2013：microRNA检测方法的研究进展_韦荣昌

韦荣昌，赵

欢，马小军，等．microＲNA 检测方法的研究进展［

J ］．江苏农业科学，2013，41（9）：17－19．microＲNA 检测方法的研究进展

韦荣昌1，2

，赵

欢2，马小军

1，2，3

，唐其1，韦树根1，2，覃喜军2，涂冬萍

2

（1．广西药用植物园，广西南宁530023；2．中国医学科学院＆北京协和医学院药用植物研究所，北京100193；

3．中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南景洪666100）

摘要：microＲNA （miＲNA ）是一类长约22个核苷酸（nt ）的内源性非编码小分子单链ＲNA ，通过下调蛋白编码基因

的表达，对不同的生理和病理过程起重要的调控作用。准确而灵敏地检测组织或细胞中miＲNA 的表达水平，可为研究其功能鉴定和作用机制提供帮助。本文就近年来有关miＲNA 检测方法的研究进展作一综述。

关键词：microＲNA ；检测方法；研究进展

中图分类号：Q789

文献标志码：A

文章编号：1002－1302（2013）09－0017－03

收稿日期：2013－02－24

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2011BAI01B03）。

作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，博士研究生，研究实习员，主要从事生药学研究。E －mail ：wrc830612@163．com 。通信作者：马小军，博士，研究员，主要从事生药学研究。E －mail ：xjma@public．bta．net．cn 。

microＲNA （miＲNA ）是一类长约22个核苷酸（nt ）的内源

性非编码小分子单链ＲNA ，

普遍存在于各种动植物中，由长约70nt 的具有茎环结构的pre －miＲNA （precursor

microＲNA ）剪切而来，在进化上具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miＲNA 通过与靶基因mＲNA3'非翻译区（3'UTＲ）相互作用在转录后水平上调控mＲNA 的翻译，进而

广泛作用于发育、

细胞分化、细胞凋亡、脂类代谢和激素分泌等多种生理过程［1］

以及炎症、肿瘤、白血病、糖尿病等多种病

理过程。然而，

由于研究方法的单一或缺乏，绝大多数miＲ-NA 的功能和作用机制尚不清楚，因此，有效而且适用的试验技术和生物信息学方法，对研究miＲNA 的功能及其参与的生

物学过程具有十分重要的意义。1miＲNA 检测的试验技术1．1

miＲNA 克隆

迄今为止，

cDNA 克隆仍不失为一种寻找新miＲNA 的有效手段，大部分已知靶基因的miＲNA 都是通过直接克隆发现和鉴定的

［2－5］

。小ＲNA 的克隆首先利用PAGE 分离目的组

织或细胞中约22nt 的ＲNA ，

，逆转录并通过PCＲ扩增获得miＲNA 的cDNA 文库，

然后对这些扩增产物进行克隆、测序，并与基因组数据库BLAST 比对，排

除非miＲNA 后

，最后通过PAGE /Northern blotting 予以

验证

［6－7］

。直接克隆对于生物体内常表达和高丰度的基因来说，可

以获得完整的miＲNA 序列。然而对于一些在生物体内浓度很低（表达量低、表达产物极不稳定或前体到成熟的加工效率低等原因引起），或者只在生物体的特定组织器官及时期中表达的miＲNA ，直接克隆则无能为力。此外，miＲNA 特有的物理结构也给直接克隆、测序等带来困难。

1．2PAGE /Northern blotting

PAGE /Norhtern blotting 是目前检测miＲNA 表达最主要

的方法［8］

，所有克隆和生物信息学分析得到的miＲNA 都必须经过PAGE /Norhtern blotting 来验证和确认。Northern 杂交通

常采用同位素（如γ－32

P －dATP ）、

荧光（如Cy3、Cy5）或纳米金标记反义寡核苷酸5'末端作为探针，这个过程简便快速。这种方法的缺点是样品的需求量大，灵敏度低且不能进行高通量的检测。目前，用锁定的核苷酸探针（LNA ）来取代传统DNA 探针的技术［9－10］显著改善了Northern 杂交的检测灵敏

度和特异性。LNA 是一种寡核苷酸衍生物，

具有高亲和性，可掺入到DNA 中的任何位置，含有LNA 的探针与靶分子结

合后的双链热稳定性提高。基于LNA 的探针杂交技术已被广泛应用于miＲNA 的检测（包括原位检测）中［11－13］

。

1．3微阵列芯片

微阵列芯片（microarray ）能够在短时间内同时测定多个

样本，

实现所有已知miＲNA 表达谱的高通量分析［7，14］

。该方法即在一块芯片上同时固定多个与miＲNA 序列互补的探针，

加入经过标记的样本ＲNA 并杂交，最后进行信号检测。但微阵列芯片仍避免不了假阳性问题，

杂交后的处理步骤中，洗涤条件不同对检测结果有很大的影响，

故所得信息需要经过PAGE /Northern blotting 、real －time PCＲ等技术加以确认

方可［15］

。1．4

实时定量PCＲ

所谓实时定量PCＲ（real －time PCＲ），是指在PCＲ反应

体系中加入荧光基因，

利用荧光信号积累实时监测整个PCＲ过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量及定性分析的

方法［16］

17－18］

。应用实时定量PCＲ，既可定量检测miＲNA 前体又可检测成熟

miＲNA 的表达水平，此外还经常用于验证预测的miＲNA ，这对研究miＲNA 的表达调控具有重要的意义。根据生物体发育过程中不同阶段miＲNA 的表达差异可以准确地观察存在于miＲNA 基因转录水平或Drosha 和Dicer 作用过程的调控，从而可以更加深入地了解miＲNA 的起源和发生。由于实时定量PCＲ的高度敏感性（可检测出低至100ng 的样品），

Tang 等利用该技术对单个人胚胎干细胞中220个miＲNA 的表达

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谱进行了考察［19］。实时定量PCＲ的方法现已成为miＲNA的定量检测的主要工具，一方面它与其他分子生物学技术相结合使定量极微量的miＲNA基因表达成为可能；另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展，使定量PCＲ技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于miＲNA应用于临床诊断和治疗。

1．5利用各种酶活性检测miＲNA

利用酶的不同功能巧妙地使其参与到检测过程中，可达到对miＲNA的定量检测。目前，已有研究利用裂解酶［20］、核酶［21］、phi29DNA聚合酶［22－23］、T4DNA连接酶［24］进行miＲNA的检测。其中，裂解酶法是将与被检测目标结合的DNA序列改进成发卡结构，以防止miＲNA前体等的干扰，增强检测特异性，2个发卡结构末端序列与ＲNA杂交配对，其中1个发卡结构的突出序列在酶的工作切口处用FAM荧光染料修饰，而在不远处修饰淬灭染料，当发卡尾部序列与ＲNA完全匹配时，裂解酶就会切掉重叠部分，FAM与淬灭染料分离并释放荧光，从而进行miＲNA的定量检测。该法操作简便，对试验设备要求低，灵敏度高达104个miＲNA，可以通过退火温度控制杂交来提高检测的特异性［25］。

1．6新一代高通量测序

随着分子生物学技术的进步，454、MPSS和Solexa等高通量测序技术的应用为各物种的miＲNA鉴定与定量分析提供了良好的研究平台。高通量测序在检测miＲNA方面具备很多优势，其中Solexa测序技术可同时检测上亿个核苷酸片段，且测定成本仅为常规毛细管电泳测序技术的1%左右，可快速测定全基因组序列，是下一代测序技术中高质量、高通量、低成本的测序技术。在检测miＲNA时，先将miＲNA反转录生成cDNA，再将cDNA连接到带有大量固定接头的flow cell 上，然后使用桥式扩增得到大量的簇群，最后进行测序，一次试验可以读取长度为17 35nt的40万 400万条序列，因此可直接获得所有miＲNA的序列信息。根据目标miＲNA的出现频率可方便地计算其相对丰度［26－27］，实现miＲNA的鉴定和定量分析的目的。Solexa测序技术可以发掘、鉴定并定量出所有物种全基因组水平的miＲNA图谱，是解密miＲNA 图谱的好方法。例如，有研究者应用Solexa测序技术分析了人胚胎干细胞分化前后的miＲNA表达谱［28］。2011年，唐其等首次利用第二代高通量Solexa测序技术对罗汉果果实的转录组及授粉后3、50、70d的表达谱进行高通量测序，获得了43891条Unigenes，其中与罗汉果次生代谢相关的Unigenes 有739条，涉及萜类骨架合成的Unigenes有60条；利用转录组数据发现了罗汉果甜苷V生物合成通路中所有的基因，涉及到20种罗汉果苷骨架合成基因和2类结构修饰基因（细胞色素P450基因和糖基转移酶基因）；此外，还得到了80条P450基因、72条糖基转移酶基因和90条葡萄糖基转移酶基因的Unigenes；结合表达谱筛选，获得了6条可能与罗汉果甜苷V合成相关的候选UDPG基因［29］。转录组和表达谱的破解为罗汉果功能基因组以及甜苷V生物合成分子机理研究打下了坚实的基础。

2miＲNA的生物信息学预测

随着各物种基因组序列及EST序列的获得，人们根据miＲNA在进化过程中的保守性、其前体pre－miＲNA具有茎环结构及其二级结构自由能最低等特征开发了一系列预测软件。其中，ＲNA fold是一种预测miＲNA二级结构的软件，通过计算DNA/ＲNA序列的最低自由能，结合二级结构图形化结果，确定该序列是否为形成miＲNA的候选基因。Zhao等用该方法预测了14个花生的新miＲNA［30］；Lai等用miＲseeker 预测出48个果蝇的候选miＲNA，其中有24个已被试验所验证［31］；Lim等通过MirScan软件，分别在人和线虫中鉴定了38个和30个新的miＲNA［32－33］；Grad等利用snarloop软件已经预测了214个线虫的候选miＲNA［34］。2009年，miＲ－ＲACE 技术产生了，克服了生物信息学预测中无法确定miＲNA两端精确序列的缺点，具有广泛的通用性。Yu等利用该方法从324000条苹果EST中预测了31个候选miＲNA，隶属于16个miＲNA家族［35］。

通过miＲNA预测软件预测的大量候选基因中，只有少数已被试验验证，但那些没有被试验检测到表达的miＲNA，并非就一定是假阳性结果，因为这些候选基因的表达模式可能尚未被人们所了解，或是现有的试验条件无法将其检测出来。

3问题与展望

近年来，越来越多的miＲNA被发现和鉴定，但无论在理论上还是在应用上，miＲNA的研究还仅仅是一个开端。为了有效地发现和鉴定更多的miＲNA，需要把试验技术和生物信息学方法结合起来。目前，功能诠释较为完整的mir－223和mir－375，都是试验技术和生物信息学方法完美结合的研究典范［1，36］。试验技术可以提供直接而有力的证据，但在研究对象的选择上受到约束，不能很快对大量候选者进行逐个验证，而生物信息学为miＲNA研究提供了有益的线索，可以指导试验的进行，但仍需通过试验技术加以确认［37］。

随着新技术新方法的不断发展，人们在miＲNA的检测方面有了更多的选择，但必须综合考虑具体的试验目的和各种方法的优缺点，以获得最佳而又最经济的试验结果［38］。下一代高通量测序技术逐渐成为一种新的疾病诊断和新型生物医药制剂研发的工具，以调控机体生命活动的miＲNA为靶点或以miＲNA为治疗手段的设想，将可能成为研究热点。

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