不同嫩度羊肉肌浆蛋白质磷酸化水平随宰后成熟时间变化的研究
不同嫩度羊肉肌浆蛋白质磷酸化水平随
宰后成熟时间变化的研究
陈立娟1，李欣1，杨扬1，陈丽1，倪娜1，张德权1,2
（1.中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）
（2.食品安全与营养协同创新中心，北京 100193）
摘要：本文研究了不同嫩度羊肉肌浆蛋白磷酸化水平随宰后成熟时间的变化。取40只羊宰后0.5 h、1 h、4 h、12 h、24 h背最长肌样品，根据24 h剪切力和肌原纤维小片化指数分为高嫩度组和低嫩度组。采用S DS-P AGE电泳、荧光染色等方法，分析肌浆蛋白的磷酸化水平。研究结果表明在宰后24 h内肌浆蛋白磷酸化水平在不同嫩度和宰后成熟时间处理组之间差异显著（P<0.05），低嫩度组的整体蛋白质磷酸化水平在宰后4 h达到最大，高嫩度组的整体蛋白质磷酸化水平在宰后12 h达到最大。宰后0.5 h、1 h、4 h 低嫩度组的肌浆蛋白整体磷酸化水平显著高于高嫩度组（P<0.05）。因此，肌浆蛋白磷酸化水平受不同嫩度和宰后成熟时间处理影响显著（P<0.05），磷酸化可能通过对宰后肌肉糖酵解的作用影响宰后肌肉僵直进程，进而影响肌肉嫩度。
关键词：羊肉；嫩度；宰后成熟时间；肌浆蛋白；蛋白质磷酸化
文章篇号：1673-9078(2015)4-95-101 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.4.016 Analyzing the Changes in Sarcoplasmic Protein Phosphorylation with Respect to Postmortem Ageing Times in Mutton with Different Levels of
T enderness
CHEN Li-juan1, LI Xin1, Y ANG Y ang1, CHEN Li1, N I Na1, ZHANG De-quan1, 2
(1.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chi nese A cademy of Agri cul tural Sciences, Key Laboratory of Agro-Products Processing, Mi nistry of Agri culture, Beijing 100193, China) (2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and
Nutri tion, Beijing 100193, China)
Abstract: The major aim of this study was to investigate the changes in the levels of phosphorylation of sarcoplasmic proteins with respect to the postmortem ageing time in mutton with different levels of tenderness. Longissimus muscle samples of 40 sheep were collected at 0.5, 1, 4, 12, and 24 h postmortem, and were divided into two groups (high-level-of-tenderness and low-level-of-tenderness) based on the shear force and myofibrillar fragmentation index (MFI) at 24 h postmortem. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was combined with fluorescence staining in order to analyze the level of phosphorylation of sarcoplasmic proteins. The results of these analyses indicated that groups with different degrees of tenderness and postmortem times showed significantly different levels of sarcoplasmic protein phosphorylation within 24 h (postmortem). The highest levels of protein phosphorylation in the low-level-of-tenderness and high-level-of-tenderness groups were observed at 4 and 12 h postmortem, respectively. In addition, the global levels of sarcoplasmic protein phosphorylation observed in the low-level-of-tenderness group at 0.5, 1, and 4 h postmortem were significantly higher than those observed in the high-level-of-tenderness group. Therefore, the level of sarcoplasmic protein phosphorylation was significantly affected by the varying degrees of tenderness and the different postmortem times (P < 0.05); moreover, it was theorized that protein phosphorylation influences rigor mortis in postmortem muscles through glycolysis, thereby affecting muscle tenderness.
Key words: mutton; tenderness; ageing time; sarcoplasmic proteins; protein phosphorylation
收稿日期：2014-07-28
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303083）；国家农业科技创新工程
作者简介：陈立娟（1988-），女，硕士研究生，研究方向：肉品科学与技术
通讯作者：张德权（1972-），男，博士生导师，研究方向：肉品科学与技术
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蛋白质是生物体细胞中主要的功能行使者，生命活动与蛋白质的动态变化密切相关。大多数情况下蛋白质的绝对量并不会发生显著变化，而是通过各种翻译后修饰来完成或改变其功能。常见的修饰方式有磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等，在数量众多的蛋白质翻译后修饰中，磷酸化修饰是最常见、最重要的一种，细胞发育、增殖、信号转导、凋亡、肌肉收缩等生命活动都受蛋白质磷酸化和去磷酸化这一可逆过程调节][1]。随着磷酸化蛋白质组学技术的发展，国内外已开展关于小鼠、牛、兔等动物肌肉组织蛋白质磷酸化的研究。
糖酵解作为宰后肌肉的主要能量代谢方式，是影响宰后pH下降速率的主要因素，对于宰后肌肉成熟过程具有重要意义。许多糖代谢酶如糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等都是磷酸化蛋白质，因此蛋白质磷酸化在宰后肌肉糖酵解中起着关键作用。例如，D'Alessandro (2013)[2]、Li(2012)[3]等人提出了“磷酸化诱导酶活降低”学说，认为磷酸化水平越高糖酵解酶活性越低，不利于宰后肌肉中糖酵解反应的进行。
pH、肌肉收缩和蛋白降解是影响宰后肌肉品质变化的重要因素，对肌肉的僵直进程和嫩化过程有重要影响。蛋白质磷酸化可以通过影响肌球蛋白轻链结构促进肌肉收缩[4]，通过影响钙蛋白酶抑制蛋白活性等降低蛋白降解[5]。但是目前国内关于宰后肌肉蛋白质磷酸化水平的研究较少。
鉴于蛋白质磷酸化反应对影响肉嫩化的pH、肌肉收缩和蛋白降解等因素有重要影响，本实验利用SDS-PAGE电泳和特异性荧光染色(Pro-Q Diamond)，研究不同嫩度羊肉中肌浆蛋白磷酸化水平随宰后成熟时间的变化，旨在为肉品嫩度的预测和改善提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
本实验所用材料为40只6月龄大尾寒羊×小尾寒羊的杂交公羊，未去势，胴体重20.08±1.71 kg。实验羊集中规模饲养，统一管理，同群且补饲条件相同。由山西朔州金龙养殖园区提供。
主要试剂：蛋白酶抑制剂（Roche Complete）和磷酸酶抑制剂（Roche PhosStop）购自瑞士Roche公司；蛋白浓度测定试剂盒（BCA protein assay kit）购自美国Pierce公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（methylene diacrylamide）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）购自美国Sigma 公司；Pro-Q Diamond、SYPRO Ruby染色液购自美国Invitrogen公司；乙醇、乙酸、乙腈等为国产分析纯试剂，购自北京化学试剂公司。
1.2 实验仪器
Testo 205便携式pH计，德国德图公司；TA-XT2i 质构仪，英国Stable Micro System公司；Ultra Turrax Disperser S25分散器，德国IKA公司；Neofuge高效冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；T6紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ML204/02电子天平，上海梅特勒-托利多有限公司；Chameleon V多功能酶标仪，芬兰Hidex公司；电泳设备（Mini-PROTEAN Tetra System），美国Bio-Rad 公司；Typhoon Trio多功能激光成像系统，美国GE 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 取样
采用清真屠宰法屠宰羊只，宰后立即剥皮取出背最长肌，在0 ℃下存放。从断喉时开始计时，分别取宰后0.5 h、1 h、4 h、12 h和24 h背最长肌样品，液氮速冻带回实验室，于-80℃冰箱中保存用于蛋白质磷酸化水平的测定。另取宰后24 h背最长肌样品用于剪切力的测定，保存于-20℃冰箱中。
剪切力的测定：参考农业行业标准[6]，取背最长肌在4℃条件下冷藏解冻12 h，剔除筋膜，将其修整为（6×6×3）cm的肉块，放入恒温水浴锅中80℃加热，待肉样中心温度达到70℃时，将肉样取出冷却至中心温度为（0~4）℃，切成（1×1×3）cm的小块，用质构仪测定其剪切力。
肌原纤维小片化指数(MFI)的测定：参考Culler(1978)等[7]的方法并稍作调整。剪取2 g经修整后的肉样品，放入匀浆器中，加20 mL预冷(2℃)的MFI缓冲液（100 mmol/L KCl，11.2 mmol/L K2HPO4，8.8 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L NaN3)），高速匀浆3次，每次20 s，匀浆后用50 mL离心管冷冻离心（1000 r/min、15 min、2℃），弃去上清，将沉淀用20 mL预冷后的MFI 缓冲液悬浮，再离心（1000 r/min、15 min、2℃），弃去上清，用5 mL预冷后的MFI缓冲液将沉淀充分悬浮，将悬浮液用150目滤布过滤除去结缔组织，再用5 mL MFI缓冲液洗离心管，并进行过滤，将过滤后的悬浮液用双缩脲法测蛋白浓度，然后用MFI缓冲液调整悬浮液蛋白浓度为0.5 mg/mL，在540 nm测吸光度，
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将所得结果乘200后便得到MFI 值。
pH 值的测定：用便携式pH 计在胴体左侧背最长肌第12~13肋处测定pH ，探头插入深度为2 cm ，连续测定3次，结果取平均值。
1.3.2 样品制备
参照Lametsch 等[8]的方法并稍作修改。将1 g 肌肉组织加入6 mL 预冷的缓冲剂（100 mM Tris ，10 mM DTT ，pH8.3，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂）中，用
(4热h 脱色：脱色液：10%乙醇，7%乙酸；脱色两次，每次约100 mL ，每次30 min 。
水洗：以双蒸水洗胶三次，每次约100 mL ，每次5 min ，避光操作。
使用Typhoon Trio 多功能激光成像系统对染色后的凝胶进行扫描。Pro-Q Diamond 染色后的凝胶在激发波长为532 nm 、发射波长为580 nm 、分辨率为200 mm 的条件下扫描。SYPRO Ruby 染色后的凝胶在激
剪切力为反应肉嫩度的最常用指标。肌原纤维的
小片化释放僵直时肌肉收缩所形成的张力，是肉嫩度增加的原因，二者具有高度相关性，MFI 也常被用作肉嫩度指标。因此，我们根据剪切力和MFI 将采集到的羊肉分为高嫩度组和低嫩度组。
2.2 肌浆蛋白SDS-PAGE 电泳图分析
低嫩度组与高嫩度组肌浆蛋白在宰后0.5 h 、1 h 、
4 h 、12 h 和24 h 的SDS-PAGE 电泳图谱如图1、图2所示。其中图1是Pro-Q Diamond 染色的磷酸化蛋白质，图2是SYPRO Ruby 染色的肌浆全蛋白。由图可见，条带平直清晰，分离效果较好。从图中选取18个较清晰条带，对其相对光密度进行分析。
实验分别用Pro-Q Diamond 染料和SYPRO Ruby
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染料来识别磷酸化蛋白质和全蛋白质，采用半定量方法，以Pro-Q Diamond 染色荧光强度与SYPRO Ruby 染色荧光强度之比作为每个条带的蛋白质磷酸化水平。条带1、4、6、7、8、10、15、16的P/T 值大于0.5，表明这些条带磷酸化程度较高。在Pro-Q Diamond 染色时颜色较深的条带4、6、10在SYPRO Ruby 染色时颜色较浅，而在SYPRO Ruby 染色时颜色较深的条带3、7、9在Pro-Q Diamond 染色时颜色却较浅，这种差别说明Pro-Q Diamond 染料对磷酸化蛋白的特
异性识别。
图1 羊肉磷酸化肌浆蛋白SDS-PAGE 图谱 Fig.1 SDS-PAGE image d isp laying the p hosp horylated
sarcop
lasmic proteins present in mutton
图2 羊肉肌浆全蛋白SDS-PAGE 图谱
Fig.2 SD S-PAGE image d isp laying the total sarcop lasmic protein
content present in mutton
2.3 不同嫩度羊肉中肌浆蛋白磷酸化水平随宰后成熟时间的变化
对电泳图中的18个条带进行分析，结果如表2所示，结果表明：条带3、6、18的磷酸化水平在不同嫩度和宰后成熟时间组之间差异显著（P<0.05），条带1、2、5、9、14、15的磷酸化水平在嫩度和宰后成熟时间的交互作用下差异显著（P<0.05），条带8、10、16的磷酸化水平仅在不同宰后成熟时间组之间差异显著（P<0.05），条带7的磷酸化水平仅在不同嫩度组之间差异显著（P<0.05）。不同蛋白质条带出现最高磷酸化水平的时间不同，条带6、14在宰后4 h 蛋白质磷酸化水平最高，条带8、10、17在宰后12 h 蛋白质磷酸化水平最高。另外，高嫩度组条带16、18的蛋白质磷酸化水平高于低嫩度组，低嫩度组的条带4、6、7、12、14、15、17的蛋白质磷酸化水平高于高嫩度组，说明低嫩度组的整体蛋白质磷酸化水平虽然较高，但并不是所有蛋白质的磷酸化水平都比高嫩度组高。
已有研究显示[10~11]
，条带3（102 ku ）可能为糖原磷酸化酶，糖原磷酸化酶的分子量约为97.4 ku ，本实验中分子量较大，推测原因可能是羊肉中糖原磷酸化酶被高度磷酸化，从而引起了分子量的变化，Huang （2012）等人的研究中也出现了同样的现象[9]
。糖原降解是通过磷酸化和去磷酸化动力学过程进行的，糖原磷酸化酶通常以无活性的去磷酸化状态b 存在，在
磷酸化酶激酶和Ca 2+
作用下糖原磷酸化酶丝氨酸-14位点被磷酸化，由无活性的b 转化为有活性的a ，并催化糖原降解为1-磷酸葡萄糖，然后转化为6-磷酸葡萄糖。条带4（83 ku ）可能为磷酸果糖激酶，磷酸果糖激酶可作用于果糖-6-磷酸，是糖酵解作用的限速酶之一，因此对该酶的调节是影响糖酵解作用的关键步骤。一方面，AMPK （即AMP 依赖的蛋白激酶）的激活会引起磷酸果糖激酶2磷酸化，磷酸化后磷酸果糖激酶2活性下降，减少2，6-二磷酸果糖产生，从而抑制糖酵解，减缓肌肉pH 值下降；另一方面，磷酸化的磷酸果糖激酶会改变与F-肌动蛋白的亲和力，而肌肉收缩会增加磷酸果糖激酶的磷酸化水平以及与F-肌动蛋白的结合[12]。条带7（58 ku ）可能为丙酮酸激酶，它也是糖酵解途径的限速酶之一。丙酮酸激酶催化磷酸烯酸丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸，生成的丙酮
酸在乳酸脱氢酶的催化下可变为乳酸，同时NADH 被氧化为NAD +
。但是有研究表明AMPK 会抑制L 型丙酮酸激酶的活性，进而抑制糖酵解。条带8（48 ku ）可能为β-烯醇酶，它是糖酵解过程的限速酶，既可催化糖酵解过程中2-磷酸甘油酸向磷酸-烯醇式丙酮酸的转化，又可在糖原合成过程中催化逆向反应，即作为磷酸丙酮酸水合酶，使磷酸-烯醇式丙酮酸向2-磷酸甘油酸转化[13]。条带14（27 ku ）可能为热休克蛋白
27，热休克蛋白27是一个涉及到细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，当细胞在受到胁迫时，热休克蛋白27表达量增加而且被磷酸化，使热休克蛋白27具有活性，执行保护肌动蛋白等的功能。
表2 不同嫩度羊肉中肌浆蛋白磷酸化水平分析
Table 2 Comparison of the sarcop lasmic protein phosphorylation b etw een two mutton group s with d ifferent d egrees of tend erness
条带
低嫩度组高嫩度组
0.5 h 1 h 4 h 12 h 24 h 0.5 h 1 h
1 0.86±0.05 0.86±0.1
2 1.00±0.07 1.29±0.15 1.02±0.11 0.60±0.06 1.22±0.09
12 0.13±0.02 0.16±0.03 0.11±0.01 0.799 0.058 0.060
13 0.56±0.03 0.34±0.04 0.22±0.01 0.774 0.118 0.937
14 0.34±0.04 0.28±0.01 0.58±0.06 0.703 0.002 0.002
15 2.24±0.12 2.59±0.17 2.67±0.13 0.471 <0.0001 0.001
16 0.72±0.06 0.85±0.07 0.87±0.03 0.725 0.018 0.493
17 0.25±0.01 0.42±0.02 0.35±0.02 0.677 0.272 0.754
18 0.37±0.05 0.38±0.02 0.33±0.04 0.001 0.002 0.032
注：表中各条带的磷酸化程度（P/T）以“平均值±标准差”来表示。
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以上几种酶大多与糖酵解有关，肌肉中绝大多数酶都存在于肌浆中，而糖酵解酶占肌浆蛋白的三分之二。糖酵解速率由糖酵解酶的活性决定，有研究表明，宰后初期糖酵解酶活性的增强对肌肉成熟过程有重要影响[14]。不管在体内还是体外，大部分糖酵解酶都可以被不同的激酶催化发生磷酸化反应，并且磷酸化反应会影响酶的活性或者稳定性。通过调控酶的活性，蛋白质磷酸化反应可以调控宰后肌肉糖酵解反应，进而影响肌肉的宰后僵直进程，对肉的嫩度具有决定性作用。因此，研究宰后肌浆蛋白质的磷酸化水平对于肉品质的调控具有重要作用。
2.4 不同嫩度羊肉中肌浆蛋白整体磷酸化水平随宰后成熟时间的变化
图3 不同嫩度羊肉中肌浆蛋白整体磷酸化水平比较
Fig.3 Comparison of global p hosphorylation levels b etween two mutton groups w ith different degrees of tenderness
注：图中不同字母表示同一处理不同时间点差异显著（P<0.05）。
由图3可见，低嫩度组和高嫩度组的蛋白质磷酸化水平都是呈先上升后下降的趋势，其中低嫩度组的最高蛋白质磷酸化水平出现在宰后4 h，高嫩度组的最高蛋白质磷酸化水平出现在宰后12 h。宰后0.5 h、1 h、4 h低嫩度组的肌浆蛋白整体磷酸化水平均显著高于高嫩度组（P<0.05）。肌浆蛋白整体磷酸化水平受嫩度、宰后成熟时间、以及嫩度和宰后成熟时间的交互作用影响显著（P<0.05）。
低嫩度组羊肉肌浆蛋白质磷酸化水平高于高嫩度组的原因可以从以下几方面分析：第一，根据D'Alessandro (2013)[2]，Li(2012)[3]等人的“磷酸化诱导酶活降低”观点，磷酸化水平越高大多数糖酵解酶活性越低。实验结果显示，低嫩度组磷酸化水平较高，高嫩度组磷酸化水平较低，因此在磷酸化作用的影响下，高嫩度组糖酵解酶活性较高，糖酵解速率较快、pH较低，更有利于组织蛋白酶释放、激活，促进蛋白质降解，进而有利于肉的嫩化[15]。第二，Doumit等[5]指出钙蛋白酶抑制蛋白会发生磷酸化反应，而钙蛋白酶抑制蛋白发生磷酸化反应后会增强对钙蛋白酶的抑制作用，减少钙蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解，不利于肌肉的嫩化。第三，热休克蛋白27的磷酸化是其发挥保护肌动蛋白不被破坏作用的关键步骤[16]，本实验中低嫩度组热休克蛋白27磷酸化水平较高，而发生磷酸化的热休克蛋白27越多则有越多的肌动蛋白被保护，处于完整状态，不利于肌肉的嫩化。第四，肌肉收缩会增加磷酸果糖激酶的磷酸化水平[12]，低嫩度组的肉肌肉收缩程度剧烈，因此其磷酸果糖激酶的磷酸化水平高。
宰后初期肌浆蛋白的磷酸化水平处于升高的趋势，这可能是由于宰后肌肉糖酵解反应使肌肉pH下降，激酶处于较适宜pH，其活性增强，蛋白质磷酸化水平升高。而随后蛋白质磷酸化水平逐渐下降，可能是由于随着宰后时间延长肌肉内A TP、GTP被消耗，无法提供足够的磷酸基团发生磷酸化反应，使得磷酸化水平下降。
3 结论
肌浆蛋白质磷酸化水平受宰后成熟时间和嫩度的影响，其最高磷酸化水平出现于宰后4 h或12 h。肌浆蛋白质的整体磷酸化水平呈先上升后下降的趋势，低嫩度组羊肉的整体蛋白质磷酸化水平在宰后0.5 h、1 h、4 h显著高于高嫩度组。蛋白质磷酸化水平通过影响酶活性和蛋白质结构稳定性而调控宰后肌肉僵直的进程，进而影响肌肉嫩度。进一步的研究可以分析蛋白质发生磷酸化后的结构变化及其影响肉品质的机理。
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磷酸化蛋白的富集
TiO2法磷酸化富集 试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响 共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。流程： 1.TiO2 Beads 活化 ①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清； ②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清； ③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。 2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。 3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。 4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。 5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 4、5、6合并到一起，为Flow Through。 7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。
蛋白质磷酸化概述
蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在
酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情
磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...
摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost
全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测
全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测 蛋白磷酸化是一种重要的翻译后修饰方式，调控广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯等。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。 传统的检测蛋白磷酸化的方法： ? 放射性同位素标记 ? Western Blot ? 酶联免疫吸附分析（ELISA） ? 流式细胞仪和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC/IHC） ? 质谱——由于磷酸化蛋白的信号较弱，目前还具有一定的难度。 需要特异性的磷酸化抗体！！！ 可是，没有磷酸化抗体怎么办呢？ Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子，可取代传统的酶免疫法和放射性同位素法，用来分离和检测磷酸化蛋白。 有两类： Phos-tag Acrylamide和Phos-tag Biotin。 Phos-tag Acrylamide Phos-tag Acrylamide 分离：SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白
该方法可以在同一个电泳条带里面同时观察靶蛋白的不同磷酸化状态，以及外因引起的磷酸化状态的改变。 有老师可能会问，这么好用的产品，怎么操作呢？ 只要在配置SDS-PAGE胶的时候，将phos-tag配成的溶液加入分离胶里面，就配置成Phos-tag聚丙烯酰胺凝胶了，后续用跟常规SDS-PAGE一样的步骤进行操作就可以，用起来简单的呢。 如果想进一步确认一下分开的这些条带是不是你要的蛋白，可以用常规的抗体来确认（常规抗体就可以代替多个磷酸化抗体哦，省时省钱又省力）。 详细的protocol可见APExBIO官网哦！ 特点 ? 非放射性元素，非荧光物质 ? 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带 ? 操作简便，与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似 ? Phos-tag 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关 ? Phos-tag SDS-PAGE实验后，可进行常规的免疫组化、质谱等 ? 性质稳定，溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月 ? 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测 ? 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来 应用举例
蛋白质磷酸化1
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集 在线酶解与快速鉴定 项目申请人：袁敏婷黄懿 指导教师：杨芃原 摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。 关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解 1.引言 蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。 蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。 在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸
磷酸化蛋白质组学
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 图片来源：https://www.sodocs.net/doc/329920332.html,/wiki/Phosphoproteomics
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发
磷酸化蛋白的western blot百替生物
下面是我从在丁香园上看到的一篇文章，看得出来，作者是做做磷酸化蛋白的western blot 的高手！我整理了出来特想与大家分享！来源于 https://www.sodocs.net/doc/329920332.html,/bbs/post/view?bid=68&id=11443307&sty=1&tp g=1&age=0 我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了。我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之western blot提出以下建议，供刚入门的同仁参考： 1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。 2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。 3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。 3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。 4.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。 5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。
6.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对. 7.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则backgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅. 8.磷酸化蛋白WB时,用TBST洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可,宁愿background深一些,总比做不出来强得多.另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。 9.附件中表格列出的是我所用的做磷酸化蛋白western blot的lysis buffer 的配方,效果不错,供您参考. 10.对我的lysis buffer配方作以下说明: (1)Na3VO4要活化 (2)我的配方配的是100ml 细胞裂解液,但如您各个成分的体积加起来,会发现total=102.1ml,那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的. 11.正如我在第5点所说的,"研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量“。这有两种方法，一是：相同的sample在不同的well 中上样两次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一压磷酸化蛋白，另
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。
磷酸化蛋白质组学的研究及其应用
磷酸化蛋白质组学的研究及其应用 郝文杰生物化学与分子生物学 201421191526 摘要：蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法及其在生命领域的应用前景。 关键词：蛋白质；磷酸化；翻译；方法；检测 在对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物开发研究中，往往需要获取一些高通量、大样本、全局性数据，通过整体化系统性分析，从中寻找线索，推断可能的病因以及诊断靶标，由此诞生了诸如基因组学、蛋白质组学及代谢组学等建立在网络架构式研究思路基础上多种新的研究方法和理论。生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应,这些反应过程靠复杂的调控机制调节, 其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的[1]。目前,已发现20多种蛋白质翻译后修饰,以至一种基因产物可呈现磷酸化修饰、糖基化修饰、羧基化修饰、乙酰化修饰以及连接变异体等多种形式[2]。 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性,以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程,并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式[3]。目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[4]。 磷酸化蛋白质组学的研究尚处于初期阶段，鉴于其特殊的研究方法及内容，对揭示生命体尤其是疾病状态下细胞信号传导具有不可替代的优势[5-7]。此外， 磷酸化蛋白质组学的研究为寻找药物新的作用靶点和疾病诊断指标提供全新的 研究思路。本文就磷酸化蛋白质的检测、定量技术及其在生物领域的研究进行综述。 1.蛋白质磷酸化研究概况 蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导中的核心,在生命系统中发挥着重要作用。在真核生物中常见的三种磷酸化形式,丝氨酸磷酸化最多,苏氨酸磷酸化次之,而酪氨酸磷酸化最少,三者的比例是1800∶200∶1[8]。丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的磷酸化是非常重要的蛋白质功能调节器[9],正确解析磷酸化蛋白质的结 构以及为磷酸化的位点是磷酸化蛋白质组的主要任务之一。另外,蛋白质磷酸化在机体内是动态的过程,不同条件下蛋白质磷酸化的定量分析是差异蛋白质组学研究的重要内容。 2.磷酸化蛋白质的主要检测技术 2.1放射性标记法 放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法,是将用放射性同位素P标记的磷酸化蛋白质,经分离、富集后,利用放射自显影技术进行磷酸化蛋白质的检测。若要进一步分析磷酸化位点,则需要通过蛋白酶解消化,再通过Edman降解或质
磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项
磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项 1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制 剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。 2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量 的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，Proclin TM 等，保存时间更长）。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。 3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司 做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体 4.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用 含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。 5.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。 6.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p 38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标acti n。 7.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体 不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers 的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对. 8.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则b ackgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.
蛋白质修饰位点预测详解
蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)
（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点， 并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.sodocs.net/doc/329920332.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.sodocs.net/doc/329920332.html,/disphos/
PhosphoSitePlus:https://www.sodocs.net/doc/329920332.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：fasta.txt
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的,包括细胞
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 磷酸化Western Blot 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens 为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。 与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项： 首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如
蛋白质可逆磷酸化
蛋白可逆磷酸化 ——1992年诺贝尔生理和医学奖简介 龚祖埙（中科院上海生物化学研究所）由于在蛋白质可逆磷酸化研究方面的贡献，1992年诺贝尔生理和医学奖授予美国西雅图华盛顿大学的两位生物化学家——克雷布斯（Edwin Krebs）和费歇尔（Edmon Fisher），诺贝尔奖委员会在宣布授予他们诺贝尔奖时宣称:“我们现在已确定在整个基因组内大约有1%的基因编码蛋白质激酶，这些激酶调节至细胞内成千上万蛋白质的功能”。的确，蛋白质可逆磷酸化及其有关的第二信使调控，蛋白质激酶和磷酸脂酶的研究已经成为当代生物化学、生理学、细胞生物学、分子生物学研究的一个最活跃最吸引人的研究领域。蛋白质可逆磷酸化和如此众多的生命过程相联系，诸如细胞生长，组织分化，基因表达，肌肉收缩，能量利用和肿瘤转化等，可以毫不夸张的说，它参与了每一个生物的“生”和“死”的过程。 50年代初，克雷布斯从事肌肉代谢的研究，当时对肌肉收缩的能量代谢很感兴趣，因此对肌肉内糖原酵解过程的调节给以特别注意。费歇尔博士当时在瑞士日内瓦大学从事植物酶学的研究。从1953年开始，由于共同的兴趣，他们在美国西雅图华盛顿大学开始携手合作，并且很快发现，磷酸酶在从高能化合物——腺苷三磷酸（ATP）处获得无机磷后，由非活性转化为火星状态。如果该酶在去磷酸化后，即蛋白质分子失去与其共价键结合的无机磷后，酶的活性又消失。正如细胞内其它所有的生物化学反应一样，蛋白质的可逆磷酸化反应也是由酶来调控的。因此他们的下不宜目标是寻找相应的酶，他们两人发现了第一个这样的酶，并称之为激酶（kinase）。激酶是负责蛋白质磷酸化的酶，以后他们又发现了去磷酸化的酶，并称之为磷酸酯酶。 回顾历史，在同一个研究方向或领域内，先后获得三次诺贝尔奖的可以说是绝无仅有的，而糖原酵解和蛋白质磷酸化的研究则是唯一的例外克雷布斯在40年代末期曾在美国圣路易斯的华盛顿大学医学院科里（Gerty Cori）实验室工作。而科里由于在糖原酵解研究中发现磷酸化酶的活性和非活性两种形式，于1947年获诺贝尔奖。尽管在当时尚不知这有两种形式的酶在结构上的差异。这一结构上的差异——即蛋白质可逆磷酸化正是在45年后授予克雷布斯和费歇尔诺贝尔奖的主题。在这长达近半个世纪的过程中，我们还应提起和磷酸化酶研究有关的另一个诺贝尔奖获得者——萨瑟兰（Earl Sutherland）。他也在颗粒实验室进行过研究，由于发现环腺苷酸（cAMP）作用而获得1971年的诺贝尔奖，这是和磷酸化酶有关的第二个诺贝尔奖，目前cAMP被广泛称为“第二信使”，在细胞功能的调控中，它的重要性是显而易见的。 1.蛋白质的可逆磷酸化 细胞内每时每刻进行着成千上万的生物化学过程，细胞又能够迅速对细胞内环境和外界刺激产生响应，这些过程都有一个复杂的调控机制，大多数是直接或间接地由蛋白质构象变化介导的，而蛋白质本身构想的变化则是由变构效应或各种修饰来实现的，如二硫键的配对，蛋白水解酶的加工，蛋白质的可逆磷酸化则是一种最常见，也是最重要的共价修饰方式。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化常伴随着这一蛋白质生理活性的激活和失活，因此这是一个动态的过程。蛋白质的可逆磷酸化需有两种专一的酶来协助完成，磷
磷酸化蛋白质组如何鉴定
磷酸化蛋白质组如何鉴定 接着上次的内容，今天，小编跟您聊聊磷酸化蛋白质组鉴定！ 蛋白质翻译后修饰（PTMs）几乎参与了细胞所有正常生命活动的过程，并发挥十分重要的调控作用。蛋白修饰已经成为国际上蛋白质研究的一个极其重要的领域，目前研究比较成熟的有磷酸化、乙酰化、糖基化、泛素化等。 蛋白质磷酸化是生物体中最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，一直是生物学研究的重点与热点。根据客户需求，金开瑞蛋白质组平台可提供磷酸化蛋白质组全谱鉴定、label-free定量技术服务。 磷酸化蛋白质组全谱鉴定以组织、细胞等较为复杂样本为研究对象，目的在于鉴定样品中发生磷酸化的蛋白质以及相应的磷酸化位点。首先对蛋白样本进行酶解，TiO2或IMAC-Fe 或IMAC-Ti富集磷酸化多肽，5600-plus质谱检测，利用得到的质谱谱图与相应数据库搜索比较，从而得到肽段序列结果，同时通过生物信息软件计算出磷酸化位点。对于磷酸化位点鉴定，为了增加定位修饰位点的准确性，金开瑞采用较流行的Ascore算法对发生在各位点的磷酸化修饰做进一步打分评估，从而正确辨别真实修饰位点。 技术路线：
技术特点： ●富集方法特异性高，对低PH溶液、去垢剂、盐类、其它低分子污染物有更高的耐受性，容易与非磷酸化肽段分离； ●通量大，一次可以鉴定1000个以上磷酸化位点。 适用范围： ●已知物种基因组序列、ESTs序列或蛋白质序列全库； ●无其他特别要求。 经典案例： 题目：Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated withlung cancer metastasis using label-free quantitative analyses.（用Label-free定量技术鉴定肺癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白） 期刊：Journalof proteome research 主要技术：Label-free定量技术 文章摘要：酪氨酸磷酸化（P-酪氨酸）蛋白可参与肺癌的侵袭和转移，但目前已被报道的数量还较少。本文采用Label-free定量技术进行大规模研究酪氨酸磷酸化蛋白及其参与转移过程的情况，共鉴定到来自276个磷酸化蛋白的335个P-Tyr位点。Label-free定量结果显示，有36个磷酸化肽在不同酪氨酸磷酸化蛋白侵袭能力的样品间呈现显著差异。从这些肽段中提取了两个新的位点保守序列和4个已知的特定激酶和磷酸化motif序列：EGFR, Src, JAK2和TC-PTP。通过对P-络氨酸蛋白的蛋白相互作用分析发现，有11个蛋白连接在包含EGFR, c-Src, c-Myc和STAT的互作网络中，该网络已被确认与肺癌转移相关。这11个蛋白中有7个之前未报道，这将提供一个更好的、全面的了解肺癌的侵袭/转移的机制及治疗方法。 图：新发现的三个motif展示 Wu HY, Tseng VS et al. Identification of tyrosine-phosphorylated proteins associated with lung cancer metastasis using label-free quantitative analyses.Journal of proteome research