基因治疗使用的载体 （1）病毒 1.1 反转录病毒：RNA病毒，其基因可整入受体基因组 1.2 腺病毒：双链DNA病毒，形成核外DNA，不遗传，需多次施用

1.3 腺相关病毒：单链DNA病毒，可近100%插入19号染色体的特殊位点。感染人和灵长类，不致病，宿主免疫原性小。携带DNA小，难以制造 1.4 病毒壳蛋白形成的假病毒：“魔法子弹” （2）非病毒载体：易于制造、低免疫，但感染和表达少 2.1 裸DNA ：表达效率低；电转移和基因枪转移 2.2 多核苷酸：合成的小分子核酸，使体内基因的表达失活 2.3 脂质体和多聚体：用脂质体和多聚体分子包裹DNA，使DNA被细胞吞入，提高转移效率 （3）复合方法：如脂质体加病毒 （4 ）多晶体：含有核酸（DNA、RNA）的多晶体可以增强基因的转移效率、毒性小 用腺病毒进行基因治疗 Fragile-X 的基因治疗 癌症的基因治疗 基因在癌细胞中表达，引起癌细胞凋亡，从而达到治杀死癌细胞，治愈癌症的目的。 今又生Ad-p53腺病毒注射液 小分子核酸的抑制基因表达和治疗的机制 从DNA到蛋白质，小分子核酸进入细胞后剪切mRNA使基因不能翻译