搜档网
当前位置:搜档网 › IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

发布日期:2008-12-17 热门指数:21114 分享| 收藏

E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

材料

1、诱导表达材料

( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%

蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

适用范围:大肠杆菌

( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-2 0 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (电泳级)

0.1 %溴酚蓝

10 %甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 )酶溶法

(1)裂解缓冲液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / mL 溶菌酶。

(4)脱氧胆酸。

(5)1 mg / mL DNase I。

2 )超声破碎法

( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 %溴酚蓝

20 %甘油

实验方案

1、外源基因的诱导表达

( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,确定无误后进行下一步。

( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。

( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 )细菌的裂解

常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。

原核诱导表达汇总

原核诱导表达的标准操作程序(SOP) 一.目的: 使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。 二.适用范围: 本SOP适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。 三.实验原理: E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P 序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。 四、试剂准备: (一)实验器材的灭菌: 枪头的灭菌: 1mL,200μL,20μL的枪头放入枪头盒,用报纸包住(2层),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常温放置。 螺口管及离心管的灭菌: 将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中(盖子要拧松,离心管的管盖打开),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常温放置。 50mL离心管的灭菌: 将50mL离心管用报纸包住(2层),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。80℃烘箱中烘干,常温放置。 (二)LB培养基的配制 液体LB培养基(1L):蛋白胨10g 氯化钠10g 酵母提取物5g 调PH值到7.5,高压灭菌,4℃保存。 固体LB培养基(1L):蛋白胨10g

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

IPTG诱导蛋白表达的原理

IPTG诱导蛋白表达得原理 IPTG诱导得产物就是重组后表达载体中得插入序列所能够翻译得蛋白,并可视载体构建情况翻译后续得标签序列。 用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达得时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β—D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖得相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续得表达、 IPTG就是一种诱导外源基因表达得诱导剂,它不仅仅如我们学过得作为乳糖得类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶,它就是一种普遍应用得诱导剂,能诱导菌种表达多种外源基因。 但就是它能诱导基因表达得具体原理我却了解得不就是很多,我在网上查到以下一些内容,供查阅者借鉴. 最早应用于得表达系统就是Lac乳糖操纵子,乳糖得类似物IPTG 可以与lacI产物结合,使其构象改变离开lacO,从而激活转录、?这种可诱导得转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建得常用元件。tac启动子就是trp启动子与lacUV5得拼接杂合启动子,且转录水平更高,比lacUV5更优越。trc启动子就是trp启动子与lac启动子得拼合启动子,同样具有比trp更高得转录效率与受lacI 阻遏蛋白调控得强启动子特性.在常规得大肠杆菌中,lacI阻遏蛋白表达量不高,仅能满足细胞自身得lac操纵子,无法应付多拷贝得质粒得需求,导致非诱导条件下较高得本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达,能过量表达lacI阻遏蛋白得lacIq突变菌株

常被选为Lac/Tac/trc表达系统得表达菌株。现在得Lac/Tac/trc 载体上通常还带有lacIq 基因,以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨得诱导调控。IPTG 广泛用于诱导表达系统,但就是IPTG有一定毒性,有人认为在制备医疗目得得重组蛋白并不合适,因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物得研究。另外一种研究方向就是用lacI得温度敏感突变体,30度下抑制转录,42度开发。热诱导不用添加外来得诱导物,成本低,但就是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果,而且热诱导本身会导致大肠杆菌得热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定、 T7启动子就是当今大肠杆菌表达系统得主流,这个功能强大兼专一性高得启动子经过巧妙得设计而成为原核表达得首选,尤其以Novagen公司得pET系统为杰出代表.强大得T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶,而高活性得T7 RNA聚合酶合成mRNA得速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时,宿主本身基因得转录竞争不过T7表达系统,几乎所有得细胞资源都用于表达目得蛋白;诱导表达后仅几个小时目得蛋白通常可以占到细胞总蛋白得50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA聚合酶,需要将外源得T7 RNA 聚合酶引入宿主菌,因而T7RNA 聚合酶得调控模式就决定了T7系统得调控模式-—非诱导条件下,可以使目得基因完全处于沉默状态而不转录,从而避免目得基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性得影响;通过控制诱导条件控制T7 RNA聚合酶得量,就可以控制产物表达量,某些情况下可以提高产物得可溶

目的蛋白的诱导表达

目的蛋白的诱导表达 1.诱导目的蛋白表达 (1)从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞,加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中,37℃,250rmp摇床培养过夜。(2)将过夜培养的重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞分别按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 (3)37℃摇床培养至OD600到0.4-1。 (4)从重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞中各取10ml培养物作为未诱导对照;在剩下的样品中加入1M IPTG储液至终浓度1mM,继续培养2-3 小时。 (5)将摇瓶置于冰上5分钟,5000g 4℃离心15分钟收集菌体,菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析等。 2.表达条件的优化: 1)IPTG的诱导浓度的确定: (1)重组工程菌的诱导:从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞,加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中, 37℃,250rmp摇床培养过夜。 (2)将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 (3)在37℃,250rmp摇床培养至OD600约为0.8。 (4)按6ml/份上述培养物分装,分别加入IPTG至终浓度0, 0.5, 1, 1.5, 2.0mM。(5)37℃,250rmp摇床培养8h,在无菌条件下取样并测定OD600值。 (6)所取样品1ml/份分装,5000g 4℃离心15分钟收集菌体。 (7)菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。 2)IPTG诱导温度条件的优化: (1)重组工程菌的诱导:从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞,加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中, 37℃,250rmp摇床培养过夜。 (2)将过夜培养的重组工程菌按1%的比例转种于30 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中。 (3)在37℃,250rmp摇床培养至OD600约为0.8。 (4)在诱导之前,将30ml培养液分为5份,每份各6ml,其中4份加入IPTG,另1份不加IPTG作为不诱导对照。加入IPTG至终浓度为1.0mM,选取几个适当温度点(可从15-37℃之间选择)250rmp摇床培养。 (5)培养8h后,在无菌条件下取出样品6ml,并测定OD600值。 (6)所取样品1ml/份分装,5000g 4℃离心15分钟收集菌体。 (7)菌体保存于-20℃冰箱或SDS-PAGE分析或蛋白含量测定。 3)诱导时间优化 (1)重组工程菌的诱导:从平板或甘油保存菌中接一环重组工程菌和pET-22b(+)空载体转化细胞,加入3 ml Amp(100ug/ml)+LB的培养液中, 37℃,250rmp摇床培养过夜。

蛋白表达步骤

1.培养基的配制 原理 wenku.baidu./link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsT WICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7 步骤 LB培养基,是微生物学实验中最常用的培养基,用于培养大肠杆菌等细菌,其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基,然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法,这个名字来源于英语的lysogeny broth,即溶菌肉汤。 LB培养基的配制: 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH至7.2,121℃灭菌30min 配制方法 (1)称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl,置于烧杯中。 (2)溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。 (3)调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。 (4)定容将溶液倒入量筒中,加水至所需体积。 (5)加琼脂加入所需量琼脂,加热融化,补足失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养,逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物,可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程,因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同,所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国常用的菌种保存方法包括:定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同: 1 定期移植法的菌种复较简单,直接转接即可; 2 液体石蜡法保存的菌种在复时,挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次;

IPTG诱导蛋白表达全面介绍

IPTG全面介绍:优点·使用·配制·特点 摘要: 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用,用于重组细菌菌落的蓝白筛选,这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用,防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。 中文名:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG) 英文名称:Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 用途:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG 常用于需要诱导β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal 或Bluo-Gal 结合使用,用于重组细菌菌落的蓝白筛选,这些菌落可以诱导lac 操纵子在大肠杆菌中的表达。IPTG 与lacI 阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用,防止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ 的抑制。 使用方法:首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液,并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中,加入100 μl 的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当dna 片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。 配制方法:在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后,用蒸馏水定容至10ml,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。 优点: 1.能诱导酶的合成,但又不被分解的分子,称为安慰诱导物。由于乳糖虽可诱导酶的合成,但又随之分解,产生很多复杂的动力学问题,因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 2.IPTG不被菌体代谢,为乳糖类似物,一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果,所以IPTG的诱导效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢,在胞内专一诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响,诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用,既能做为诱导剂异乳糖的前体物质,又可以做碳源,在诱导过程中,很不稳定,IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实验研究用。 3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。 4.半乳糖苷键中用硫代替了氧,失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同,IPTG虽不为β–半乳糖苷酶所识别,但它是lac基因簇十分有效的诱导物。 注意事项:培养噬菌体时,Top agar中的添加量为:25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有 IPTG 的培养基4℃避光保存,须在1~2 周内使用。 保存:2-8°C冷藏保存,配制好后保存于-20°C,室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。 IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法 摘要: E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围:大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液: 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS (电泳级) 0.1 %溴酚蓝 10 %甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

蛋白表达步骤

1.培养基的配制 原理步骤 LB培养基,是微生物学实验中最常用的培养基,用于培养大肠杆菌等细菌,其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基,然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法,这个名字来源于英语的 lysogeny broth,即溶菌肉汤。 LB培养基的配制: 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH(约)调pH至,121℃灭菌30min 配制方法 (1)称量分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl,置于烧杯中。 (2)溶化加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。 (3)调pH 用1mol/L NaOH溶液调pH至。 (4)定容将溶液倒入量筒中,加水至所需体积。 (5)加琼脂加入所需量琼脂,加热融化,补足失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。

2、大肠杆菌菌种活化 原理 菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中进行培养,逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物,可以理解为就是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵一般情况下需要2-3代的复壮过程,因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同,所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保存方法包括:定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 对于不同的保存方式活化的方式也不同: 1 定期移植法的菌种复苏较简单,直接转接即可; 2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时,挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次; 3 沙土管法保存菌种在复苏时,在无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中,增殖培养后再转接斜面; 4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,将安瓿管顶部烧热,用无菌棉签沾冷水,在顶部擦一圈,顶部出现裂纹,用挫刀或镊子颈部轻叩一下,敲下已开裂的安瓿管的顶端,用无菌水或培养液溶解菌块,使用无菌吸管移入新鲜培养基上,进行适温培养; 5 -80℃冰箱冻结法保存菌种复苏时,从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止,约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养 6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃冰箱冻结法保存菌种复苏相似,从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 发布日期:2008-12-17 热门指数:21114 分享| 收藏 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围:大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-2 0 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液: 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS (电泳级) 0.1 %溴酚蓝 10 %甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

IPTG诱导蛋白表达原理

IPTG诱导蛋白表达的原理 IPTG诱导的产物是重组后表达载体中的插入序列所能够翻译的蛋白,并可视载体构建情况翻译后续的标签序列。 用乳糖操纵子作为启动子进行蛋白质表达的时候,需要诱导物进行诱导(相当于点火),但乳糖可以被细胞利用掉,所以利用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在结构上与乳糖的相似性也可以将基因表达启动,但它不能被细胞利用掉,从而实现持续的表达. IPTG是一种诱导外源基因表达的诱导剂,它不仅仅如我们学过的作为乳糖的类似物诱导大肠杆菌表达半乳糖苷酶,它是一种普遍应用的诱导剂,能诱导菌种表达多种外源基因。 但是它能诱导基因表达的具体原理我却了解的不是很多,我在网上查到以下一些内容,供查阅者借鉴。 最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子,乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合,使其构象改变离开lacO,从而激活转录. 这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子,且转录水平更高,比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子,同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中,lacI阻遏蛋白表达量不高,仅能满足细胞自身的lac操纵子,无法应付多拷贝的质粒的需求,导致非诱导条件下较高的本底表达,为了让表达系统严谨调控产物表达,能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为

Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因,以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG 广泛用于诱导表达系统,但是IPTG有一定毒性,有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适,因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体,30度下抑制转录,42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物,成本低,但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果,而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活,一些蛋白酶会影响产物稳定. T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流,这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选,尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶,而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时,宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶,需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌,因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录,从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响;通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量,就可以控制产物表达量,某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

IPTG诱导表达蛋白步骤

IPTG诱导表达蛋白步骤 15-11-3 配固体培养基和液体培养基,灭菌。 配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4,定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤(滤除溶液内的气泡和不溶性杂质)。倒板:(5个灭菌的培养皿) ①微波加热溶解固体培养基 (每次加热30s待有沸腾的迹象时,减少加热的时间)。 ②超净台操作,以1?1000的比例(1ml培养基~1μl抗生素)向培养基中加入Kan+(50mg/ml),摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固, 凝固后将培养皿倒着放入培养箱 中 15-11-4 热转化: (将质粒导入大肠杆菌中) ①提前将大肠杆菌(冰上融化)和质粒拿出来融化,混合(冰上操作)后冰上放置 30min。 ②42℃热水浴1min(超过90s会损伤细菌),取出后立即放在冰上冷却2~3min,加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min,150rp,37℃。(使菌体复苏) ④离心,

3000rpm3min。 ⑤涂板:取200μl上述液体,喷到板上,用玻璃涂布棒涂匀,放入培养箱中30min晾干后倒着放置。(12~16h) 15-11-5配IPTG(0.2g/ml),用灭菌水,超净台操作。 挑单克隆:将细菌放入培养液中,以便进行扩大培养和后续实验) ①提前准备好几支装有 3ml 培养基的试管,每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml),塞好塞子,试管倾斜,是抗生素溶入培养液中。(塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌)。 ②小镊子过火灭菌后,夹取一个枪头,在培养皿上挑一个单个的菌落,轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中,塞好塞子(试管中培养基液澄清) ③将试管放在摇床中培养一晚,37℃,250rpm。(尽量不超过12h)【试管中培养基液变混浊】注意:操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以(抗生素?培养基)1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素,摇匀后再加入(100ml培养基)1ml单克隆溶液,摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导,移去牛皮纸,恒温摇床上摇6h, 30℃,180rpm。冰上放置一晚(抑制细胞生长 速率,有利于蛋白质充分折叠)

镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤

镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤,注意事项!!! 1、过柱前的注意事项: a、样品必须澄清、无颗粒物,否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命; b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME; c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl,以防止杂离子与Ni离子竞争; 2、过Ni柱的操作步骤: a、用去离子水洗涤,洗去20%的乙醇、除尽基质中的空气,并能防止下一步中Ni离子沉淀; b、5×柱体积的Charge Buffer(50mM NiSO4)充电; c、5×柱体积的去离子水洗涤,去游离的Ni离子; d、10×柱体积的Binding Buffer(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑,pH8.0)平衡; e、上样(手工上样,样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定); f、20×柱体积的Washing Buffer(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑,pH8.0)洗涤,至无蛋白检出,收集流出液; g、Elution Buffer(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500-1000mM咪唑,pH8.0)洗脱,每次1ml,应呈现正态分布(两边稀,中间浓); h、10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时,即可用于纯化同种蛋白,很少需要重新充电。 注:同种蛋白纯化5~10次后,应进行strip和re-charge。 3、柱的清洗与保存: a、去Ni离子:a、5×柱体积的Strip Buffer(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA,pH7.4)洗涤; b、10×柱体积的去离子水洗涤。 b、去沉淀的蛋白质:a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子,静置0.5~2hr;b、去离子水洗涤,至流出液的pH值为7。 c、保存:20%乙醇洗涤,再加20%乙醇保存于4℃。

IPTG诱导蛋白质表达实验步骤总结

实验总结 IPTG诱导表达蛋白 15-11-3 配固体培养基和液体培养基,灭菌。 配Binding Buffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4,定容后转移到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤(滤除溶液内的气泡和不溶性杂质)。 倒板:(5个灭菌的培养皿) ①微波加热溶解固体培养基(每次加热30s,待有沸腾的迹象时,减少加热的时间)。 ②超净台操作,以1?1000的比例(1ml培养基~1μl抗生素)向培养基中加入Kan+抗生素(50mg/ml),摇匀。 ③倒板。 ④培养皿放置在超净台上凝固,凝固后将培养皿倒着放入培养箱中。 15-11-4 热转化:(将质粒导入大肠杆菌中) ①提前将大肠杆菌(冰上融化)和质粒拿出来融化,混合(冰上操作)后冰上放置30min。 ②42℃热水浴1min(超过90s会损伤细菌),取出后立即放在冰上冷却2~3min,加入1mlSOC培养基。 ③摇床上摇45min,150rpm,37℃。(使菌体复苏)

④离心,3000rpm,3min。 ⑤涂板:取200μl上述液体,喷到板上,用玻璃涂布棒涂匀,放入培养箱中30min晾干后倒着放置。(12~16h) 15-11-5 配IPTG(0.2g/ml),用灭菌水,超净台操作。 挑单克隆:(将细菌放入培养液中,以便进行扩大培养和后续实验) ①提前准备好几支装有3ml培养基的试管,每管加入3μl Kan+抗生素(50mg/ml),塞好塞子,试管倾斜,是抗生素溶入培养液中。(塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌)。 ②小镊子过火灭菌后,夹取一个枪头,在培养皿上挑一个单个的菌落,轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中,塞好塞子 【试管中培养基液澄清】 ③将试管放在摇床中培养一晚,37℃,250rpm。(尽量不超过12h)【试管中培养基液变混浊】 注意:操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。 15-11-6 扩大培养、诱导表达 ①以(抗生素?培养基)1?1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素,摇匀后再加入(每100ml培养基)1ml单克隆溶液,摇匀。 ②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm。 ③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导,移去牛皮纸,恒温摇床上摇6h,30℃,180rpm。冰上放置一晚(抑制细胞生长速率,有利于蛋白质充分折叠)

原核表达步骤

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

蛋白表达纯化流程

第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右,取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液,加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0),重悬; 3)离心收集菌体同上,弃去上清液,将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒,停止6秒),之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间,长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫,因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中,并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

IPTG诱导蛋白表达

IPTG诱导蛋白表达 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(C AP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围:大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达得动物组织提total-RNA. 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当得酶切位点与保护碱基。 3、RT-PCR. KOD酶扩增获取目得基因c DNA、 4、双酶切,将cDNA、克隆入PET28 / 3 2等表达载体. 5、转化到DH5a感受态细菌中扩增,提质粒. 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如BI2 1 (D E 3 ), Rosett a garni (D E3)、 BI2 1 Codon(DE3)^? 7、蛋白得诱导表达. 1 )将表达菌株在3nilLB培养基中摇至O D=0 . 6左右,加入IPTG,浓度梯度从25 U M 到Im M37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)3 DS-PAGE电泳检测目得蛋白得表达.注:目得蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白得50%以上,在胶上可以瞧到明显得粗大得条带。 3)将有表达得菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录I PTG浓度范鬧。甘油就是用0、22 P mil滤除菌得,储存浓度一般就是30^-60%.使用时自己计算用量。 4)用上述【PTG浓度范围得最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(14 0 - 1 8 0rpm). 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:[、如果表达得蛋白对菌体有毒性,可以在加1 PTG送前得培养基中加入:L%得葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌得繁殖消耗殆尽,不会彫响后而得表达。2、 保种可以取一部分分成5om -管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种得表达菌株先摇1 0 ml 3 7度,SOOrpm摇至0D>=1. 5,约5 h左右,视菌种得活性而异,也可过夜摇菌。 2)将上一步中得8m I加入300 ml培养基中37度,2 50rpm摇至0 D=ls 0左右(约 2、5h?3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用得浓度.)注:菌液浓度要适当得浓一些,否则第二天收集不到足够得菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动,瞧到有大量云雾状菌体即可?另一方法就是,将手指放在瓶底晃动,瞧 不淸手指为宜,不过此法宜受气泡影响。 3)过夜摇菌,使用包涵体检测得温度(1 8°左右),转速140 r pm左右。 4)将菌液eOOOrpm, 4m i n,4度离心收集菌体。加入2 0mMPBS.洗一遍后用平衡缓冲液重悬。 每2 50ml菌液用3 0 ml到5 0ml平衡缓冲液,视菌液得浓度而楚。可用4支50m I得离心管同时离心,但就是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1)用6mm变幅杆,35%功率,3、5s工作,7$休息,5 0 mi n即可。 注意:1、要冰浴.2、要随时观察裂解情况以防意外。3、要将探头探入到溶液中下部,尽虽不要打出大量气泡。一般溶液量比较大得时候不会出现大量气泡。 4、正常声音为:孜孜声,尖锐刺耳得声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后而3 0 00转 离心时,如果沉淀少说明裂解得好)。5、超声波破碎仪工作30分min要休息5min (即关闭总电源开关)。 注意:1、如果纯化得蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF), PM

相关主题