微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法

一、微生物鉴定的依据

获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。

表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据

二、微生物鉴定的技术与方法

根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；

在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。

（一）、经典分类鉴定法

经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。

A. 能在60 o C 以上生长

B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属

( Thermomicrobium )

BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm

C. 能以葡萄糖为碳源生长

D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属

( Acidothermus )

DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属

( Thermus )

CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum )

AA. 不能在60 o C 以上生长

图14-4 双歧法检索表例样

应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。

（二）、数值分类法

又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。

图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

图14-6 根据相似矩阵图转换的相似关系树状谱

数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的DNA 碱基的G + Cmol% 和DNA 杂交，以进一步加以确证。

（三）、化学分类法

微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法(chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表

14-4 。

表14-4 细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用

细胞成份分析内容在分类水平上的作用

细胞壁肽聚糖结构种和属

多糖

胞壁酸

膜脂肪酸种和属

极性类脂

霉菌酸

类异戊二烯苯醌

蛋白质氨基酸序列分析属和属以上单位

血清学比较

电泳图

酶谱

代谢产物脂肪酸种和属

全细胞成分分析热解—气液色谱分析种和亚种

热解—质谱分析

随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌

的标准之一，细菌具有酰基脂( 脂键) ，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区分古菌。霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。

（四）、遗传学分类法

分子遗传学分类法是以微生物的遗传型( 基因型) 特征为依据，判断微生物问的亲缘关系，排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：

1 、DNA 中G+C mol% 分析

每一个微生物种的DNA 中GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA 中GCmol% 的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的GC mol% 范围。DNA 中GC mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA 中GC 含量的变化范围一般在25 ％～

75 ％；而放线菌DNA 中的GC 比例范围非常窄(37 ％～51%) 。一般认为任何两种微生物在GC 含量上的差别超过了10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用G+C mol ％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其G+C mol ％含量相同或者近似，但G+C mol ％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA 的GC mol% 在37 ～51 之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的DNA 碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。

2 、DNA-DNA 杂交

DNA 杂交法的基本原理是用DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA ，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100% 。如果两条单链DNA 的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100% 。由此；杂合率越高，表示两个DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的DNA 杂合率可高达100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA 杂合率较低，约有70 ％。G+Cmol ％的测定和DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。

3 、DNA — rRNA 杂交

目前研究RNA 碱基序列的方法有两种。一是DNA 与rRNA 杂交，二是16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。DNA 与rRNA 杂交的基本原理、实验方法同DNA 杂交一样，不同的是①是DNA 杂交中同位素标记的部分是DNA ，而DNA 与rRNA 杂交中同位素标记的部分是rRNA 。②DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而DNA 与rRNA 杂交结果用

Tm(e) 和RNA 结合数表示。Tm(e) 值是DNA 与rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。RNA 结合数是100 m gDNA 所结合的rRNA 的m g 数。根据这个参数可以作出RNA 相似性图。在rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用rRNA 同性试验和16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。

4 、16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析

首先，16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18S rRNA ）中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。

分离菌株16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞, 加入100μL 无菌重蒸H 2 O 中, 旋涡混匀后, 沸水浴2min, 12 000r min -1 离心5min, 上清液中即含16S rRNA 基因，可直接用于PCR 扩增。分离菌株16S rRNA 基因的PCR 扩增和序列测定的一般步骤为：16S rRNA 基因的PCR 引物：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ；5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积50 m L ，反应条件为95 ℃预变性5min ，94 ℃变性1min ，55 ℃退火1min ，72 ℃延伸2min ，共进行29 个循环，PCR 反应在PTC-200 型热循环仪上进行。取5 m L 反应液在10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR 产物测序可由专门技术公司完成。

测序得到分离菌株16S rDNA 部分序列，此序列一般以*.f.seq 形式保存，可以用写字板或Editsequence 软件打开，将所得序列通过Blast 程序与GenBank 中核酸数据进行比对分析( ) ，具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST 下Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断16S rDNA 鉴定结果。

遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar 软件包中的MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8 程序进行DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap ）500 次重复检测，DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。

第一章微生物检验常规鉴定技术

课堂教学计划（1学时）

第一章微生物检验基本知识

包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。

接种、分离纯化和培养技术

一、接种

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法

接种和分离工具

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

常用的接种方法有以下几种：

１）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接

种的。

３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微

生物菌落。

５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。

８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

２、无菌操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样

品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无

菌操作。

图5－４斜面接种时的无菌操作

(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞

二、分离纯化

含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法

首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

（图5－５，a）

图5－５倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解

1.菌悬液

2.熔化的培养基

3.培养物

4.无菌水

２、涂布平板法

首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图5－

５，b）

３、平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图5－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图5－７）

４、富集培养法

富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可

以得到纯的寄生菌。

图5－６平板划线分离法

1.斜线法

2.曲线法

3.方格法

4.放射法

5.四格法

５、厌氧法

在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于

培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

三、培养

1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。

好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振

荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：

a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。

b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混

合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。

c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。

d.替代驱氧用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体

驱代氧气。

２、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。

固体培养：

液体培养：

第二章微生物常规鉴定技术

一、形态结构和培养特性观察

１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。

不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微

生物检验鉴别中的一项重要内容。

１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情

况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。（图３－８）

图３－８细菌的培养特征

1.点状

2.圆形

3.丝状

4.不规则形

5.假根状

6.纺锤状

7.扁平

8.隆起

9.凸起 10.垫状 11.脐状12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状

30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状

２）霉菌酵母菌的培养特征：

大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状

菌落。

二、生理生化试验

微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

微生物检验中常用的生化反应有：

１、糖酵解试验

不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验。

试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

２、淀粉水解试验

某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无

透明环或肉汤呈深蓝色。

淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰

箱，因而以临用时制备为妥。

３、V-P试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）

反应。

试验方法：

１）O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加O’Meara 试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置

2h后判定结果者。

２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

３）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。

不产酸的培养物不能使用。

本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。

４、甲基红（Methyl Red）试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，

使甲基红指示剂变红。

试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C 较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。

甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时

间，重复试验。

５、靛基质（Imdole）试验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲

基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即

为阳性。

实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。

６、硝酸盐（Nitrate）还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用

硝酸试剂检验。

试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为

试验阳性，若无红色出现则为阴性。

用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。

７、明胶（Gelatin）液化试验

有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失

去凝胶性质而液化。

试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周

围应出现清晰带环。否则为阴性。

８、尿素酶（Urease）试验

有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。

９、氧化酶（Oxidase）试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。

10、硫化氢（H2S）试验

有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可

生成黑色沉淀物。

试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑

为阳性。

11、三糖铁（TSI）琼脂试验

试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养

18~24h，观察结果。

本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

12、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验

试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。

本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。

三、血清学试验

血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。

在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。

血清学反应的一般特点：

1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。

2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。

3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。

4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。

习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。

１、凝集反应

颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，

称为凝集反应（Agglutination reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。

１）直接凝集反应

颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。

a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。

b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小时观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。

２）间接凝集反应

将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很

高。

２、沉淀反应

可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

１）环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。

２）絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。

３）琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂

的抗原成分。

３、补体结合反应

补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细

胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和

溶血素）五种成份参加。

其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能

测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。

微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

微生物的分类与鉴定

第十章微生物的分类与鉴定 一、选择题 1.真菌的分类单元-门的词尾为（A ） 2.A、–mycota B、–mycetes C、–mycotina D、-mycetidae 3.下列传统分类指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是（A ） 4.A、形态学特征 B、生理特征 C、生态学特征 D、分子生物学特征 5.下列拉丁文哪个书写格式正确（ C ） 6.A、Fusarium oxysporium B、Aspergillus japonicus Saito 7. C、Bacillus amyloliquefaciens D、Clostridium Kluyveri 8.1978年，根据16S rRNA和18S rRNA的碱基序列将生物分为“三域”的科 学家是（D ） 9.A、Ainsworth B、Bergey C、Leedale D、Woese 10.1995年，Ainsworth分类系统把菌物列入真核生物域，将其分为3个界， 下面哪项不属于其中（ D ） 11.A、原生动物界 B、假菌界 C、真菌界 D、菌物界 12.有关菌株的说法，下列哪项说法不对（ B ） 13.A、菌株强调的是遗传型纯的谱系 B、菌株的名称不可随意确定 14.C、菌株与克隆相同，为一个物种内遗传多态性的客观反映 15.D、菌株实际上是某一微生物达到遗传型纯的标志， 二、是非题 1．微生物的种是微生物分类的基本单元，但是目前还没有一个公认的、明确的定义。（√） 2．两个微生物菌株具有相同G+C含量表明它们之间的亲缘关系一定很相近。（×）

3．亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种，其命名方法按“三名法”处 理。（√） 4．变种是亚种的同义词，在《国际细菌命名法规》中不主张使用。（√）5．在微生物分类中，DNA（G+C）mol%的比较只能做否定判断。（√）6．微生物DNA之间的同源性越高，说明它们之间亲缘关系就越近，反之亦然。（×） 7．菌株是一个物种内遗传多态性的客观反应，是遗传型纯的谱系，其名称可以随意确定。（√） 8．模式菌株是一个种的具体活标本。（√） 9．据科学家1992年估计，地球上生存的菌物约有150万种。（√）10．微生物自动化鉴定技术一般都是利用微生物的生理生化反应特性而设计的。（√） 11．细菌分子鉴定常用16S rRNA序列分析，而真菌分子鉴定常用ITS序列分析。（√） 12．所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内最具代表性的菌株。（×）13．对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。（√） 14．现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。（×） 15．DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（√）

微生物的分类与鉴定答案

一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。

10 微生物的分类与鉴定 试题库-柯野

本科生物技术、生物科学专业《微生物学》分章节试题库 （命题人：柯野） 第八章微生物生态（8分） 第十章微生物的分类和鉴定（8分） 第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释 1 系统发育树： 2 培养物： 3 菌株： 4 种： 6 属： 7 数值分类法： 8 模式（或典型）菌株： 9 DNA（G+C）mol%值： 10 三域学说： 二、是非题 1、“大肠埃希氏菌”才是俗称“大肠杆菌”的学名。（） 2、所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内了具代表的菌株。（） 3、两种细菌的G+C含量相近，说明它们亲缘关系近，反之，G+C含量差别大说明它们亲缘关系远。（） 4、DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远（属以上等级）分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（） 5、数值分类由于采用了先进的计算想技术，减少了大量的特征测定的实验操作，所以它是比较科学的现代微生物系统分类方法。（） 6、“吹口气查胃病”的原理是：幽门螺杆菌具有人体不具有的尿素酶，受检者口服13C标记的尿素，如有该菌感染，则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2，用

质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量，准确地鉴定是否被幽门螺杆菌感染。（） 7、亚种名为三元式组合，即由科名、属名加词和亚种名加词构成。 8、现代微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统仍然是有意义的。 9、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率高。 10．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。（） 11．G+C含量的比较主要用于分类中否定。（） 12.菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。（） 三、选择题（4个答案选1） 1、血清学试验，尤其在医学细菌的分类鉴定中的重要意义，但它主要用于划分（）。 （1）种内血清型（2）种间血清型（3）属间血清型（4）属以上血清型2、根据你所掌握的知识，人为认为形态学特征学特征在以下几类微生物中的哪严分类鉴定中显得更加重要？（） （1）病毒（2）细菌（3）酵母菌（4）霉菌 3、现在自动化程度最高、功能最多的微生物专用检测仪是（） （1）气相色谱仪（2）高压液相色谱仪 （3）自动微生物检测仪（4）激光拉曼光谱仪 4、目前微生物的快速检测和自动化分析中，广泛地采用的免疫学技术是（）。（1）DNA探针（2）聚合酶链反应技术 （3）DNA芯片（4）酶联免疫吸附测定法 5、第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是（）。 （1）种名（2）属名（3）人名（4）科名 6. Micrococcus的译名为：（） A. 链球菌属 B. 微球菌属 C. 小单胞菌属 D. 四联球菌属 7. Bacillus的译名为：（）

第10章 微生物的分类鉴定

第10章微生物的分类鉴定 填空题 1，以进化论为指导思想的分类学，其目的已不仅是物种的识别和归类，而主要是通过分类追溯系统发生，推断进化谱系，这样的分类学也称。 2，大量资料表明：功能重要的分子或功能重要的分子区域比功能不重要的大分子或大分子区域进化变化的。 3．微量多项试验鉴定系统，实际上是一类专门设计制作的特征检测卡。 4．《伯杰氏系统细菌学手册》第一版分卷出版，它将原核生物分成组。 5．微生物种的学名由和两部分构成。 6．分类学的内容涉及3个互相依存又有区别的组成部分，即、命名和。 7．如果相似性系数(S AB)等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列，若S AB值小于0.1，则表明两菌株亲缘关系。 8．API／ATB是微量多项试验鉴定系统，它包括众多的，共计有几百种生理生化反应，可鉴定几乎所有常见的。 9．微孔滤膜菌落计数板是一种可携带的检测水中大肠菌数的大肠菌测试卡，适于工作和使用，因可以放在人体内衣口袋中培养。 10．伍斯用寡核苷酸序列编目分析法对微生物的16SrRNA序列进行比较后，提出将生物分成为三界(域)：、和。 11．伍斯为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：、和。并构建了三界(域)生物的系统树。 选择题(4个答案选1) 1．《伯杰氏系统细菌学手册》第二版把葡萄球菌属和微球菌属分别放在不同的门中，最可能的原因是( )。 (1)生理生化特征不同(2)DNA—DNA杂交同源性不同(3)革兰氏染色反应不同 (4)G+C含量和rRNA序列不同 2．如果需要查阅枯草芽孢杆菌及相关种的分类学资料，并假定《伯杰氏系统细菌学手册》第二版已经全部出版，你将选择该书的( )。 (1)第一卷 (2)第三卷 (3)第四卷 (4)第五卷 3．血清学试验，尤其在医学细菌的分类鉴定中有重要意义，但它主要用于划分( )。 (1)种内血清型 (2)种间血清型 (3)属间血清型 (4)属以上血清型 4．根据你所掌握的知识，你认为形态学特征在以下几类微生物中的哪一类分类鉴定中显得更加重要?( ) (1)病毒 (2)细菌 (3)酵母菌 (4)霉菌 5．在下列4种细菌中，哪一种最有可能属于 (3)自动微生物检测仪 (4)激光拉曼光谱仪 8．目前微生物的快速检测和自动化分析中，广泛地采用的免疫学技术是( )。 (1)DNA探针 (2)聚合酶链反应技术 (3)DNA芯片 (4)酶联免疫吸附测定法 9．第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是( )。 (1)螺旋体 (2)淋病奈瑟氏菌 (3)变形杆菌 (4)詹氏甲烷球菌 10．细菌的种名也用双名法命名，即种的学名由属名和种名加词两部分组合而成。第一个词的首字母要大写，该词是( )。 (1)种名 (2)属名 (3)人名 (4)科名是非题

微生物的分类和鉴定

第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释： 01.系统学（systematics）： 02.系统树： 03.分子系统树： 04.微生物分类学（microbial taxonomy）： 05.分类（classification）： 06.鉴定（identification）： 07.命名（nomenclature）： 08.培养物（culture）： 09.菌株（strain）： 10.标准菌株： 11.种群（population）： 12.种（species）： 13.型（form / type）： 14.亚种/变种（subspecies / variety）： 15.真菌（fungi）： 16.粘菌（slime molds）： 17.热原体（Thermoplasma）：

二、填空： 01.细菌分类鉴定的主要文献是（）。 02.对生物系统发育进行研究，最合适的揭示各类生物亲缘关系的大分子物质是 （），特别是（）。 03.rRNA序列测定和分析方法有：（）和（）。 04.对于序列目录资料进行分析比较，常采用（）和（）来 比较各微生物之间的亲缘关系。 05.系统树分为（）和（）两种形式 06.在系统树图型中分枝的末端和分枝的连接点，称为（），代表生物 类群；分枝末端的结代表仍生存的种类。 07.构建分子系统树，最常用的是（）。这种推断谱系的原则是：在所 有可能的谱系关系中，涉及进化改变的序列特征数最少的谱系是最可信的。 08.20世纪70年代，Woese根据16SrRNA（18SrRNA）序列分析，将生物界分 为三界（后改称三个域）：（）、（）、（）。1990年他又把它们改成为Bacteria（细菌）、Archaea（古生菌）和Eukarya（真核生物），并构建了三界（域）生物的系统树。 09.分类单元（taxon，复数taxa）是指具体的分类群。它有七个基本的分类等级 （或分类阶元）即：（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）。在微生物分类中，还有一些非正式的类群术语，如种以上的有

第10章 微生物分类与鉴定 复习题

《微生物学》复习题 第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释 1 系统发育树： 2 培养物： 3 菌株： 4 种： 6 属： 7 数值分类法： 8 模式（或典型）菌株： 9 DNA（G+C）mol%值： 10 三域学说： 二、是非题 1、“大肠埃希氏菌”才是俗称“大肠杆菌”的学名。（） 2、所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内了具代表的菌株。（） 3、两种细菌的G+C含量相近，说明它们亲缘关系近，反之，G+C含量差别大说明它们亲缘关系远。（） 4、DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远（属以上等级）分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（） 5、数值分类由于采用了先进的计算想技术，减少了大量的特征测定的实验操作，所以它是比较科学的现代微生物系统分类方法。（） 6、“吹口气查胃病”的原理是：幽门螺杆菌具有人体不具有的尿素酶，受检者口服13C标记的尿素，如有该菌感染，则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2，用质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量，准确地鉴定是否被幽门螺杆菌感染。（） 7、亚种名为三元式组合，即由科名、属名加词和亚种名加词构成。 8、现代微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系

统仍然是有意义的。 9、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速率高。 10．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。（） 11．G+C含量的比较主要用于分类中否定。（） 12.菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。（） 三、选择题（4个答案选1） 1、血清学试验，尤其在医学细菌的分类鉴定中的重要意义，但它主要用于划分（）。 （1）种内血清型（2）种间血清型（3）属间血清型（4）属以上血清型2、根据你所掌握的知识，人为认为形态学特征学特征在以下几类微生物中的哪严分类鉴定中显得更加重要？（） （1）病毒（2）细菌（3）酵母菌（4）霉菌 3、现在自动化程度最高、功能最多的微生物专用检测仪是（） （1）气相色谱仪（2）高压液相色谱仪 （3）自动微生物检测仪（4）激光拉曼光谱仪 4、目前微生物的快速检测和自动化分析中，广泛地采用的免疫学技术是（）。（1）DNA探针（2）聚合酶链反应技术 （3）DNA芯片（4）酶联免疫吸附测定法 5、第一个古生菌的全基因组序列测定结果初步证实了它是独立于其他两域生物的第三生命形式。该古生菌是（）。 （1）种名（2）属名（3）人名（4）科名 6. Micrococcus的译名为：（） A. 链球菌属 B. 微球菌属 C. 小单胞菌属 D. 四联球菌属 7. Bacillus的译名为：（） A. 假单胞菌属 B. 乳酸杆菌属 C. 梭菌属 D. 芽孢杆菌属 8. 假单胞菌属的拉丁文属名为：（） A. Xanthomonas B. Nitrobacter C. Pseudomonas D. Escherichia 9. 下列传统指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是（） A 形态学特征 B 生理特征 C 生态学特征

微生物的分类与鉴定 答案

第十章微生物的分类与鉴定(参考答案) 一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。