蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析

第十章蛋白质、多肽的氨基酸组成及序列分析

氨基酸是组成肽和蛋白质的基本单位,也是生物体维持生长所必需的营养物质，它们参与机体的代谢过程，具有广泛的生物活性和特殊的生理功能。在对肽和蛋白质的结构和功能进行研究时，往往需要将其进行完全水解，测定其氨基酸的组成；生物体内游离氨基酸在神经信息传递、代谢的调节以及肽、蛋白质的合成等生理过程中起着重要作用，为了了解其生理功能及某些外源性刺激对其功能的影响，也需要对生物体液、细胞或组织内的游离氨基酸进行分析。除了氨基酸总量测定外，往往更需要对个别氨基酸进行分析。常用的氨基酸分析方法可归纳为两类：衍生化间接分析法和无需衍生化的直接分析法。

蛋白质的一级结构即蛋白质中多肽链中氨基酸的排列顺序，既是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，又有助于蛋白质的基因结构的研究。在某些特定情况下，基因突变常常导致蛋白质中氨基酸的序列发生改变，从而引起功能失调和疾病产生。因此，测定蛋白质的氨基酸序列对新的诊断学方法开发、新的治疗方法建立以及多肽类药物的研究均有重要的意义。

§10. 1 氨基酸的衍生化间接分析法

无论是游离氨基酸还是水解氨基酸的测定，由于多数氨基酸都缺少结构检测特征，既无紫外吸收，又无荧光，必须使之衍生，转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质才能检测分析。

§10. 1. 1 氨基酸的衍生化反应

为了使测定氨基酸的方法灵敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是关键步骤之一。近年来人们致力于开发灵敏度高、衍生操作简单、形成的氨基酸衍生物稳定的衍生化试剂。常见的衍生化试剂有茚三酮、邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、异硫氢苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。

茚三酮在酸性（pH = 3 ~ 4）和加热条件下与氨基酸反应生成氨、二氧化碳和蓝－紫色的复合物（最大吸收波长为570 nm）：

(10.1)

除了α-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物质，但无二氧化碳生成，β-，γ-，δ-和ε-氨基酸比α-氨基酸反应慢得多，生成的是蓝色物质，而亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应形成黄色化合物（最大吸收波长为440 nm）。氨基酸与茚三酮的反应主要用于柱后衍

生，也可用于氨基酸的比色分析，是公认的氨基酸总量的定量方法。在定量分析时，必须除去对测定有干扰的蛋白质、氨和尿素。

邻苯二甲醛（OPA ）与巯基试剂，通常与β-巯基乙醇连用，在碱性条件下与第一级氨基酸迅速反应生成1－硫代－2－烷基异吲哚，加成物可产生荧光，在紫外区也有较强的吸收，反应式如下：

(10.2)

该反应不仅适用于柱前衍生，也适用于柱后衍生，它既可进行高灵敏度的荧光检测（λex = 340 nm ，λem = 450 nm ），检测限达1210

-～1510-mol L -1，也可进行一般的紫外检测（最大吸收波长为230 nm ），检测限达5?1210-mol L -1。紫外检测的线性范围为10 ~ 200 pmol ，荧光为0.8 ~ 15 pmol ，OPA 本身不干扰分离和检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也比较平稳。OPA 法主要的缺点是：（1）亚氨基酸不能与其直接反应，需先氧化（如用次氯酸钠）开环后才能反应。（2）荧光产物不稳定。

丹酰氯（Dansyl-Cl ）在碱性条件下与氨基酸反应生成强荧光物质，它同一级、二级氨基酸都能起反应，但是反应速率比较慢，在室温条件下需35 min 左右，反应产物的转化率与反应时间关系较大，反应温度升高可以加速产物转化，但最高不可超过60℃，否则Dansyl-Cl 会发生水解，反而使产物转化率降低。

(10.3)

Dansyl-氨基酸在酸性条件下（pH = 2 ~ 3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的Dansyl-Cl 的反应副产物Dansyl-OH 留在水相，干扰因素减小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-丝氨酸和Dansyl-苏氨酸则大部分或部分留在水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。

Dansyl-Cl 法的检测限与OPA 法相当，线形范围一般在15 ~ 150 pmol 。优点是（1）衍生物比较稳定，一般可放置12 ~ 24 h ；（2）Dansyl-Cl 胱氨酸衍生物线性关系好，可用于体液中胱氨酸的定量测定。缺点是（1）反应时间必须严格控制；（2）衍生物对紫外光照比较敏感，故反应要在避光条件下进行；（3）易生成多级衍生物，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸生成二级衍生物。

异硫氰苯酯（PITC ）可以和一级、二级氨基酸反应，在室温条件下仅十分钟即可完成，反应产物具有紫外吸收（最大吸收波长为254 nm ）。PITC 的衍生物单一、稳定，-20 ℃可贮

存数月，4 ℃水溶液可保存3天; 分析时间短,结果准确,紫外检测限可达1 pmol 。 +N C S NH 2CH R COO NH C S NH CH COO

R (10.4)

PITC 法最大的缺点就是氨基酸衍生时需要真空干燥以除去过量试剂。

氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl ）能与一级、二级氨基酸的氨基反应，生成的衍生物可用荧光检测（λex = 260 nm ，λem = 310 nm ），FMOC-Cl 与氨基酸反应迅速，实温下约30s 即可完成。反应产物稳定，在4 ℃避光条件下可储存13天，在酸性条件下也可稳定30小时以上。反应有很高的灵敏度，检测极限为1 pmol ，色谱分离中有很好的分辨率和分离速度。该法最大的优点是不受样品基质的干扰。

+NH 2CH R COO

NH CH COO R CH 2O C Cl

O CH 2O C O (10.5)

FMOC-Cl

法最大的缺点是（1）与His 形成单、双衍生物的比例不稳定，影响定量。（2）FMOC-Cl 在衍生过程中易产生试剂的水解反应，过量的FMOC-Cl 及其水解产物均有和FMOC-氨基酸类似的荧光，可用戊烷抽提去除干扰，但抽提效率约为70%，只能除去部分干扰；另一种方法是采用1-氨基金刚烷与过量的FMOC-Cl 试剂反应，生成的衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰，这就排除了试剂峰的干扰。

2、4—二硝基氟苯（FDBN ）在碱性条件下（pH = 9.5）与氨基酸或肽的游离氨基反应生成黄色的二硝基苯酚（DNP ）的衍生物。反应速率较慢，在50℃暗处需要60分钟左右。DNP-衍生物避光条件下比较稳定，在室温避光条件下可保存7天，在4℃条件下可保存30天。FDBN 能与一级、二级氨基酸反应，DNP-衍生物的检测波长为360 nm, 最小检出量可达10 pmol 。不足之处是与谷氨酸的衍生化反应较慢。

(10.6)

荧光胺本身没有荧光，但是在碱性条件下，它与伯胺反应形成具有荧光的产物（最大激发波长为390 nm ，最大发射光波长475 nm ），衍生化产物的荧光强度决定于反应系统的pH 值，在pH = 9时，荧光最强，而在pH = 7.4时，只有很低的荧光强度。由于这一反应在室温条件下几秒内即可完成，而过剩的试剂在几秒钟内就会被分解，不干扰测定。由于荧光胺在水溶液中不稳定，必须用丙酮配制。荧光胺不能与仲胺如脯氨酸和羟脯氨酸反应，除非他们与N-氯代琥珀酰亚胺作用转变为伯胺。

(10.7)

伯胺荧光胺（无荧光）荧光产物

荧光黄异硫氰酸苯酯（FITC），在pH 9 ~ 10范围内与一、二级氨基酸在室温条件下避光反应12 h，生成具有荧光的产物（最大激发光波长为490 nm，最大发射光波长为518 nm）。过量的试剂不干扰分离，反应液可直接进样分析。衍生化产物单一、稳定，在室温条件下可放置一天。

(10.8)

FIC-氨基酸

6－氨基喹啉基－N－羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（ACQ），在pH 8.2 ~ 10.0范围内与一、二级氨基酸迅速反应（除了Tyr需加热到50℃），生成的衍生物具有紫外吸收（最大吸收波长为248 nm）和荧光（λex/λem = 245 nm /395 nm），过量的试剂将快速水解，衍生化产物单一、稳定，在室温条件下可放置一周，在4℃条件下可保存两周。反应液可直接进样分析。紫外检测的检测限可达pmol，荧光检测的检测限可达40 fmol。

HN

R1

R2

+

N

N O

H

N

O

O N

N N

O

R2

H

N

O

O

HO

R1

+

氨基酸 ACQ 衍生氨基酸NHS(10.9)

N

NH

N

O

HO

+

N

N O

H

N

O

O

2

+CO2 ACQ AMQ NHS

O

(10.10)

N －羟基琥珀酰亚胺－3－吲哚乙酸酯（S ⅡA ），是一种较新的衍生化试剂，在pH 8.0 ~ 9.5范围内，室温条件下与一、二级氨基酸反应1小时左右（低温对该衍生反应有利，但温度太低，反应时间过长），生成荧光衍生物（λex /λem = 278 nm / 355 nm ），过量试剂不需预先除去，干扰较小，反应液可直接进样进行色谱分析，检出限可达pmol 。 HN R 1

R 2N O O HO +

N O O O O CH 2N N CH 2N + R 2R 1

(10.11)

氨基酸 S ⅡA 衍生氨基酸 NHS

还有一些其他的衍生试剂如3－对羟基甲酰喹啉－2－甲醛（CBQCA ），试剂本无荧光，在pH 9 左右与一级氨基反应生成稳定的强荧光吲哚衍生物（λex /λem 为 450 nm/550 nm ），冰箱中可保存2周。最低检测限可达5 fmol 。N －羟基琥珀酰亚胺－α－奈乙酸酯（SINA ）， pH 8.9时与一、二级氨基酸在室温条件下反应45分钟生成具有紫外吸收（λmax = 280 nm ）的衍生物。该衍生物稳定，检测限可达 pmol 。4－氟－7－硝基苯并－2、1、3－噁二唑（NBD-F ）在 pH 8、60℃条件下与一级和二级氨基反应2 min ，然后将pH 调至1生成强荧光衍生物（λex /λem 为470 nm / 530 nm ），最低检测限可达 fmol 。

§10. 1. 2 氨基酸的毛细管电泳分析法

毛细管电泳(CE)具有微量、灵敏和柱效高的特点，适合于复杂样品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。分离各种氨基酸衍生物的缓冲液常为磷酸、硼酸或混合液，也可在 SDS 胶束溶液中加入甲醇、四氢呋喃或尿素等以改善分离度。除了可进行柱前衍生化，还可以进行柱内和柱后衍生化。检测方式可用UV 检测，但大部分采用激光诱导荧光检测器（LIF ），激发/

发射波长常用325 / 550 nm 和488 / 525 nm ，可检测到 amol 甚至 zmol 水平的量。可用于测定肽或蛋白质经 Edman 降解后的氨基酸以及生理氨基酸。

人体体液中生理氨基酸的水平及其改变，不仅受年龄营养状况的影响，而且与某些疾病如肝病、肾病以及先天遗传代谢性疾病等密切相关。为了研究不同疾病状况下氨基酸的代谢情况，需要一种快速测定氨基酸方法以满足其需要。以区带毛细管电泳为分离模式的高效毛细管电泳为快速测定血清中氨基酸提供了有效手段[1], 见图10.1。

图10.1 人血清中氨基酸和内标的毛细管电泳图谱

样品预处理：0.5 ml血清加内标（10 mmol L-1 D-正白酸）20μl，加乙腈1.5 ml，涡旋30s，放置10 min后，15000 g离心10 min，上清液备用或置于-20℃保存。

衍生化：待测标本的上清液或氨基酸的标准溶液1 ml，加0.5 mol L-1 pH 9.5硼酸钠缓冲溶液1 ml，加乙腈1 ml , FDBN 20μl，摇匀，在50℃水浴加热40分钟。

分离条件：（1）操作缓冲液的组成：0.03 mol L-1 pH 9.8四硼酸钠缓冲液∶异丙醇∶30% Brij = 825∶150∶25。（2）开口石英毛细管：总长度为370 mm，有效长度为300 mm，内径为75μm。（3）电压：28 KV。（4）温度：15℃。（5）进样：压力进样5 s。（6）UV检测波长：360 nm。

该方法在8分钟内可分离血清中16种氨基酸，如图10．1所示，氨基酸的线性范围10 ~ 700 μmol L-1，最低检测限为2.5 ~ 7.9 μmol L-1，回收率为86.3 ~ 107.4%。

利用FITC柱前衍生-毛细管电泳-激光诱导荧光测定大鼠大脑皮质氨基酸类神经递质含量，如图10.2所示，可用于研究大鼠脑缺血时黄芩甙的药理作用。结果显示大脑缺血时，大脑皮质的Glu, Asp, GABA和Gly浓度升高，而黄芩甙可降低Glu和Asp 的浓度，对脑缺血有保护作用[2]。

样品处理：取大鼠大脑皮质绞碎，以5∶1(w/v)加入15 mmol L-1硼酸缓冲液（pH 9.2）匀浆20 min, 然后加入等体积的氯仿剧烈振摇15 min 去蛋白，20000 rpm 离心20 min，取上清液衍生化（或在-70℃保存）。

衍生化：50 μl去蛋白的样品，加400 μl的硼酸缓冲液（5 mmol L-1，pH 9.6），加50 μl 90 mmol L-1 FITC丙酮溶液，在20 ℃避光反应16小时，进样前用操作缓冲液10倍稀释。

图10.2 对照大鼠大脑皮质匀浆的毛细管电泳图谱

分离条件：（1）未涂渍石英毛细管柱，总长度为570 mm，有效长度为500 mm内径为75 μm。（2）毛细管的平衡：用操作缓冲液冲洗前用0.1 mol L-1 NaOH和去离子水冲洗。（3）操作缓冲液的组成：15 mmol L-1硼酸缓冲液（pH为9.2）。（4）电压：17.5 kV。（5）温度：25℃。（6）进样：采用压力方式进样5s。（7）检测器：488 nm Ar+激光诱导荧光检测。

该方法六种氨基酸的检测限为2.1×10-11 ~ 6.3×10-10 mol L-1，回收率为97.1 ~ 102.6 %，是一种快速、有选择性和灵敏的测定大鼠大脑皮层氨基酸类神经递质含量的方法。

§10. 1. 3 氨基酸的反相高效液相色谱分析法

反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析衍生化的氨基酸混合物具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点。将氨基酸进行柱前衍生的关键在于衍生剂的选择，选择标准是

能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种衍生物且有一定的稳定性，操作简便，不产生或易于排除干扰物，色谱分离的分辨率高，检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化或使衍生物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。

衍生后的氨基酸一般在高效烷基键合C18或C8柱上，根据液液分配原理进行分离，流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，乙醇、甲醇或四氢呋喃为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性混合物的特点，故除改变调节剂外，还可通过调节缓冲液的pH值，离子强度，柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。

利用OPA柱前衍生-反相高效相色谱分离-荧光检测的分析方法测定大鼠脑组织中分区氨基酸类神经递质含量，如图10.3。结果可见兴奋性氨基酸，尤其是谷氨酸在脑内的含量相对较高[3]。

图10.3 大鼠大脑海马的氨基酸的色谱图

样品预处理: 分别取大鼠大脑皮质、海马、小脑和纹状体，以1∶9 (w/v) 加人生理盐水，手动玻璃匀浆器冰浴匀浆；匀浆液在3 000 rpm min-1 4℃低温离心15 min，取上清液0.5 ml，加0.4 mol L-1高氯酸1 ml 去蛋白，同时加内标高丝氨酸液（Hse, 1 mmol L-1）50 μl，混匀，3000 rpm min-1 4℃低温离心15 min，取0.5 ml上清液，加2 mol L-1 K2CO3溶液1 ml，用0.1 mol L-1 K2CO3溶液稀释到5 ml，14000 rpm min-1 4℃低温离心20 min，取上清液衍生化。

衍生化反应：将13.4 mg OPA 溶于1 ml无水乙醇中，加入20 μlβ-巯基乙醇，加4 ml 0.1 mol L-1硼酸缓冲溶液（pH 9.6），每日补充20 μlβ-巯基乙醇以维持巯基强度，可使用1周。预处理好的样品40 μl加入OPA衍生液20 μl轻轻混匀，室温静置2 min，进样20 μl。

分析条件：色谱柱为Hypersil ODS-3（4.6×250 mm, 5 μm），流动相：磷酸二氢钾缓冲液(0.1 mol L-1，pH 6.0)∶甲醇∶乙腈体积比为6∶3∶1，流速1 ml min-1，柱温40℃，荧光检测激发波长为340 nm，发射波长为455 nm。

这几种氨基酸在0.5 ~ 40 μmol L-1浓度范围内相关系数在0.997 ~ 0.999之间，具有较好的线形关系。当信噪比为3时，各氨基酸的最小检测限在0.01~0.02 μmol L-1范围。

§10. 1. 4 氨基酸分析仪

早在20世纪40年代初，人们便开始用色谱法分析氨基酸。第一台氨基酸分析仪是spackman、Stein和Moore在1958年以离子交换色谱仪为基础建立的。此后，该类仪器在关

键部件以及分析速度、灵敏度和自动化程度上都得到了突飞猛进的发展。至80年代中，一个蛋白水解液分析只需30分钟，灵敏度可达pmol级。80年代后液相色谱、特别是键合反相分配色谱及柱前衍生技术的发展又给氨基酸分析仪的发展注入了新的生机与活力。目前，离子交换色谱在氨基酸分析中仍占主导地位，被国内外公认为最准确可靠的分离测定手段，而柱前衍生高效液谱法也已成熟，进入了实用阶段。

§10. 1. 4. 1 离子交换色谱氨基酸分析仪

离子交换色谱氨基酸分析仪又常被称做专用(自动)氨基酸分析仪。其基本原理是：先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上分离，然后将分离的氨基酸衍生，根据衍生产物的特性选择适当的检测器检测，并进行定性、定量分析。

1．离子交换树脂专用氨基酸分析仪都是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料的。该树脂又是由苯乙烯和二乙烯基苯聚合后磺化而成的。苯乙烯是主要成分，二乙烯苯是交联剂，离子交换的活性基团—磺酸根即联在苯乙烯乙烯基的对位上。交联剂的百分含量(交联度)影响着树脂内部网状结构的孔径大小，交联剂多，分子结构紧密，孔径就小，适合分离分子量较小的离子。反之，交联剂少，网状结构孔径大，适合分离分子量大的离子。一般氨基酸分析仪采用的离子交换树脂交联度多为8 ~ 12%，目前各国各厂商的离子交换树脂因所用的二乙烯基苯的纯度、类型(如邻、对位异构体等)、磺化程度及其范围虽不尽相同，但均是球状的，粒度一般在5 ~ 10 μm之间。

2．分离氨基酸属两性电解质，其所带电荷随pH或离子强度而改变。在酸性溶液中(即pH在等电点以下时)，呈正离子态，可被离子交换树脂表面的磺酸基团所吸引而附着在树脂上，随pH上升或离子强度增大，吸引力即会下降乃至消失而被洗脱下来。不同的氨基酸等电点、极性及分子大小不同，洗脱顺序也不相同。一般酸性和带羟基的氨基酸先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。在同类氨基酸中，短碳链小分子的先洗脱出来，长碳链大分子的后洗脱出来(如甘氨酸先于丙氨酸，缬氨酸先于亮氨酸)。而碳原子数相同的氨基酸，有支链的先洗脱出来(如异亮氨酸先于亮氨酸，亮氨酸先于正亮氨酸)，碳链上的羟基基团可加速洗脱(如丝氨酸先于丙氨酸、羧脯氨酸先于脯氨酸、酪氨酸先于苯丙氨酸，羟基赖氨酸先于赖氨酸)。

氨基酸分离不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响，还受色谱柱的长度、截面积、柱温和洗脱缓冲液的阳离子类型、pH值、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响。特别需要指出的是洗脱液的阳离子类型，如Na+型缓冲液变化pH值和离子强度等，虽能很好的分离各种蛋白水解氨基酸，却不能将天门冬酰胺、谷氨酰胺和一些相关的氨基酸分离开来，因此在生理体液分析中除要改变柱长、调节柱温外，还必须将Na+缓冲体系改换成Li+缓冲体系。

3．衍生与检测

常用的衍生法是茚三酮法（紫外检测）和邻苯二甲醛法（荧光检测）。

4．仪器的结构与流程

典型的氨基酸分析仪如日立(Hitachi) 835或Beckman l2l MB等一般采用3 ~ 5种不同pH 值的缓冲液。缓冲液经加热脱气后，按时间切换，顺序用泵输送到色谱柱上，使由进样系统定量注入的氨基酸混合物逐步分离。分离后的氨基酸与另一台泵输送出的茚三酮混合，经反应槽加热完成衍生，进入紫外可见光分光光度计检测。或分离后的氨基酸先与次氯酸钠混合，氧化开环后与OPA反应，以荧光计检测。检测后得到的信号，放大后再送至记录仪，积分仪

或其它数据处理系统。如图10.4所示。

目前生产的氨基酸分析仪多是单柱的，色谱柱有不锈钢或玻璃的，内径1.75 ~ 5 mm，柱长15 ~ 30 cm之间。由于氨基酸的最佳分离应在适当的温度（30 ~ 37 ℃）才能获得，故色谱柱通常都装有循环水的夹套，由水浴的循环水控制温度在 0.5 ℃。

专用型氨基酸分析仪的发展主要体现在柱系统的变化和仪器的自动化、电脑化，柱系统的变化首先体现在树脂粒度的变化，以从20 μm以至3 μm。其次内径缩小，从6 mm降至3 mm 乃至1.75 mm，加之高压泵的设计利用及显色温度的提高，使分析灵敏度和速度均有较大的提高，灵敏度以由nmol 级降至pmol级，分析速度提高了5 ~ 8倍。仪器的全自动化和电脑化使操作更加方便。

图10.4 氨基酸自动分析仪的基本结构与流程

1－缓冲液脱气系统；2—缓冲液选择阀；3—泵；4—压力表；5—进样器；6—色谱柱；

7—程序仪；8—混合室；9—反应器；10—荧光计或光度计；11—记录仪；12—积分仪

§10. 1. 4. 2 反相色谱氨基酸分析仪

专用氨基酸分析仪发展到20世纪80年代中期，其分析速度与灵敏度进一步的提高，受到树脂粒度及柱后衍生等的严重制约。然而反相键合色谱和柱前衍生技术的发展给氨基酸分析开辟了另一领域。反相色谱分析仪与专门的氨基酸分析仪相比，更灵敏（可达fmol级）、快速（完成一个蛋白水解液分析仅需13 ~ 30分钟）、仪器投资少且可一机多用，目前有不少

厂家推出了配套的技术与仪器。

1、仪器结构

反相分配色谱测定氨基酸可分为在线衍生或机外衍生两种类型，但无论那种类型所用仪器均为通用高效液相色谱仪。一般说来，只要有二元泵、高效柱（粒度3-4 μm，理论塔板数>70 000），能进行梯度淋洗并有适当的检测器（紫外可见光或荧光光度计）即可。

表10.1 柱前衍生HPLC各衍生方法的比较

OPA FMOC-Cl PITC FDNB Dansyl

衍生时间（min）<1 <1 1 ~ 10 60(60℃) >30

衍生物稳定性低高高高较高

与二级胺反应不能能能能

衍生操作很简单较复杂较复杂较复杂简单

去除过量抽干不必不必需要需要不必

试剂溶剂提取不必需要不必不必不必

干扰性副反应无无无有有

色谱分析蛋白水解液20 25 20 30 20

时间生理体液50 70 60 60 60

检测荧光/紫外荧光/紫外紫外紫外荧光

灵敏度fmol fmol pmol pmol pmol

线形范围，pmol 0.3 ~ 15 0.1 ~ 5 50 ~ 200 5 ~ 200 15 ~ 150

0 ~ 200 5 ~ 200

CV% 0.4 ~ 2.2 1.9 ~ 4.6 2.6 ~ 5.5 1 ~ 3.2 1.5 ~ 4.1

表10.1列出了一些常用的柱前衍生HPLC法的主要特点。目前不同的仪器厂家所推荐配套的方法各不相同，如Agilent和Gilson公司用OPA-FMOC结合法、LKB公司则由用户从OPA、FMOC和PITC等法中任选, Waters公司使用的是PITC法(即PICO·TAG○R方法)和AccQ·Tag TM法。

2．应用[4,5 ]

Waters公司PICO·TAG○R氨基酸分析法是由样品的水解，衍生和分离等条件集结而成。PICO·TAG HPLC是由PICO·TAG○R水解衍生工作台和HPLC系统构成。PICO·TAG○R水解衍生工作台对样品的水解和衍生有良好的效果，进行水解时的温度控制、样品的干燥、衍生反应试剂的去除、真空操作、氮气置换等工作。以PITC作为柱前衍生化试剂，采用反相色谱的原理进行氨基酸分析，分离柱为PICO·TAG○R专用柱，用梯度洗脱的方式洗脱，检测波长为254 nm，蛋白水解的17种氨基酸可在12分钟内完成分离（见图10.5所示）。此外，PICO·TAG○R方法灵敏度高，检出限可达1 pmol。

Pico·Tag○R方法测定体液游离氨基酸的方法如下:

（1）HPLC仪（Waters），510泵，490E全波长可见-紫外检测器，PICO·TAG色谱柱，PICO·TAG水解衍生装置，810色谱工作站。

（2）试剂

流动相：A：0.07 mol L-1醋酸钠，2.5 mmol L-1 EDTA，pH 6.5。B：乙腈∶水∶甲醇为4.5∶4∶1.5。

内标液：称取蛋氨酸砜113.2 mg，用25 ml 0.1 mol L-1 HCl稀释后，再稀释10倍使内标浓度为2.5 mmol L-1。

图10.5 蛋白质水解后PITC衍生氨基酸样品250 pmol的分离结果衍生试剂：异硫氰酸苯酯∶甲醇∶三乙胺∶水为1∶7∶1∶1，临用前配制。

样品稀释液：取0.71g磷酸氢二钠，加超纯水溶解至1 000 ml，用10 % 磷酸乙腈液（95∶5）调pH至7.4。

（3）标准溶液和体液标本的制备

氨基酸混合标样：取2.5 mmol L-1的酸性、中型氨基酸标样10 μl，2.5 mmol L-1碱性氨基酸标样10 μl，2.5 mmol L-1内标液20 μl，加0.1 mmol L-1 HCl 100 μl，摇匀。

血清标本：取清晨空腹血1 ml，离心后取血清100 μl，加入20 μl内标液充分混匀，用离心式超滤法除蛋白，超滤液于-20 ℃保存备用。

（4）衍生反应：取制备好的氨基酸混合标样或体液标本20 μl，加入20 μl 衍生试剂在室温反应20分钟，抽干加入100 μl样品稀释液，充分溶解后直接进样。

（5）色谱条件：柱温：46 ℃。流速：1 ml min-1。检测波长：254 nm。进样量：10 μl。进样后按照下列程序进行梯度洗脱：

时间（min）0 13.5 24.0 30.0 50.0 62.5 67.0

A液（%）100 97.0 94.0 91.0 66.0 0 100

结果表明：该方法可将血清中常见的游离氨基酸分离，如图10.6所示。氨基酸浓度在10 ~ 1000 μmol L-1之间线性关系良好，相关系数在0.994 ~ 0.999之间，信噪比为2时，血清游离氨基酸最低检测浓度为2 μmol L-1。

Waters公司的AccQ·Tag TM氨基酸分析法，采用AQC作为柱前衍生试剂，比PICO·TAG （R）法快速、灵敏，提高了定量的准确度，水解氨基酸的检测限低于1 pmol。AccQ·Tag TM 氨基酸分析法只需HPLC仪和AccQ·Tag TM化学包（AccQ·Tag TM试剂盒和Nova-Pak○R C18 4 μm柱）。采用AccQ·Tag TM法分析水解氨基酸如图10.7所示。

Agilent公司的氨基酸分析方法，运用了可靠的衍生化反应和分析技术。利用自动进样器实现在线衍生化与HPLC相结合，氨基酸与OPA和FMOC发生反应，然后进行色谱分析。酸水解后的蛋白质、多肽样品在pH 10.2的缓冲液中可以直接衍生化。在3－巯基丙酸（3-MPA）存在下一级氨基酸首先与OPA反应，二级氨基酸不和OPA反应，然后再用FMOC 进行衍生。加入的吲哚与3-MPA相结合可降低氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化产物比PMOC衍生化产物的色谱出峰时间更早。过量的FMOC及其降解产物在二级氨基酸后出峰，

不会干扰分析，分析过程快速、准确、灵敏且重现性好。

图10.6 血清游离氨基酸色谱图

图10.7 AccQ·Tag TM法分析水解氨基酸的色谱图

柱：Nova-Pak R C18 3.9×150 mm, 4 μm; 柱温：37 ℃；流动相A: AccQ·Tag TM流动相；流动相B：乙腈; 流动相C: 超纯水; 流速：1 ml min-1; 梯度：AccQ·Tag TM方法；检测: 荧光检测激发波长为250 nm，发射波长为395 nm。

§10. 2 氨基酸直接分析法

氨基酸直接分析法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测，不需将氨基酸进行衍生。1999 年Clarke 等人发展了一种积分脉冲安培检测波形。用积分脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱，无需衍生，可以直接分离测定氨基酸，对大多数氨基酸的检测限小于l pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。

§10. 2. 1 阴离子交换分离

氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这就是氨基酸直接分析方法的基础。氨基酸直接分析用薄壳阴离子交换树脂为固定相，阴离子交换树脂含有的碱性基团－N(CH3)3OH (强碱性)或－NH3OH (弱碱性)，可以解离出OH－，能与溶液中的氨基酸阴离子发生交换。氨基酸与树脂的亲合力主要取决于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸烷基侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用和氨基酸的空间构型。在pH 12 ~ 13 条件下，氨基酸与阴离子交换树脂之间的静电吸引的大小

次序是：酸性氨基酸> 中性氨基酸> 碱性氨基酸。因此，氨基酸的洗脱顺序大体是碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸。

通常碱性溶液为流动相，其中氢氧化钠不仅提供洗脱离子OH－，而且碱性pH条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac－）对阴离子交换树脂的亲力大于OH－，是一种较强的洗脱离子，它对于极性较小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。

§10. 2. 1 脉冲积分安培检测

用于氨基酸检测的安培检测器通常采用金工作电极、Ag/AgCl参比电极和钛对电极。在pH 12 ~ 13 溶液中，在金工作电极和Ag/AgC1 参比电极之间施加一个较高的电位，α一氨基酸在金电极表面被氧化，大多数氨基酸开始先被氧化为亚胺(1)，然后进一步氧化为腈基化合物(2)，另外，少量的亚胺发生水解生成醛类化合物(3)。反应过程如下：

R-CH(NH2)COO一→R-CH=NH + H+ + 2e (10.12)

R-CH=NH →R-CN + H+ + 2e (10.13)

R-CH=NH + H2O →R-CHO + NH3 (10.14)

氨基酸的脂肪侧链抑制氨基酸的氧化反应(如亮氨酸和异亮氨酸)，而氨基酸侧链中的羟基(丝氨酸和苏氨酸)、酰胺基(天门冬氨酸)和咪唑基(组氨酸)有利于这些氨基酸的氧化反应。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位已超过金表面被氧化的电位。在高电位时，金电极本身形成表面氧化层和氨基酸氧化产物的附着，金电极会很快失效。金电极表面氧化时所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。而脉冲电化学检测器就解决了这一问题，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分氧化成氧化金，再加一个大的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每0.5 ~ 1s 循环一次。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位超过金表面氧化的电位，金电极表面氧化所产生的电流无疑会增加背景和基线嘈声以及基线的不稳定性。为此，1989年Johnson 等人[6]引入了一种新的技术—积分脉冲安培。与脉冲安培相似，积分脉冲安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的，而是在高-低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生，在高电位时所形成的氧化金在低电位时被还原，因此由积分整个高-低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。

检测氨基酸的积分安培电位波形如图10.8所示，由六步组成，分为三个区，E1 和E2 为吸附/引发区；E3 和E4 为电流积分区；E5和E6为清洗/活化区。吸附步骤的施加电压E1一般为负电位，其大小和持续时间影响吸附氨基酸的灵敏度，导致吸附氨基酸和非吸附氨基酸的响应因子的扩大，影响碱性氨基酸的线形范围。必须控制E1的持续时间，一般小于40 ms。E2 提供一个可以开始积分而氧又不会被还原的电位。开始积分之前在E2的延迟时间允许充电电流减弱，短的延迟时间可减小由于醋酸钠梯度所引起的色谱基线改变以及不同氨基酸响应因子的差距，E2 的推荐时间为60 ms。为了获得最高灵敏度，亦应为负电位（-0.05 V），使金电极完全还原，同时氨基酸的吸附在较低的速度下继续进行。开始积分时，第一积分电位E3 上升到足以氧化氨基酸和电极表面被氧化的正电位，应大于0.20 V，最佳值在0.25 ~ 0.30 V 之间。受金电极氧化的限制，不宜太高，否则背景和噪音将增加。在第二积分电位E4，积分电位由E3 降到E4（积分开始前的电位），此时氧化金的还原电荷将抵消金氧化的电荷，氧化金的还原

比氧化快，为了实现背景补偿，电位 E 4（-0.05 V ）的时间不必像电位E 3 那样长，总的积分时间约为 450 ms （E 3 为 290 ms ，E 4 为 140 ms ）。积分完毕后，立即将电位降至清洗电位 E 5（-2V ），对电极进行清洗，然后迅速升高电位至活化电位 E 6（+0.6 V ），再立即回到初始电位 E 1，从而完成一次积分周期，总的信号值决定于高低电位之间的电流积分值。

图10.8 测定氨基酸的积分安培电位波形图

§10. 2. 2 应用

美国Dionex 公司的氨基酸直接分析仪的色谱条件如下：

分离柱：AminoPac PA10 (250 mm × 2 mm i. d ．)，温度：30 ℃，流速：0.25 ml min -1，进样体积：25 μl ，检测方式：积分脉冲安培检测器（IPAD ），Ag/AgCl 参比电极，金工作电极。水解产物中氨基酸分析的梯度洗脱条件如下

Time Water 0.25 mol L -1 1.0 mol L -1

(min) (%) NaOH (%) NaAc (%) Curve

进样 0.0 90 10

2.0 90 10

5.0 85 15 8

8.0 64 36 8

11.0 64 36

18.0 40 20 40

21.0 44 16 40 8

23.0 14 16 70 8

42.0 14 16 70 8

42.1 20 80 5

44.1 20 80

44.2 90 10 5

74.0 90 10

梯度曲线的形状是按照美国Dionex 公司GS 50 梯度泵的使用手册No.031612第二稿的定义。

此方法已用于分析氨基酸注射液[7]（用去离子水分别稀释 l 000倍，经过0.45 μm 滤膜过滤），所得色谱图见图10.9。氨基酸的检出限为0.3 ~ 10.3 pmol ，线性范围约为2个数量级,样品加标回收率为 88.3 ~ 104.6％。

时间（s ） 电势（V ） 积分

0.0 -0.20

0.04 -0.20

0.05 -0.05

0.11 -0.05 开始

0.12 +0.28

0.41 +0.28

0.42 -0.05

0.56 -0.05 结束

0.57 -2.00 0.58 -2.00

0.59 +0.60

0.60 -0.20

图10.9 氨基酸注射液样品(稀释1 000倍) 色谱图

1.Arg.

2.Lys.

3.glucose.

4.Ala.

5.Thr.

6.Gly.

7.Val.

8.Ser.

9.Pro.10.Iso.11.Leu.12.Met.13.His.14.Phe.15.Glu.16 Asp.

17.Cys.18.Tyr.

§10.3 氨基酸的液质联用分析

液质联用技术已成为分离、鉴定各种化合物的重要手段之一。液质联用弥补了传统液相检测器的不足，它集LC 的高分离能力和MS的高灵敏度、高选择性于一体。液质联用技术在分析各种复杂生物基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中的氨基酸时，由于其选择性强、灵敏度高，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定以往难于辩识的痕量氨基酸，尤其是串联质谱(MS/MS)的应用，通过多反应监测(MRM)，可以大大提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度。同时，利用碰撞诱导解离(CID)可将化合物的分子离子或准分子离子打碎，通过中性丢失扫描、母离子扫描和子离子扫描，并与原型氨基酸结构信息相比较，即可鉴定出氨基酸代谢产物的结构。

甲状腺素是碘化酪蛋白的主要活性成分，但甲状腺素并不以游离的方式存在，而是以氨基酸残基或者以某种特殊的方式胶联于碘化酪蛋白中。动物饲喂碘化酪蛋白后能起到间接补充甲状腺素的作用。动物甲状腺分泌的甲状腺素有两种，即：3，3，5－三碘甲腺原氨酸(T3)和3，3，5，5－四碘甲腺原氨酸(T4)。其中T3的活性大约是T4的5倍，但含量较小，通常所说的甲状腺素是指T4。一碘酪氨酸(MIT) 和二碘酪氨酸(DIT) 是甲状腺素体内合成的前体物质。碘化酪蛋白是我国禁止在动物饲料和饮水中添加和使用的药物添加剂之一，但缺乏有效的检测方法。由于碘化酪蛋白并不是一种纯物质，直接测定非常困难。在国外衍生气相色谱法和高效液相色谱法曾依次被用来测定碘化酪蛋白、体液和甲状腺球蛋白中碘化氨基酸(甲状腺素)的含量，但都缺少相应的确证方法。LC/MS 具有灵敏度高，选择性强，分离、定量和确证一次完成等特点，使用LC/MS 技术，通过分离鉴定试样的水解产物中的三碘甲腺原氨酸和四碘甲腺原氨酸，并以一碘酪氨酸和二碘酪氨酸作为旁证指示碘化酪蛋白的存在，从而为监测碘化酪蛋白的使用提供了依据。

样品制备：取100 mg 碘化酪蛋白于聚四氟乙烯消化管中，加入2 ml 13.5 mol L-1的氢氧化钠溶液，于振荡器上轻轻振动使样品被氢氧化钠溶液浸透，然后在110 ℃烘箱水解6 h。水解液用等物质的量的乙酸中和，定容于100 ml 容量瓶中，过0.45 μm 的滤膜。

采用Waters Symmetry Shield RP18 (3.9×150 mm, 5 μm )，用乙腈 B ( 0.1％的甲酸) 和水A (0.1％的甲酸)为流动相，0.8 ml min-1的流速(柱后分流0.2 ml min-1进质谱)，B从10％到50％

梯度洗脱40 min。以选择离子检测，见图l0.10[8]。质谱条件：采用扫描范围150 ~ 900 amu，毛细管电压3 kv，脱溶剂气300 L h-1，采用正离子( ESI’)式检测，锥孔压为40 V。SIR方式检测均采用准分子离子( M+1 )作为检测离子。

图10.10 样品的选择离子(SIR)色谱图

1. 3 - 一碘酪氨酸(MIT);

2. 3, 5 - 二碘酪氨酸(DIT);

3. 3, 5 - 二碘甲腺原氮酸(T2);

4. 3, 5, 3' - 三碘甲腺原氨酸(T3)；

5. 3, 3, 5' - 三碘甲腺原氨酸(rT3)；

6. 3, 3’, 5, 5'- 四碘甲腺原氨酸(T4)。

在本实验条件下，各种碘化氨基酸的断裂规律为脱羧、脱氨和脱碘，另外还形成溶剂加合峰，如表10.2和图10.11所示。其中T3、rT3 的质谱图无法区分，但可从保留时间得以确认。以选择离子m/z 652 和m/z 778 分别对三碘甲腺原氨酸和四碘甲腺原氨酸进行了测定，以外标曲线法定量，在样品浓度 2 ~ 15 mg L-1范围成线性（R均大于0.97）。

图10.11 一碘酪氨酸的二级质谱图

表10.2 碘化氨基酸的特征离子峰

碘化氨基酸特征离子（m/z）

加H+ （M+1）+ 加H+加乙腈

（M+42）+

脱氨

（M－16）+

脱羧

（M－45）+

脱氨脱羧

（M－143）+

MIT 308 291 262 164 DIT 434 417 388 290 T2526 509 480 382 T3652 693 635 606 508 rT3652 693 635 606 508 T4778 819 761 732 634

许多遗传代谢病与氨基酸代谢异常有关，且常常与多种氨基酸有关。因此，临床上需要一种能够同时检测血中多种氨基酸及其中间代谢产物的方法，以便应用于疾病的诊断和治疗。如尿素循环障碍、酪氨酸血症等，因缺乏常规的氨基酸分析，常常延误诊断和治疗。虽然氨基酸分析仪、高效液相色谱仪和毛细管电泳，能够检测氨基酸，但速度慢，测定一个样品需15 ~ 30 min，难于满足大规模的新生儿遗传代谢病筛查需要。液质联用特别适合于临床诊断研究，尤其是疾病的早期诊断, 欧美等国已将串联质谱广泛应用于新生儿遗传代谢病的筛查。

液质联用检测氨基酸通常采用盐酸正丁醇使氨基酸及其内标丁酯化。丁酯化的主要目的是使多种丁酯化的氨基酸，经过质谱仪时均能够丢失一个质荷比为102的中性分子，这样质谱仪通过m/z 102 中性丢失扫描方式，可检测到多种氨基酸，利于检测和分析, 如图10.12[9]。但是碱性氨基酸如Arg、Orn、Cit 和Gly 经碰撞后，产生的m/z 102 中性分子较少，故选用多反应检测方式检测。

图10.12 正常儿童氨基酸中性丢失( m/z 102 )扫描质谱图

样品处理法，将3 mm 干血滤纸片，置于96 孔过滤板中，每孔加入100 μl 含内标（各自的同位素氨基酸）甲醇液，室温放置20 min，然后将萃取液离心至96 孔聚丙烯板，55 ℃加热吹干，再加入60 μl 盐酸正丁醇(3 mol L-1)，Teflon 膜覆盖，置65℃恒温箱内15 min，55 ℃加热吹干，再加入100 μl 80％乙腈，铝膜覆盖，即可上样检测。

流动相采用80％乙腈，四元泵流速设置变速：140 μl min-1，0.2 min→30 μl min-1，1 min →300 μl min-1，0.2 min，每次取样20 μl。质谱仪采用两种扫描方法进行检测，中性丢失扫描和多反应检测。中性丢失扫描范围为m/ z 140 ~ m/z 280，所检测的丁酯化后的氨基酸及其对应的同位素内标质荷比如表10.3所示。多反应检测的离子对如表10.4所示，用于Gly、Om、Arg、cit 及其相应内标的测定。

表10.3 丁酯化后的氨基酸及其对应的同位素内标中性丢失(m/z 102 )后的质荷比

种类m/z 种类m/z 种类m/z 种类m/z

Ala 146.1 Len 188.2 Phe 222.2 Asp 246.2

D4-Ala 150.1 D3-Leu 191.2 D5-Phe 227.2 D3-Asp 249.2

Val 174.2 Met 206.1 Tyr 238.1 Glu 260.3

D8-Val 182.2 D3-Met 209.1 C6-Tyr 244.1 D3-Glu 263.3

表10.4 丁酯化后的氨基酸及其对应的同位素内标多反应检测特征离子对

种类Gly N1，C1-Gly Orn D2-Orn Arg D4，C1-Arg Cit D2-Cit 离子对132.1/76.1 34.1/78.1 189.2/70.2 191.2/72.2 231.2/70.2 236.2/75.1 232.1/113.1 234.2/115.2

根据质谱峰的m/z 进行定性。定量分析采用内标法定量，即由各种丁酯化的氨基酸及其同位素内标的离子峰强度的比值，以及内标的浓度计算。氨基酸批内和批间变异系数分别为6.3 ~ 9.7％、9.9 ~ 14.3％。低浓度回收率为92 ~ 100％，中等浓度回收率为94 ~ 104％，高浓度回收率为98 ~ 107％。不同浓度的氨基酸实测浓度与加入浓度之间的相关系数为0.9990～0.9999。

§10. 4 氨基酸立体异构体的手性色谱分析

生物体中的氨基酸除甘氨酸外，均具有手性中心，因此都有立体异构体。长期以来，人们认为高等动物体内只有L-型氨基酸，而D-型氨基酸只存在于低等物种，如微生物和细菌中。随着分析技术的不断提高和分析方法的发展，近20年来，从不同物种的生物体内发现了越来越多的D-型氨基酸以游离氨基酸、肽和蛋白质的形式存在，这些D-型氨基酸在动物体内的分布、来源、生理作用及其与疾病的关系倍受关注。例如，在眼的晶体、牙体和髓鞘质中发现有大量的D一天冬氨酸积聚；健康人的血液中也有极微量的D一氨基酸存在，且其含量与年龄相关，老年人比青年人水平显著增加，提示游离D－氨基酸与衰老有关。随着研究深入到分子生物学水平，人们发现来自核糖体的肽和蛋白质中有D一氨基酸残基的存在。这些微量的D 一氨基酸残基的存在被认为是由于与分子老化现象有关的消旋作用的结果，同时也表明来自核糖体某些特定部位的D一氨基酸残基的存在为其生物活性所必需。

人体中存在D一氨基酸，其含量一般较L一型低，随着检测技术的不断发展，检测极微量D一氨基酸已成为可能。对映异构体的分离要求分离技术具有高灵敏度、高选择性和高分辨率。HPLC和CE是氨基酸手性分析应用最多、最广泛的方法。

§10. 4. 1 氨基酸立体异构体的手性高效液相色谱法分析

高效液相色谱法分离氨基酸的手性对映体通常分为直接法和间接法两大类。直接法是用手性流动相( chiral mobile phase, CMP )或手性固定相(chiral stationary phase, CSP)来拆分对映体，间接法是将对映体混合物以手性衍生化试剂作柱前衍生，形成一对非对映体，然后以反相或正相色谱分离。二者的共同特点是：均以HPLC技术为基础，并引入不对称中心；不同的是：直接法是将不对称中心引入分子间，而间接法是引入分子内。

§10. 4. 1. 1 直接法

1. 手性流动相添加剂法

该方法是在流动相中加入手性添加剂（Chiral Additives，CA），CA与对映体通过静电吸引或氢键等非共价结合方式，形成可逆的不稳定的非对映体配合物，在非手性柱上实现氨基酸对映体的拆分。CA的加入还可以改善溶质的色谱行为、增加检测灵敏度。其优点在于不需要化学衍生，分析过程中较少发生消旋化；不需要特殊的固定相；CA的选择范围也较宽。但是系统平衡时间较长，添加剂消耗较大是其缺点。CMP添加法按CA的类型不同分为以下四种: （1）配体交换型手性添加剂手性配体交换络合剂(chiral ligand-exchange complexes, CLEC)应用较广泛。CLEC包括手性配体和二价金属离子，其中，手性配体多为光活性氨基酸(如L-脯氨酸、L-苯丙氨酸)或其衍生物，二价金属离子是具有空内层d轨道的过渡金属离子，(如Cu2+、Zn2+、Hg2+、Ni2+、Cd2+)等，二者形成鳌合物，以适当的浓度分布于流动相中，对映体可与之形成三元非对映体配位化合物。由于所形成的非对映体配位化合物热力学稳定性的差

异，导致在固定相上发生的立体选择性吸附反应性的差异，使对映体得以分离。使用CLEC的研究报告很多，如Schmid等[10]以L-4-羟脯氨酸一铜(Ⅱ)添加到流动相中，分离了甲基化的氨基酸对映体。

（2）手性离子型络合剂手性离子对添加剂、蛋白质类添加剂、动态手性固定相、二性配对色谱等。Petersson等[11]以20 mmol L-1人血清白蛋白(HSA)加于磷酸缓冲液流动相中，以C2柱分离了色氨酸对映体，以C18柱分离了2一苯氧基丙酸，均获良好结果。

（3）基于手性包合作用的添加剂包合作用是指一种分子被包藏于另一种分子的空穴结构内，形成包合物（inclusion compound）。这种包合物是由主分子(host molecules)和客分子(guest molecules)两种组分组成。环糊精(cyclodextrins,CD)及其衍生物就是一类广泛采用的主分子。CD是由多个D-(+ )- 吡喃(型)葡萄糖单元以α- 1,4- 糖苷键首尾相连形成的环状低聚糖，最常见的三种CD是α-、β-和γ- CD，分别含有6, 7, 8个葡萄糖单元及30, 35和40个手性中心, 如图10.13所示。CD具有中空的截角锥结构，腔内呈相对疏水性，羟基位于腔口处，呈亲水性。环糊精衍生物大多是以甲基、乙基、羟丙基等基团取代环糊精外沿上的羟基氢原子而制备。作为主分子的CD及其衍生物分子中，由于每个葡萄糖单元上有5个手性碳原子，因此可形成具有特定疏水腔直径及不同亲水性外缘的三维手性环境（手性腔）。当客体分子(如溶液中的氨基酸对映体分子)接近CD及其衍生物分子时，只有空间适应性与之吻合的一种对映体分子可以选择性地进入手性腔，形成一种非对映体包合配合物(主一客体配合物)，所以，根据对映体包合常数的差异即可达到手性分离的目的。

图10.13 CD的结构

（4）其它手性流动相添加剂如Dobashi等[12]利用基于两个氨基酸衍生物的聚集作用形成分子内氢键的分子缔合为手形识别机理，将N一乙酞基-L-撷氨酸一叔丁基胺添加于氯仿/正己烷中，在硅胶柱上拆分了各种氨基酸。

2．手性柱法：将手性化合物键合到固定相表面，使氨基酸对映体与键合的手性分子形成非对映体络合物，由于二者结合能力不同而达到分离目的。手性柱具有广泛的适应性及立体选择性。但通用性差，且手性柱价格昂贵。CSP可分为以下几种类型:

（1）蛋白质手性固定相蛋白具有与小分子可逆性键合的能力，其键合作用均具立体选择性，可用于氨基酸立体异构体的拆分。蛋白质手性固定相的优点是:在键合蛋白质保持其原

有的结合能力和流动相不影响其手性作用性质时，通过色谱参数的测定可以推断蛋白质与氨基酸相互作用的信息。使用较多的蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA),α一酸性糖蛋白、卵类粘蛋白和胰凝乳蛋白等。

（2）纤维素和多糖衍生物手性固定相是含有D-葡萄糖，通过葡萄糖1,4-糖昔键形成的具有高度有序螺旋结构的高聚物，葡萄糖中三个羟基可以被衍生化而围绕手性葡萄糖形成链状结构，衍生化的葡萄糖单元可作为手性活性点用于拆分手性对映体，从而使得纤维素和多糖衍生物具有手性分离能力。

（3）空穴性手性固定相手性固定相拆分对映体的另一途径是将手性空穴键合到固定相表面，由此产生的客体一主体间的相互作用决定对映体的拆分效果。这一类固定相中键合的手性空穴包括冠醚的分子刻印高聚物和环糊精。最为常用的则是环糊精(CD)手性固定相。环糊精的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃类侧链的包容作用，以及环外壳上的羟基与氨基酸对映体分子发生的氢键作用。包括α，β，γ-CD及其衍生物。α-CD键合固定相适合于分子量小于200的对映体的分析；β-CD手性键合固定相对形成包合物有最佳大小的内腔，适用于大多数对映体的位阻和电子特征，因此广为使用；而γ-CD键合固定相适用于较大分子量对映体的分析。

（4）Pirkle型手性固定相是把具有手性活性的单链分子通过酞胺键连接到丙胺硅胶基团上所生成的手性固定相。其中，固定化的手性基团包括有π电子给予或受体的芳香基团以及氢键的偶极叠和的基团。

（5）配体交换手性固定相这一类手性固定相拆分对映体与手性配体流动相的拆分机理相同，只是手性配体键合到固定相基质成为手性固定相而已。其配体分子亦为具有手性活性的氨基酸如脯氨酸，金属离子多用Cu2+。其流动相多用含水流动相，并加入适量鳌合的金属离子或配基化合物，以防固定相的流失。

§10. 4. 1. 2 间接法

间接法即为手性试剂衍生化法，它是指对映体在分离前先与高光学纯度衍生化试剂反应形成非对映体，再进行色谱分离测定。此法要求：(1) 手性试剂及反应产物在化学上和手性上都很稳定，其光学性在贮存中不发生改变；(2) 在衍生化反应和色谱条件下，试剂、手性化合物和反应产物不发生消旋化反应；(3) 衍生化反应生成的非对映体在色谱分离时应能显示高柱效；(4) 手性试剂应具有UV或荧光等敏感结构，能使生成物具有良好的可检测性。间接法分离时可用价廉、柱效高的非手性柱，且反应时可通过选择衍生化试剂来提高检测灵敏度。但是衍生化反应操作比较复杂，同时对衍生化试剂的化学纯度和光学纯度要求也较高；另外对映体与另一个手性分子(即添加的手性试剂)反应的速率不相同，这可能会使生成的非对映体衍生物的比例与对映体的起始比例不同。

DL－氨基酸间接法手性分离时，常用邻苯二甲醛(OPA)和手性硫醇作为衍生化试剂；手性硫醇种类很多，如N－乙酰－L－半胱氨酸(NAC)、N－乙酰－D－青霉胺(NAP)、D－3－琉基－2－甲基戊酸(MMPA)等。衍生产物在ODS柱上分离后用紫外或荧光检测，但不同的手性硫醇将影响氨基酸的洗脱行为，即使用同一种衍生化试剂，洗脱行为也不尽相同。

采用邻苯二甲醛(OPA) 和手性硫醇N-叔丁氧羰基－L－半胱氨酸( Boc-L-Cys ) 作为衍生化试剂测定鼠脑组织中D－氨基酸[13]。

样品预处理：海马组织加20倍体积的甲醇在冰上匀浆，4 500 g离心5 min, 取上清20 μl 在40℃蒸干后加40 μl 0.4 mol L-1硼酸钠缓冲液（pH 9.0），10 μl OPA试剂溶液（OPA和Boc-L-Cys