高级生物化学研究技术
生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等
生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法
生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存
生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。
1 离心技术
1.1 基本原理
离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。
应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。
生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。
相对离心力
离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。
1.2 离心分类
根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation）
1.2.1 差速离心法
利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。
差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
关键是选择适合于各分离物的离心力。例如差速离心分离细胞组分
1.2.2 速率区带离心法
速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心。
离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大；
但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。
根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。
梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。
由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。
如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的时间使在介质中分离形成区带。
由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。
常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。
离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。
沉降系数越大，沉降越快。离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时
结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。
离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。
离心时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。较长的离心管有助于提高分辨率。
1.2.3 等密度离心法
等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。
等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯度），此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯度液混在一起。
在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。
当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。
沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。
体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。
但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。
此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。
1.2.4 梯度溶液的制备
?梯度材料的选择原则
理想梯度材料具备的特点：
①化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分离的生物粒子分开②溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。
③不会对离心设备发生腐蚀作用。
④容易纯化，价格便宜或容易回收。
⑤较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料，浓度便于测定。
⑥物理性质、热力学性质应该是已知的。
但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完美梯度液。
基本符合原则的梯度材料：
①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原
②无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等
③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等
④硅溶胶：如Percoll
⑤蛋白质：如牛血清白蛋白
⑥重水
⑦非水溶性有机物：如氟代碳等
?梯度材料的应用范围
①蔗糖：水溶性大，性质稳定，其最高密度 1.33g/ml，价格低易制备。但渗透压较高，高浓度时粘度较大。线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V。
用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性，不宜用于细胞的分离。
②聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400（相对分子重量400000），Ficoll渗透压低，而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、
鼠肝细胞等。
③CsCl：为离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。
④卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
⑤Percoll：商品名，是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，不穿透生物膜，对细胞无毒害，对生物材料的影响小，颗粒稳定。在冷却和冻融情况下稳定，粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳定。用于细胞、细胞器和病毒的分离。
蔗糖适宜做速率区带离心的材料，而等密度离心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。
密度梯度液可用梯度仪制备线性梯度，也可人工辅设阶梯型梯度，离心管静置一定时间后也可以形成近线性梯度。
阶梯型不连续梯度多适用于从组织的匀浆中分离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯化。连续梯度由于其密度平滑地变化，多用于某些生物样品的多种成份组合的分离。
选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于材料的性质。如果些胶体硅材料（Percoll或Ludox）可在10000~20000g的离心场中离心30min就可以自形成梯度。但CsCl或Meterizamide需要50000~500000g的离心场中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度.
如用CsCl做质粒DNA分离，梯度液中加EB和Triton x-100，在490000g需要离心4hr，才能利用CsCl的自形成梯度分离出质粒DNA，染色体DNA，RNA和蛋白质。
预形成梯度的优点是离心时间较短，因为只要考虑样品中某个组份到达其等密度区所需要的时间。预形成梯度常被用来分离较大颗粒，如>100S的样品。
预形成梯度缺点是被分离样品的容量较少；对某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产生颗粒聚结，从而减少了样品回收率和纯度；预先制备样度液需较长时间，较繁复。
自形成梯度：某些梯度材料能够在离心过程中形成密度梯度，Ludox、Percoll中的胶体硅颗粒可较快地形成梯度，而另一些材料如CsCl、Cs2SO4和Metrizamide等则在沉降过程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡的时间就比较长。如果为了提高分辨率，自形成梯度是很难使梯度曲线变得陡一些的。
1.3 离心设备
离心机分为工业用和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。
制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。
分析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。分析性离心机都是超速离心机。
1.3.1 离心机的种类
普通离心机
转速2000~6000rpm，RCF可达6000g；容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，转速控制不严格，一般无制冷系统，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。
普通离心机以交流电动机驱动，电机碳刷易磨损，利用电压调压器调节转速，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此必需进行精确平衡，以免损坏离心机。高速离心机：转速20000~25000rpm，RCF可达89000g，最大容量可达3升，分离形式是固液沉降分离。
转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头。一般有制冷系统，以消除转头与空气摩擦而产生的热量（温度0～40℃），转速、温度和时间都可严格准确地控制。通常用于微生物菌体、大细胞器、蛋白质硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作。
超速离心机：转速50000~80000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多
糖等生物大分子的分离。
按性能可分为分析型、制备型和分析制备型三种。
超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。
驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动，由微机控制。
驱动轴较细，在旋转时有一定的弹性弯曲以适应转头轻度的不平衡。
具有过速保护系统，防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸，离心腔用装甲钢板密闭。
温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控，红外线温控比高速离心机的热电偶控制装置敏感和准确。
超速离心机装的真空系统：离心机的速度＜2000 rpm时，转头与空气磨擦产生的热量很少，速度＞20000 rpm时，磨擦生热显著增大，当速度＞40000 rpm时，磨擦生热则非常严重，因此，将超速离心机的离心腔密封，并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达到所需的超高转速。
1.3.2 离心机的组成及使用
离心机一般由：主机、转头、离心管组成。
转头有不同容量和性能可供选择，按离心管与离心机转轴的夹角可分为角转头和水平转头。
高速离心机和超高速离心机的转头都有使用一定的寿命。
角式转头：离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的孔，孔的中心轴与旋转轴间有20～40°夹角，角度越大沉降越结实，分离效果越好。
角转头的优点：容量较大、重心低、运转平衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。
主要用于差速离心，在高速离心机上也可用于等密度离心，例如DNA平衡等密度离心，自形成梯度，常用转速40000~60000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。
缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积而产生“壁效应”，壁效应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱而影响分离效果。
由于壁效应影响很大，用于速率区带离心时回收率低，纯度也受影响，一般只用于差速离心和等密度离心，离心时间较短。
荡平式转头：转头是由吊着的4或6个自由活动的离心套管构成。当转头转速达到200～800rpm 时，吊桶荡至水平位置，适用于密度梯度区带离心。
优点：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。
缺点：颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。
壁效应少，适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。由于结构的原因最高转速较低（一般在60000rpm以下），因而离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高转速在40000~41000rpm，用作自形成CsCl梯度的质粒DNA离心往往需要50~70hr。
细长离心管用于速率区带离心可获得较高的纯度和分辨率，且容易控制离心时间。
25000rpm~30000rpm的甩平转头适用于亚细胞器的离心分离，40000~42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒类物质的分离。
垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，最适合用于密度梯度区带离心和等密度梯度离心。
转头转速很高，转速可达100000rpm（70000g），离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。
近垂直转头：管轴与旋转轴间倾角7~9°，沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩平转头短。由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑向低部，基本上消除了沉淀与浮动区带转换间的干扰，用于速率区带离心和生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。
用于DNA、RNA和蛋白质等的等密度离心，转头的最高转速达90000rpm（近650000g），离心时间相比垂直转头稍长。
离心管主要以塑料、玻璃或不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，PP管性能较好。
1.4 分析性超速离心
与制备性超速离心的不同在于：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。
1.4.1 工作原理
分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。
该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其中容纳二个小室：分析室和配衡室。
配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析室的平衡用。
分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。
分析室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折谢率的不同对沉降物进行监视。
原理：当光线通过一个具有不同密度区的透明液，在区带界面上产生光折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，“峰”也在移动，从峰移动的速度可得到物质沉降速度的指标。
分析性超速离心系统图示
1.4.2 分析性超速离心的应用
①测定生物大分子的相对分子量
利用沉降速度法测定相对分子量。超速离心机的高速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标。
照相记录，即可求出粒子的沉降系数。
②生物大分子的纯度估计
分析性超速离心可应用于分析DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。
③分析生物大分子中的构象变化
分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化。
例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆。
这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。
1.5 使用离心机的注意事项
离心时要保证离心管的对称平衡。例如，当离心转速达10000～50000rpm时，如果对称管相差1g，转头半径5cm，根据离心力公式：
F=m×RCF，查表10000rpm时的RCF=6000，代入公式
F=1×6000=6kg
50000rpm时RCF=150000，F=150kg
此时引起两边不平衡可达6～150kg，对离心机将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。
1.5.1 普通离心机注意事项
①离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。
②离心管必须仔细，对称平衡。
③机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。
④必须慢起动，然后逐渐加速。
⑤离心时不准打开离心机盖。
⑥停止离心时不许用手刹车。
1.5.2 高速冷冻离心机注意事项
①未经过培训和考核者不能使用。
②选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。
③选择合适的温度，通常4℃，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转头。
④转头使用前必须用擦孔棒将管孔擦净，并仔细检查有无裂痕和孔底白斑。否则转头报废。
⑤离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装2/3，塑料管可装至“肩”部。管盖需盖严不能漏液。若离心管盖密封性差，液体不能加满（高速离心且使用角度头），防止外溢失去平衡和污染转头及离心腔。
空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。
由于超离时需抽真空，因此液体一定要加满离心管，以避免离心管变形。
使用角度头时要加转头盖，否则离心腔内会产生涡流阻力并引起摩擦升温，影响离心机的使用寿命。
⑥离心管必须对称放置，称重平衡偏差＜0.1g。
⑦不能无转头空转，放取转头需用手柄以防转头滑落。转头要轻放、卡稳，旋下手柄时要用手扶住手柄只转转头。转头盖要盖严。
⑧离心时不能打开机盖，不能扒扶在离心机上，如有异常声音和振动时立即停机。
⑨转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必须清洗干净，擦净转头室内凝水，开盖凉干转头室。
⑩离心机使用后登记。
正确选用离心机和转头
以前生物大分子离心分离多利用甩平转头，转速在60000rpm以下，一次要离心数十小时，使用的CsCl也较多，离心成本昂贵（如质粒DNA分离，CsCl初始密度为1.71g/cm3，33000rpm，20℃甩平转头离心72hr，一次离心就用去了驱动部1.4亿转的的寿命，当时的超速离心机驱动部的保用寿命100亿转。
使用近垂直管转头，在CsCl梯度中加入EB和Triton x-100，初始密度1.55g/cm，378000rpm，20℃离心4hr（用去寿命0.187亿转）或用垂直转头，同样的梯度100000rpm，20℃，2hr（用去寿命0.12亿转）都获得满意结果。
2 层析技术
2.1 层析技术的原理和分类
1906年俄国植物学家M. Tswett将含有植物叶子色素的溶液，通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子后，各种色素被分开。证明植物叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。分开的色素形成不同的色带，因此称为色谱法（Chromatography），又称层析法。
到1931年色谱法才用于分离复杂的有机混合物。
色层分析法已不限于分离有色物质，但色谱法或色层分析法的名称仍被沿用，称为层析法或层析技术。
柱层析很难鉴定微量物质，因此发展了纸层析法（Paper Chromatography，简称PC）。在这种“平面”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。
利用平面层析法的优点发展了薄层层析法（Thin-Layer Chromatography，TLC）。
薄层层析的分离是在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。
通过施加电场可提高纸层析或薄层层析对离子化合物的分离效率，这种改进方法被称为纸上电泳或薄层电泳。
1941年英国生物学家Martin和Synge提出色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸
馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱（Liquid-Liquid partition Chromatography）。
气相色谱仪是1952年Martin和James发展起来的层析法，适用于分离气体混合物或挥发性液体和固体。具有分辩率高、分析迅速和检测灵敏等优点。
上世纪60年代末产生了高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC），适用于快速分离非挥发性或热不稳定样品。
层析法的特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。既可用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。
层析法作为一种分析分离手段与方法，广泛用于科研与工业生产上。如在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域发挥重要作用。
2.1.1 层析技术原理
层析法是利用待分离混合物中各组分物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速度不同而被分离。
所有层析系统都由两个相组成
①固定相是层析的基质。为固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等）或是固定于固体物质上的成分（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。基质可与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。对层析效果起关键作用。
②流动相是层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等。如水和各种溶剂。柱层析中的流动相一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
分配系数是在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值，常用K表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
K=Cm/Cs
Cm是流动相中的浓度，Cs是固定相中的浓度。
分配系数主要与被分离物质的性质、固定相和流动相的性质以及层析柱的温度有关。
迁移率（R f或比移值）：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动距离与流动相移动距离之比（0≤R f≤1）。
各组分R f值相差越大分离效果越好。
K ↑→R f ↑
相对迁移率（Rx）是在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动距离与某一标准物质在固定相中移动距离之比。Rx＜1、＝1、也可＞1。
不同物质的分配系数或迁移率不同。分配系数或迁移率的差异越大，分离效果越理想。
分辨率（Rs，或称分离度）
层析的效果用分辨率Rs表示，分辨率是相邻两个组分（峰）的分开程度。
影响分辨率的因素是多方面的，应根据实际情况综合考虑，对于生物大分子还需考虑其稳定性和活性等。如pH值、温度等都会产生较大的影响。
操作容量：一定条件下，某组分与固定相反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。操作容量越大，基质对该物质的亲合力越强。
由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响，同种基质对不同分子的操作容量不同。操作时应减少上样量。
2.1.2 层析法的分类
①按两相所处的状态分类
流动相有3种状态：液体作为流动相的称液相色谱（liquid chromatography）；气体作为流动相的称为气相色谱（gas chromatography）。当流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时称超临界色谱。
固定相有两种状态：以固体吸附剂作为固定相；以附载在固体上的液体作为固定相。
按固定相不同分为：液－固色谱（liquid-solid chromatography）、液－液色谱（liquid-liquid chromatography）、气－固色谱（gas-solid chromatography）、气－液色谱（gas-liquid chromatography）。
②按层析原理分类
吸附层析（adsorption chromatography ）：以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂间的吸附力不同而达到分离的目的。如用硅胶、羟磷灰石等进行的层析。
分配层析（partition chromatography）：在有两相同时存在的溶剂系统中，由于不同物质的分配系数不同从而被分离。如纸层析。
离子交换层析：(ion-exchange chromatography )以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离。
体积排阻色谱（即凝胶层析，gel chromatography）：以具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据物质的分子大小进行分离。
亲和层析法：根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在基质上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离。
亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
聚焦层析（Chromatofocusing）
聚焦层析分离纯化蛋白质是依据等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程称聚焦效应。
聚焦层析也是一种柱层析。其流动相为多聚缓冲剂，固定相为多聚缓冲交换剂。
pH梯度是由多聚缓冲剂和多聚缓冲交换剂形成的，这是进行聚焦效应的基本条件。
③按固定相附着方式不同分类
柱层析（colum chromatography）、纸层析（paper chrmatography）、薄层层析（thin layper chromatography）和薄膜层析法。
④根据极性分类
反相色谱：流动相极性＞固定相极性，极性大的分子比极性小的分子移动速度快，先从柱中流出。
正相色谱：流动相极性＜固定相极性，非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出。
一般分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱，分离纯化极性小的有机分子多采用反相色谱。
2.1.3 层析法的特点与应用
特点①层析法与光学、电学或电化学仪器联用，可检测出层析后各组份的浓度或质量；可用于定性及定量测定，同时绘出层析图（指纹图谱）。
②与电子计算机联用可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。
③分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快。
应用：层析法适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离、分析和鉴定。
2.2 层析法实验技术
2.2.1 纸层析
纸层析法(paper chromatography) 简单、廉价，适宜于分离小分子物质。如氨基酸、核苷酸、有机酸、糖、维生素和抗菌素等。
纸层析是最简单的液-液相分配层析。滤纸为支持物，滤纸纤维与水有较强的亲和力，约能吸收
20～22%的水，其中部分水与纤维素羟基以氢键形式存在，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力很小，所以滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相。
当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水和有机相间不断进行分配，由于混合物中各组分的分配系数有差异，移动速度不同而彼此分开。
2.2.2 薄层层析
薄层层析(thin-layer chromatography，TLC)是在玻璃板上涂布一层支持剂（吸附剂），将待分离的样品点在薄层板的一端，用流动相展开，将样品分离。
支持剂包括：硅胶、氧化铝、活性炭、硅藻土、纤维素粉、交联葡聚糖凝胶等。
层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。
硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。
硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，则可通过离子交换反应而吸附碱性化合物。
原理：由于选用的支持剂不同，其原理也不相同，如：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等。
薄层层析分类
应用：主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，定性定量。
薄层层析操作方便、设备简单、分辨率比纸层析高10~100倍。但是对生物大分子分离效果不佳。
2.2.3 聚酰胺薄膜层析
原理：聚酰胺与被分离的极性物间形成氢键产生吸附作用，流动相通过聚酰胺膜时由于样品在溶剂和薄膜之间的分配系数不同而使样品分离。
聚酰胺分为：尼龙-66和锦纶-6两类。由于含有大量的酰胺基团，统称聚酰胺。它以其-CO-或-NH-与极性化合物的-OH或=O间形成氢键，发生吸附作用。
特点：分辨力强、灵敏度高、速度快、样品不扩散、操作方便。特别适合对蛋白质的N-端氨基酸残基分析。
2.2.4 凝胶层析法
凝胶层析（gel chromatography）又称分子筛过滤、排阻层析、凝胶过滤等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
①原理
分子筛效应
凝胶为三维网状结构，样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时，各分子在柱内既垂直向下地移动又无定向地扩散运动。
由于大分子物质的直径较大而不易进入凝胶颗粒的微孔，被排阻而分布颗粒之间，只能沿着颗粒间的缝隙流动，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后进入另一凝胶颗粒。
小分子可进入凝胶内部，所走的路程最长而最后流出，大分子不能进入凝胶内部，作走路程最短而先流出。子介于大分子与小分子间的中等大小分子只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
因此样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，而达到分离的目的，称这种现象为分子筛效应。
每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量称为排阻极限。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，被最先洗脱出来。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量。例如Sephadex G-50的排阻极限为30000，即
分子量大于30000的分子不能用此凝胶分离。
②凝胶的种类
凝胶种类很多，都是三维空间的网状高聚物，有一定的孔径和交联度。不溶于水，但在水中有较大的膨胀度，具有良好的分子筛功能。可分离的分子大小的范围广，相对分子质量在102～108范围之间。
常用凝胶主要有：葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）等。
葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是在葡聚糖（右旋糖酐）长链间以3-氯-1,2-环氧丙烷交联剂交联而成。
Sephadex的主要型号为G-10～G-200，G后的数字是凝胶的吸水率（单位：ml/g干胶）×10。如Sephadex G-50，表示吸水率为5ml/g干胶。
G值小，交联度大，吸水性小；G值大，交联度小，吸水性大。
Sephadex亲水性强，遇水或电解质溶液能迅速膨胀。不同型号Sephadex的吸水率不同，孔穴大小和分离范围也不同。型号大的排阻极限大，分离范围大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6×105。
Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液及有机溶液中都较稳定，可多次重复使用。Sephadex含有－OH基团而呈弱酸性，可吸附分离组分中的带电基团。当离子强度＞0.05时可消除吸附作用。用一定浓度的盐溶液为洗脱液，可避免Sephadex对蛋白的吸附。
Sephadex机械稳定性较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，不能实现快速而高效的分离。
G25、G50有四种颗粒型号：粗(100μ~300μ)、中(50μ~150μ)、细(20μ~80μ)和超细(10μ~40μ)。G75～G200又有两种颗粒型号：中(40μ～120μ)，超细(10μ～40μ)。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，可得到不同的交联度。
聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4×105。
聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定，但不如葡聚糖凝胶稳定性高。在酸性条件下，其酰胺键易水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，一般在pH4～9范围内使用。
聚丙烯酰胺凝胶亲水性极强，基本不带电荷，吸附效应较小，不会被微生物侵染。
琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离出来的线性多糖，是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的，它是由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖交替构成的多糖链。
琼脂糖在100℃时呈液态，在45 ℃以下时多糖链以氢键相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。
商品名有Sepharose(瑞典)、Bio-gel A(美国)、Segavac(英国)、Gelarose(丹麦)等种。
商品除Segavac外，都制备成珠状琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶按其浓度不同，分为Sepharose 2B(浓度为2％)、4B(浓度为4％)及6B(浓度为6％)。
琼脂糖凝胶在pH 4～9之间稳定，对样品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶有很好的孔穴稳定性，在高盐浓度下，柱床体积不会发生明显变化，
琼脂糖凝胶是大孔凝胶，排阻极限大，分离范围广，洗脱速度较快。适于分离分子量400,000以上的物质，如核酸和病毒等，但分辨率较低。
Sepharose与2,3-二溴丙醇在强碱条件下反应形成CL型交联琼脂糖（CL-2B CL-4B），可提高热稳定性和化学稳定性，使稳定工作pH范围为3～14（通常的Sepharose只能在pH4.5～9.0范
围内使用）。Sepharose CL型凝胶还适合于含有有机溶剂的分离。
Sepharose不耐高温，层析温度应在0～30℃。琼脂糖凝胶在干燥状态下保存易破裂，做成胶粒后不能再脱水干燥，要在水溶液中保存。
Sepharose在室温下稳定性超过葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。对样品吸附作用小，机械强度和孔穴的稳定性好，流速较快。在高盐浓度下柱床体积无明显变化，可用较快的洗脱速度。
③凝胶层析的应用
凝胶层析具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好。
生物大分子的纯化：凝胶为惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，可保持分离成分的理化性质和生物学活性。对高分子物质分离效果很好。可用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素和生物碱等物质的分离提纯。
脱盐：凝胶层析可除去蛋白质、核酸、多糖等高分子溶液中的低分子量杂质。脱盐操作简便，在脱盐过程中蛋白不易变性。
适用凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％。用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液进行层析柱平衡和洗脱，可防止蛋白脱盐后溶解度降低而形成沉淀吸附于柱上。挥发性盐通过冷冻干燥可除去。
测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，以洗脱体积对分子量的对数作图，可得分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
凝胶过滤测定蛋白分子量的准确性受很多因素影响。若标准蛋白或样品与凝胶有一定的吸附作用，则测量误差较大；测定公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立；同时，注意标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。
凝胶层析测定糖蛋白时，由于糖的水合作用较强，测定分子量偏大；测定铁蛋白时则测定值偏小。
高分子溶液的浓缩：将Sephadex G-25或G-50干胶投入到稀的高分子溶液中，水分和低分子量的物质会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离，可得到浓缩的高分子溶液。浓缩后基本不改变溶液的离子强度和pH值。去热源物质
热源物质是微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。分子量很大，可用凝胶层析的排阻效应将热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。
例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质。
④柱层析的基本装置及基本操作
程序：选择基质（固定相）→研究对象转移到基质上，并以适当的条件（选择流动相），使之在基质上展开→将展开的结果显示或记录。
装置：上样装置、层析柱、监测器、收集器。
凝胶和管柱的选择
凝胶选择
分离分子量较小的物质，一般用葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，大分子则用琼脂糖凝胶。
凝胶颗粒细的分离效果好，但流速慢，应依据实际需要选择。如除去盐类等小分子物质，可选用粗、中粒度凝胶。一般常用的是100～200目。
根据被分离分子的大小选用适宜型号的凝胶。
例如，Sephadex G-50可用于区分MW在1,500~30,000的分子，Sephadex G-75 凝胶可区分MW 在3,000~70,000的分子。若分离MW为10,000及20,000的分子两种都适用。
凝胶层析可分为两类：组别分离(group separations)和分级分离(fractionations)
组别分离：将样品混合物按分子量大小分成两组。一般选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶。
分离样品中分子量差异较大的物质，宜用高交联度的凝胶，如Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10、G-15及Bio-Gel-p-2、4。
分级分离：分离样品中分子量近似的物质。常用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质可不同程度地进入到凝胶内部而被分离。
较细的凝胶颗粒分离效果较好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。因此，细颗粒凝胶宜用大直径的层析柱，粗颗粒凝胶应选用小直径的层析柱。
若样品中各个组分差别较大，则可选用大颗粒的凝胶，分离速度快；若个别组分差异较小，则使用小颗粒凝胶以提高分辨率。
如在较强的酸、碱或有机溶剂中进行，则要根据凝胶的工作参数，选择合适类型的凝胶。
计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（πr2h ml）/ 凝胶的床体积（ml / g）
凝胶用量在计算基础上再增加10％~20％的损耗。
层析柱选择
柱的长度（L）与直径（D）常按经验选择，L/D一般在7～10之间，移动慢的物质应在30～40之间。层析柱直径在1～5cm范围内，＜1cm产生管壁效应，＞5cm稀释现象严重。
组别分离时多用20～30cm长的层析柱。L/D＝5/1~15/1，柱体积要大于4~15倍的样品体积。
分级分离需要100cm左右长的层析柱，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。L/D＝25/1~100/1，且柱体积要大于25~100倍的样品体积。
基质的溶胀
将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀。
葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶要在水中膨化，将干胶颗粒悬浮于5～10倍量的无离子水或洗脱液中充分溶胀，溶胀后将极细的小颗粒倾泻出去。凝胶处理过程不能剧烈搅拌以免颗粒破裂影响流速。
沸水浴中可加速溶胀，1～2h即可充分胀溶，加热可起到消毒作用，同时也可除去胶粒中的气泡。
吸水率较小的凝胶膨化时间短，20℃下3～4h；吸水率大的凝胶膨化时间长，20℃需十几个到几十个小时，Sephadex G-100以上的干胶膨化要72h以上。沸水浴1～5h即可膨化。尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。
琼脂糖凝胶和有些凝胶是水悬浮，不需膨化处理。多孔玻璃珠和多孔硅胶不需膨化处理。
并用适当浓度的洗脱液洗涤，以除去凝胶表面可能吸附的杂质。后用去离子水洗涤干净，并进行脱气（真空泵、超声波或沸水浴），以除去其内部的气泡。
装柱
使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。凝胶床表面加盖滤纸片。
稍放置一段时间，再开始流动平衡。
平衡
柱子装好后要用所需的缓冲液平衡。用恒流泵在恒定压力下走柱子（流速应低于层析时所需的流速。逐渐增加到层析的流速，但不能超过最终流速）。平衡液体积约3~5倍柱床体积，可以使柱床体积稳定及基质的充分平衡。
有时为防止新凝胶柱对样品的吸附，可用一些物质预先过柱。
装柱效果检测
可放入有颜色的蛋白质流过管柱进行检测。例如葡聚糖凝胶柱可用兰色葡聚糖2000（或用细胞色素、血红蛋白等，配制成浓度2g/L的溶液）在恒压下走柱，色带应狭窄、均匀平整，若不均匀或出现气泡，需倒出重新填装。
上样
较少的上样量分离效果较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。
洗脱液流到距柱床表面1～2mm左右时关闭出口，用滴管缓缓将样品溶液加到基质表面，避免
冲击基质，再打开出口，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入几毫升洗脱液冲洗管壁，然后加入约4cm高的洗脱液开始洗脱。
洗脱
一般只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可用来洗脱。为防止凝胶可能有吸附作用洗脱液一般用缓冲液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。
为了不改变凝胶的体积，洗脱液应与膨胀一致。
洗脱方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。
适宜于分离对固定相的亲合力差异不大，区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）较短的物质。但必须选择合适的洗脱剂才能使各组分的分配系数较大。
分步洗脱：按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
主要用于组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离的混合物。
梯度洗脱：用于组分复杂且性质差异较小的混合物脱。连续逐步地增加洗脱能力，例如增加浓度、极性、离子强度或pH值等。
最常用的是浓度梯度（水溶液中，即为离子强度梯度）。
当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式，较小的梯度斜率有利于分离性质相近的组分。
洗脱时流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。一般流速是2～10cm/h。
速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开。速度太慢，将增大物质的扩散，分离效果不理想。
经过查阅文献、试验与调整（可用正交试验或优选法），以得到最佳洗脱条件。在洗脱过程中不能干柱。
一般凝胶的流速是2～10cm/h，凝胶说明书一般会提供建议流速。
收集、鉴定及保存
采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。每管的收集量应在1ml~5ml，如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL/管。在合并一个峰的各管溶液前应进行鉴定。
例如一个蛋白峰的各管溶液，要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯可合并在一起。为保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，冰冻干燥制成干粉，低温下保存。
基质的再生和保存
许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可反复使用，而且价格贵，应回收。
凝胶柱使用多次后，可引起床体积会变小，流动速率降低以及杂质污染等，使分离效果受到影响。此时对凝胶柱需进行再生处理。
再生方法是：用无离子水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。
由于葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶属多糖类，易被微生物浸染，最好采用真空或低温保存，但不能使凝胶冻结。也可加入抑菌剂（0.02% Na2N3或0.002%洗必泰），至少可以保存半年以上。
葡聚糖凝胶柱使用10次后，应进行一次在位清洗，可用1M的NaOH反向（40cm/h）冲洗4个床体积，再用平衡液再生。
若葡聚糖凝胶被微生物浸染，可用1M的NaOH进行处理。
使用过的凝胶若要短时间保存，需除去蛋白质等杂质，加入适量的防腐剂即可；
若要长期保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
凝胶也可用70%→90%→95%的酒精逐步脱水，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。葡聚糖凝胶60~80℃烘干。膨化凝胶不能直接高温烘干，否则会破坏凝胶结构。
2.2.5 离子交换层析法
离子交换层析(Ion Exchange Chromatography, IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。40年代出现具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代离子交换层析应用于氨基酸的分析。
离子交换层析广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
①原理
离子交换剂为不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖和琼脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基团能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。
离子交换剂结构由3部分组成：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
离子交换剂的基质是有高分子聚合成的球形颗粒或多糖类化合物交联而成的球形颗粒。
例如聚苯乙烯离子交换剂（聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。具有较强的疏水性，易引起蛋白变性，常用于分离无机离子、氨基酸、核苷酸等小分子物质。
以纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质。葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G-25和G-50为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL-6B为基质。
电荷基团（离子交换基团）一般由易解离的酸根基团或碱性基团组成。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称阳离子交换剂。如羧甲基（Carboxymethy, CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子，其反离子为阳离子，可与带正电荷的阳离子进行交换。
平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl, DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素，它的反离子为阴离子，可与带负电荷的阴离子进行交换。
离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，为可逆过程。结合的强度与离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等有关。
离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。
离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般离子价态高的结合力大；如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：Na+ 同价阳离子在酸性阳离子交换树脂上选择系数随其水合离子半径的增大而变小。如一价阳离子的水合半径顺序是：Li+＞Na+＞K+＞Rb+＞Cs+；它们的结合力是：Cs+＞Rb+＞K+＞Na+＞Li+；同理，二价阳离子的结合力是：Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Mg2+。 蛋白质等生物大分子为两性电解质，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有关。 例如用阳离子交换剂分离蛋白质时，在一定pH条件下，等电点pI 由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，需实验摸索。 虽然交换反应是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行。因此可把离子交换剂上的原离子全部洗脱下来。 洗脱剂有酸、碱和盐溶液等。改变整个系统的酸碱度和离子强度，可以使结合在离子交换柱上组分的交换性能发生变化，当洗脱液中的离子强度大于结合在离子交换柱上的组分或柱内的酸碱度发生改变直至越过其等电点（流出液从酸性变成碱性或从碱性变成酸性）时，该组分就会逐步被洗脱下来。 如果有两种以上的成分被交换附着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，洗脱能力取决于各自洗脱反应的平衡常数。 交换容量 交换容量是离子交换剂能提供交换离子的量。可反映离子交换剂的交换能力。 一般离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。 但是，样品中各个组分与交换剂实际进行交换时的交换容量，不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有关，一般称为有效交换容量。 交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等会影响交换容量。它们影响交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。一般离子交换剂的孔隙应不影响样品组分的进入。 分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。 对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。 离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质而影响交换容量。 pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大。如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。 pH也影响样品组分的带电性。蛋白质等两性物质在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般离子强度增大，交换容量下降。 实验中增大离子强度进行洗脱，可降低交换容量将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。离子交换剂的总交换容量通常以每mg或每mL交换剂含有可解离基团的毫克当量数(meq/mg 或meq/mL)表示，可用滴定法测定。 阳离子交换剂用HCl处理使其平衡离子为H+。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H+，再用标准浓度的NaOH滴定，可计算出离子交换剂的交换容量。 对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将H+充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。 阴离子交换剂的交换容量也可用类似的方法测定。 一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每mg或每mL交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，可作为分离蛋白质等生物大分子的参考。 ②离子交换剂的种类 阴离子交换剂根据电荷基团的解离度不同分为强碱型、中等碱型和弱碱型离子交换剂。 结合季胺基团（-N(CH3)3）的为强碱型，如三乙基胺乙基纤维素（TEAE）。 结合叔胺（-N(CH3)2）、仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）等为弱碱型。例如，二乙基胺乙基纤维素（DEAE）。 同时具有强碱和弱碱型基团的为中强碱型。 常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为： PO43-＞SO42-＞I-＞NO3-＞CN-＞NO2-＞Cl-＞HCO3-＞OH- 阳离子交换剂根据电荷基团的解离度不同分为强酸型、中等酸型和弱酸型离子交换剂。 强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。 弱酸性阳离子交换树脂的基团(如-COOH)较难电离，且其解离受溶液中H+的抑制，所以H+的交换能力很强，甚至大于2价、3价阳离子。 常温下稀溶液中阳离子对强酸性阳离子交换树脂的交换顺序是: Fe3+＞Al3+＞Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+≥Cu2+≥Mn2+≥Zn2+≥Mg2+＞K+≥NH4+＞Na+＞H+ 结合磺酸基团（-SO3H）的为强酸型。如磺酸甲基纤维素（SMC）。 结合磷酸基团（-PO3H2）和亚磷酸基团（-PO2H）为中等酸型。例如磷酸基纤维素（PC）。 结合酚羟基（-OH ）或羧基（-COOH）的为弱酸型。如羧甲基纤维素（CMC）。 一般强酸型离子交换剂对Na+结合力比H+大，弱酸型离子交换剂对H+的结合力比Na+大。 强碱型离子交换剂对Cl-的结合力比OH-大，弱碱型离子交换剂对OH-的结合力比Cl-大。 ③特点 具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件就可洗脱，不引起蛋白质变性或酶失活。具有开放性支持骨架，多孔性、表面积大、大分子可以自由进入和迅速扩散，吸附容量大。回收率高，可用于分离和制备。 ④应用 用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽、蛋白质、核苷酸、核苷和各种碱基等的分离。 制备无离子水：离子交换层析可除水中的杂质和各种离子，可大量、快速制备高纯水。例如，聚苯乙烯树脂可用于高纯水的制备、硬水软化及污水处理等。 水通过H+型强阳离子交换剂，除去各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH-型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，可得到纯水。离子交换剂使用一段时间后可通过再生处理重复使用。 分离纯化：离子交换层析可应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素和蛋白质等物质的分离纯化。 例如在氨基酸的分析中，用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2~3上柱，使氨基酸全部结合在树脂上，通过逐步提高洗脱液的离子强度和pH值，各种氨基酸将被逐步洗脱下来，可进行氨基酸的分离鉴定。 在蛋白质的分离纯化中，吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使其失去电荷而解离，也可通过增加离子强度来与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。 不同蛋白质与离子交换剂间亲和力不同，选择适当的洗脱条件可达到初步分离纯化的目的。 ⑤实验方法 剂型的选择 选择离子交换剂电荷基团确定选择阳离子交换剂或阴离子交换剂。例如待分离的蛋白pI=4，稳定的pH范围为6~9，由于这时蛋白带负电，应选择阴离子交换剂。强酸或强碱型离子交换剂适用pH范围广，用于分离小分子物质或在极端pH下的分离。一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。 选择离子交换剂基质。聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂用于分离无机离子、氨基酸、核苷酸等小分子物质。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂适合于分离蛋白质等大分子物质。 纤维素离子交换剂具有开放性长链和松散的网状结构，表面积大，大分子通透性好，实际交换容量大；具有强的亲水性，对蛋白质等生物大分子吸附力较小，洗脱条件温和而不会引起生物大分子的变性和失活；价格低。但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。 其中DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素) 常用于蛋白质和核酸的分离。 葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化而改变，影响分辨率。 琼脂糖离子交换剂机械稳定性好，分辨率较高，但价格较贵。 离子交换剂颗粒大小选择。颗粒小分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢。大颗粒适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，小颗粒适于高分辨率的分析或分离。 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 DEAE-纤维素操作方法 膨胀活化 目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。取所需的DEAE-纤维素量，撒于0.5 mol/L NaOH溶液中（1g DEAE-纤维素干粉约需15倍的NaOH溶液），浸泡1h左右，不时搅拌。 反复用蒸馏水抽滤洗涤直至滤液近中性，再将纤维素浸泡于0.5 mol/L HCl中1h，同样抽滤洗涤至近中性。再将纤维素浸于0.5 mol/L NaOH液中，同样处理洗至中性。 离子交换剂膨胀活化：15倍量的0.5 mol/l NaOH浸泡30~120 min→水洗至pH 7.0→0.5 N HCl 浸泡30~120 min→水洗至pH 7.0→缓冲液浸泡。 一般阳离子交换剂最后用NaOH（可加入NaCl）处理，阴离子交换剂最后用HCl处理。处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。 酸碱浓度一般＜0.5 moL/L，浸泡时间一般30 min，温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。 离子交换剂使用前要排除气泡以免影响分离效果。 分离蛋白质时一般不用H或OH型离子交换剂，以免分离过程中H+或OH-被置换出改变层析柱的pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。 平衡 将DEAE-纤维素放入0.0l mol/L pH 7.4平衡缓冲液中1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复至倾出液体的pH值与加入平衡缓冲液的pH值相近时为止。 平衡缓冲液是装柱及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH应保证各待分离物质的稳定。使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，尽量使待分离样品与离子交换剂较稳定结合，杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。 也可选择使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而分离对象与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。 装柱 选择适当大小层析柱，离子交换柱子一般较粗短。柱长和柱直径比一般为10︰1～20︰1，用前将层析柱在清洗液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 层析柱垂直固定，关闭层析柱出水口。倒入起始缓冲液至一半柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE-纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。 如有气泡应排除或重装。打开出水开关使流速1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，用玻璃棒搅拌表面层以免两次加入的纤维素形成分界层，加至需要高度（一般不要装太高）。 继续用平衡缓冲液平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值相同为止。 柱上端轻轻放入一圆形滤纸保护纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应平整、无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。 上样 样品必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜。用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，留一薄层液面。上样时应注意样品液的离子强度和pH 值，上样量一般为柱床体积的1~5％，沿管壁缓缓加入样品，不要打乱纤维素表层。 拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE-纤维素有最适比的关系，超过这个比值就影响分离纯度。 洗脱 离子交换层析一般用改变离子强度或改变pH的梯度洗脱。 在改变离子强度的洗脱过程中，逐步增大离子强度；改变pH的洗脱过程中，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。 由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，通常采用改变离子强度的梯度洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，一般线性梯度洗脱分离效果较好。 选择合适的洗脱速度，如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，适当缩小洗脱液梯度范围或降低洗脱速度可提高分辨率；如果分辨率较好，洗脱峰过宽则可适当提高洗脱速度。 洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试（与蛋白质形成盐而沉淀），当蛋白液流出时，开始分管收集，至无蛋白为止。 洗脱出的样品盐浓度高、体积大、样品浓度低，需浓缩、脱盐处理。 交换柱的再生和保存 离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。 离子交换剂再生和转型的目的是使离子交换剂带上所需的平衡离子。如对阴离子交换剂用HCl 处理可将其转为Cl型，用NaOH处理可转为OH型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等。 离子交换层析是通过交换剂上的平衡离子与样品组分离子进行可逆的交换而实现分离的。因此，如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，可使交换容量降低。 同时还要保证平衡离子不对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H+或OH-。 离子交换剂保存时应洗净蛋白等杂质。例如，用过的DEAE-纤维素用2mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。 保存时一般加入0.02 %的叠氮钠防腐，4℃下储存。使用时再以碱和酸溶液处理。 2.2.6 亲和层析法 亲和层析（Affinity Chromatography）利用待分离物质和它的特异配体间具有特异的亲和力而分离的技术。 具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。 ?原理 可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。?特点 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但它必须针对某一分离对象，制备专一的配体和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。亲和层析的关键是要保留分离对象的生物活性。 亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配体。它们构成亲和层析的固定相，称亲和吸附剂。 配体作为连接载体和被分离分子的桥梁，它有两个基团，一个与基质结合，一个与被分离分子结合。 有亲和分子的物质原则上都可作为配体使用，如：酶底物的类似物或竞争性抑制剂、效应物、辅助因子都可作为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等。 ?亲和层析吸附剂 吸附剂包括基质和配体 亲和色谱载体一般应具有亲水而不溶于水；疏松网状结构，容许大分子自由通过；有一定硬度的均一珠状；具有大量可供反应的化学基团，可与大量配体共价连接；非特异性吸附弱；能抗微生物和酶的侵蚀；化学稳定性强。 常用基质有琼脂糖凝胶、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶等。 通过对基质进行化学处理，使其表面的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体应具有较好的稳定性，能够耐受偶联及洗脱时可能较剧烈的条件，可多次重复使用；配体与待分离的物质应有适当的亲和力、特异性强；配体能与基质稳定地共价结合，结合后结构无明显变化、不影响与待分离物质的结合、不易脱落。 根据配体对待分离物质的亲和性不同分为：特异配体和通用配体。 特异配体（specific ligand）：只与单一或很少种类蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素与亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素-受体等，结合特异性很高。 但寻找特异配体比较困难，对一些性质不很了解的生物大分子，需要大量实验才能找到合适的特异配体。使用通用配体可解决此问题。 通用配体（general ligand）是能与某一类蛋白质等生物大分子结合的配体，特异性较低。如各种凝集素可结合各种糖蛋白，核酸可结合RNA、结合RNA的蛋白质等。 通用性配体的专一性虽然不强，但可选择合适的洗脱条件而得到很高的分辨率。 通用性配体结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易洗脱、价格便宜等。 配体与基质的偶联 活化基质进一步处理还可得到更多种类活性基团。这些基团可在较温和条件下与含氨基、羧基、醛基、酮基、羟基、巯基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。 ⑤亲和吸附剂的再生和保存 用过的亲和层析柱用洗脱液或较高浓度盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可。但分离样品组分比较复杂时，亲和吸附剂可能会产生不可逆吸附。需用较强烈的手段处理，例如高浓度盐溶液、尿素等变性剂或适当的非专一蛋白酶。如果配体是蛋白质等易变性物质，处理时不能改变配体活性。 亲和吸附剂加入0.01%的叠氮钠4 C下保存。不能冰冻。 ?亲和层析的基本操作 亲和层析的操作与一般柱层析类似。亲和层析柱长一般10cm左右。 ①上样 上样时应注意选择适当的流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。 一般生物大分子和配体间平衡速度慢，所以样品浓度不易过高，上样时流速应较慢或停止流动，或将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量， 样品缓冲液的选择应使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。缓冲液适当的离子强度可减小基质、配体与样品其它组分间的非特异吸附。 亲和力随温度增高而降低，可在4℃进行亲和吸附，25℃以上进行洗脱。 上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。根据分离物质与配体结合的强弱选择适当的平衡液流速，结合力强的流速可快些，如果有较强的非特异吸附可用较高离子强度的平衡缓冲液。 ②洗脱 A. 特异性洗脱是利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。 选择与配体有亲和力的物质进行洗脱：选择与配体有亲和力的物质加入洗脱液，若这种物质与配体亲和力强或浓度较大，与配体结合的待分离物质被取代而洗脱出来。 例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时可用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可将糖蛋白从凝集素上置换下来。 选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱：选择与待分离物质有亲和力的物质加入洗脱液，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，由于这种物质对配体的竞争结合，可以使待分离物质脱离配体而被洗脱下来。 例如，用还原型GSH洗脱谷胱甘肽巯基转移酶。 用染料为配体分离脱氢酶时，可选择NAD+洗脱，NAD+为脱氢酶辅酶，与酶的亲和力强于染料，脱氢酶会与NAD+结合而从配体上脱离。 B. 非特异性洗脱通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。 当待分离物质与配体亲和力较小时，通过连续大体积平衡缓冲液冲洗可在杂质后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积较大，得 到的待分离物质浓度较低。 当待分离物质和配体结合较强时，可选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力。 选择梯度洗脱方式可将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度快速洗脱，洗脱体积较小。洗脱后应中和酸碱，透析去除离子保证待分离物质的活性。 例如用0.1M醋酸或0.1M 氢氧化钠冲洗，就能得到不错的效果。 对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使待分离物质变性而从配体上解离出来。再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。 ?应用 分离纯化生物大分子、稀溶液的浓缩等。 ①抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力进行分离的方法又称免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，可从血清中分离对应的抗体。 在蛋白质工程菌发酵液中，所需蛋白质的浓度通常较低。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，可对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。 抗原、抗体间亲和力较强，洗脱时需较强烈的洗脱条件。可改变抗原、抗体种类或使用类似物等降低亲和力以便于洗脱。 金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）能与免疫球蛋白G（Ig G）结合，可用于分离各种Ig G。②生物素（biotion）和亲和素（avidin） 生物素和亲和素亲和力很强且特异性高，可用于亲和层析分离。如用亲和素分离含有生物素的蛋白。由于亲和力很强，洗脱通常需要强的变性条件，可选择biotion的类似物，如：2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力，在较温和条件下洗脱。 利用生物素与亲和素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。 很多种生物大分子可以用生物素标记试剂作用结合上生物素，并且不改变其生物活性。 ③维生素、激素和结合蛋白 结合蛋白含量很低，如1L人血浆中只含有20mg的Vit B12结合蛋白。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强，所以洗脱时可能需要较强烈的条件，可以加入适量的配体进行特异性洗脱。 ④激素和受体蛋白 激素受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力进行亲和层析分离受体蛋白的。 已经用亲和层析纯化出乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、正甲状腺素和胰岛素等受体蛋白。 ⑤凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，可用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整细胞。 用凝集素为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。如伴刀豆球蛋白A能结合含α-D-吡喃甘露糖苷或α-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麦胚凝集素可与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸特异结合，用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。 洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白A 吸附的蛋白可用α-D-甲基甘露糖苷或α-D-甲基葡萄糖苷洗脱。 高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。 他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问 生物化学科目研究生考试大纲 一、考试性质 通过该门课程的考试以真实反映考生对生物化学基本概念和基本理论的掌握程度以及综合运用所学的知识分析相关问题和解决问题的能力与水平，可以作为选拨硕士研究生的重要依据。-中国在职研究生招生网官网 二、考试要求 生物化学考试旨在考查考生对生物化学基本知识、基本理论的掌握程度，并在考察考生基础理论知识掌握的基础上，注重考查考生运用生物化学基础知识分析问题、解决问题的能力。 三、考试形式与试卷结构 （一）考试方式：闭卷，笔试 （二）考试时间：180分钟 （三）题型及分值 试卷类型一般包括名词解释、判断题、简答题、计算及分析性问答题等，试卷满分150分。 四、考试内容 考试内容将涉及生物化学的如下内容：（1）生物分子的结构、组成、性质和功能；（2）生物分子特别是生物大分子的分离与分析方法；（3）生物体内的能量转化、利用和调节；（4）生物大分子的分解与合成代谢；（5）生物信息分子的复制、转录、表达和调节等基本理论。并考查学生运用上述知识的综合和分析能力。各部分的基本内容如下： 糖生物化学 单糖 单糖的结构、性质、构象与构型、变旋 寡糖 多糖 脂类生物化学 甘油三酯 结构与性质，甘油三脂的皂化值（价）、酸值（价）、碘值（价）、乙酰化值（价） 磷脂 分类、性质与功能 结合酯 固醇类化合物 蛋白质化学 蛋白质的重要功能及元素组成 蛋白质的重要功能； 蛋白质的元素组成 氨基酸 氨基酸的结构特点及分类； 必需氨基酸； 蛋白质的稀有氨基酸 非蛋白质氨基酸； 氨基酸的性质 肽 肽键及肽链； 肽的命名及结构； 天然存在的活性寡肽 蛋白质的分子结构 蛋白质的一级结构； 蛋白质的二级结构 超二级结构及结构域 蛋白质的三级结构 蛋白质的四级结构 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质一级结构与功能的关系 蛋白质的空间结构与功能的关系 蛋白质的重要性质 蛋白质的两性性质和等电点； 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质的变性与复性； 蛋白质的颜色反应 蛋白质的分类 蛋白质的分离提纯及分子量测定 蛋白质分离纯化 蛋白质分子质量的测定 核酸化学 核酸的种类与分布 核酸的化学组成 脱氧核糖核酸 DNA的碱基组成； DNA的一级结构； DNA的空间结构； DNA的三级结构 核糖核酸 RNA的结构 核酸的理化性质 一般物理性质； 核酸的紫外吸收； 核酸的沉降特性； 核酸的两性解离及凝胶电泳； 核酸的变性与复性 酶学 酶学概论 酶的概念；-中国在职研究生招生网官网酶的催化特点； 酶的组成； 酶的底物专一性 酶的命名与分类 影响酶促反应速度的因素 摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域 新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学 Abstract：Proteomics which is the new discipline in the time of the post-genomics develops rapidly in the life science．The present paper has documented the current situation and new development of the techniques of separation and identification in this area，including 2·dimensional gel- electro·phoresis，chromatography an d mass spectrometry． Key words：Proteomics；2-Dimensional gel electrophoresis；Chromatography；Mass spectrometry；Bioinformatics 1、概念及相关内容 随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究,并产生了一门新的学科———蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Wil2liams[ 1 ] 最早提出的,是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同,它着重于全面性和整体性,研究的对象不是单一或少数的蛋白质,而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究,包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者———蛋白质水平。蛋白 2010年高级生化考试题 蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质组：一个细胞或组织或机体所包含的所有蛋白质，现定义为基因组表达的全部蛋白质。具有三种含义：一个基因组、一种生物、一种细胞所表达的全部蛋白质。 疏水作用层析：就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。 DNA的三级结构：DNA分子通过扭曲和折叠形成的特定构象。核酸的三级结构反映了对整体三维形状有影响的相互作用，包括不同二级结构元件间的相互作用，单链与二级结构间的相互作用以及核酸的拓扑特征。 DNA的四级结构： 共价催化：在酶催化反应过程中，酶与底物以共价键结合成中间物过滤态以加速反应。即在催化时，亲核催化剂或亲电催化剂能分别放出点子或汲取电子，并作用于底物的缺电子反应中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价键中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。 Ks型不可逆抑制剂：这类抑制剂主要作用于酶活性部位的必须基团，但也作用于酶非活性部位，取决于抑制剂与酶活性部位必须基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及与非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks的比值，故称为Ks型不可逆抑制剂。 Kcat型不可逆抑制剂：这类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且本身也是酶的底物，可被酶催化而发生类似底物的变化。但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团，这种基团可因酶的催化而暴露或活化，作用于酶活性中心或辅基，使酶共价共价修饰而失活。 Ks分段盐析法：在一定的pH值和温度条件下，改变盐的离子强度I值，使不同的溶质在不同的离子强度下有最大的析出，此种方法称为Ks分段盐析法。 β分段盐析：保持溶液的离子强度不变，改变溶液的pH值和温度，使不同的溶质在不同的PH值和温度条件下台最大的析出，此种方法称为β分段盐析法。 cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 穿梭载体(shuttle vector)：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析. 后生遗传：指通过遗传而产生的基因表达修饰，且不能被逆转，此类遗传改变主要指染色体结构的改变和DNA甲基化状态的改变。 对角线电泳：用于分析混合物中某一组分对某些化学处理或光处理后变化的双向电泳技术。样品加样后先从一个方向进行电泳分离，经化学或光处理后，再以与第一次电泳垂直方向进行第二次电泳分离，则经过处理未被修饰的组分皆位于电泳图谱的对角线上。 化学酶工程：也称初级酶工程是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。 生物酶工程：是用生物学方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶；它是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。 酶提取的回收率：每次提纯后酶制剂总活力与提取液的总活力的百分比。 1,miRNA和siRNA，及其功能（网上搜索所得） SiRNA的主要特征：长约21到23nt ；双链的3’端各有2个或3个突出的核苷酸；5’端磷酸化，3’端为自由的-OH基团。siRNA可作为一种特殊引物，在RNA指导的RNA聚合酶作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA，新生成的siRNA又可进入上述循环。这种过程称为随机降解性多聚酶链反应。MicroRNA (miRNA)：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（~21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。 miRNA的特点：广泛存在于真核生物中, 是一组不编码蛋白质的短序列RNA , 它本身不具有开放阅读框架(ORF) ;通常的长度为20～24 nt , 但在3′端可以有1～2 个碱基的长度变化;成熟的miRNA 5′端有一磷酸基团, 3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来；多数miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异 中国科学院大学硕士研究生入学考试 《生物化学》考试大纲 一、考试基本要求及适用范围概述 本《生物化学》考试大纲适用于中国科学院大学生命科学相关专业的硕士研究生入学考试。生物化学是生物学的重要组成部分，是动物学、植物学、遗传学、生理学、医学、农学、药学及食品等学科的基础理论课程，主要内容：探讨生物体的物质组成以及分子结构、性质与功能，物质代谢的规律、能量转化及其调节控制等。要求考生系统地理解和掌握生物化学的基本概念和基本理论，掌握各类生化物质的结构、性质和功能及其合成代谢和分解代谢的基本途径及调控方法，理解基因表达调控和基因工程的基本理论，了解生物化学的最新进展，能综合运用所学的知识分析问题和解决问题。 二、考试形式 硕士研究生入学生物化学考试为闭卷，笔试，考试时间为180分钟，本试卷满分为150分。 试卷结构（题型）：名词解释、单项选择题、判断题、简答题、问答题 三、考试内容 1.蛋白质化学 考试内容 ●蛋白质的化学组成，20种氨基酸的简写符号 ●氨基酸的理化性质及化学反应 ●蛋白质分子的结构（一级、二级、高级结构的概念及形式） ●蛋白质一级结构测定 ●蛋白质的理化性质及分离纯化和纯度鉴定的方法 ●蛋白质的变性作用 ●蛋白质结构与功能的关系 考试要求 ●了解氨基酸、肽的分类 ●掌握氨基酸与蛋白质的物理性质和化学性质 ●了解蛋白质一级结构的测定方法（建议了解即可） ●理解氨基酸的通式与结构 ●理解蛋白质二级和三级结构的类型及特点，四级结构的概念及亚基 ●掌握肽键的特点 ●掌握蛋白质的变性作用 ●掌握蛋白质结构与功能的关系 2.核酸化学 考试内容 ●核酸的基本化学组成及分类 ●核苷酸的结构 ●DNA和RNA一级结构、二级结构和DNA的三级结构 ●RNA的分类及各类RNA的生物学功能 ●核酸的主要理化特性 ●核酸的研究方法 考试要求 ●了解核苷酸组成、结构、结构单位及核苷酸的性质 ●了解核酸的组成、结构、结构单位及核酸的性质 ●掌握DNA的二级结构模型和核酸杂交技术 ●了解microRNA的序列和结构特点 3.糖类结构与功能 考试内容 ●糖的主要分类及其各自的代表 ●糖聚合物及它们的生物学功能 ●糖链和糖蛋白的生物活性 考试要求 ●掌握糖的概念及其分类 ●了解糖类的元素组成、化学本质及生物学作用 ●了解旋光异构 ●掌握单糖、二糖、寡糖和多糖的结构和性质 ●理解糖的鉴定原理 食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时 二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖 PartI生化名解 1.肽单元(peptideunit):参与肽键的6个原子Ca1、C、O、N、H、Ca2位于同一平面,Ca1和Ca2在平面上所处的位置为反式构型，此同一平面上的6个原子构成了肽单元，它是蛋白质分子构象的结构单元。Ca是两个肽平面的连接点，两个肽平面可经Ca的单键进行旋转，N—Ca、Ca—C是单键，可自由旋转。 2.结构域(domain):分子量大的蛋白质三级结构常可分割成1个和数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，具有独立的生物学功能，大多数结构域含有序列上连续的100—200个氨基酸残基，若用限制性蛋白酶水解，含多个结构域的蛋白质常分成数个结构域，但各结构域的构象基本不变。 3.模体(motif):在许多蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能，如锌指结构。 4.蛋白质变性(denaturation):在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。主要发生二硫键与非共价键的破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变，变性的蛋白质易沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 5.蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI):当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 6.酶(enzyme):酶是一类对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质或核酸，通过降低反应的活化能催化反应进行。酶的不同形式有单体酶，寡聚酶，多酶体系和多功能酶，酶的分子组成可分为单纯酶和结合酶。酶不改变反应的平衡，只是通过降低活化能加快反应的速度。(不考) 生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 中国农业大学硕士研究生生物化学试（真）题(1997-2007) ——节选自《<文都考研>远程资料库》 1997年中国农业大学生物化学 一、名词解释（每题3分，共30分） 1 操纵子 2 反馈抑制 3 密码子的简并性 4 蛋白质四级结构 5 盐析 6 碱性氨基酸 7 Z-DNA 8 ATP 9 核苷磷酸化酶 10 磷酸果糖激酶 二、填空（每空1分，共28分） 1 DNA损伤后的修复主要有共修复、______________和 _________________三种方式。 2 DNA，RNA和肽链的合成方向分别是______________、 _________________和______________。 3真核生物mRNA前体的加工主要包括_______________________、 ___________________、 ___________________和 ___________________________。 4 在含有完整的线粒体系统中，加入解偶联剂后，能进行 _____________，但不能发生 ____________________作用。 5 果糖1，6-二磷酸可在____________________的作用下，裂解生成2分子三碳糖。 6 ____________________氧化脱羧，形成______________________，这一过程是连接糖酵 解和三羧酸循环的纽带。 7氨基酸降解的反应主要有三种方式，即 ________________________,___________________ 和_______________反应。 8 高等绿色植物体内，在___________________酶和 ___________________酶的共同作用下 ，可以将氨和α-酮戊二酸合成为谷氨酸。 9 蛋白质的平均含氮量为______________，它是___________法测定蛋 高级生化复习题 1.酶的催化混杂性(Enzyme promiscuity）：是指酶具有能催化除其天然反应外的其它反应的能力,也就是说在单个位点催化不止一类化学反应的能力混乱性。 2.活性中心的催化三联体：催化三联体通常指在水解酶和转移酶的活性位点中心同时作用的三个氨基酸残基（如蛋白酶、酰胺酶、酯酶、酰基转移酶、脂肪酶和β-内酰胺酶）。用于共价催化的亲核残基一般是酸-碱-亲核三联体。 3.聚合酶链式反应：简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 4.比较基因组学（Comparative Genomics）：在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因的结构进行比较，了解基因的功能，表达调控机制和物种进化过程的学科。 5.酶的转化数（Kcat）：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。 6.Toll样受体（Toll-like receptors）：是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。 7.鸟枪测序法（whole genome shotgun）：一种分析大片段基因组DNA序列的策略，主要是指将大片段DNA随机切成许多1～1.5kb的小片段，分别对其测序，然后借助序列重叠区域拼接成全段序列。 8.蛋白质芯片：一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。 9.Annexin V：是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。 10.遗传图谱（genetic map）：遗传图谱又称连锁图谱，通过计算机连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们之间的距离，即以具有遗传多肽性的遗传标记为“坐标”，遗传学距离作为“图巨”的基因组图，一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）来表示. 11.亲和层析：是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而能对与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术，亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高的分辨率。 12.基因物理图谱（genome physical）：通过测定遗传标志的排列顺序与位置而 第一章蛋白质的结构与功能 1. 氨基酸的两性解离与等电点 （1）氨基酸的两性解离 氨基酸同时含有氨基和羧基，是两性电解质，在水溶液以兼性离子或偶极离子的形式存在。氨基酸的兼性离子在酸性溶液中可接受质子形成阳离子，在碱性溶液中则释放质子形成阴离子。 （2）氨基酸的等电点 调节溶液的pH值，到某一点时羧基所带的负电荷与氨基所带的正电荷相同，氨基酸表现为整体不带电，这点的pH值就是氨基酸的等电点。 2. 蛋白质的结构层次 蛋白质是具有特定构象的大分子，为研究方便，将蛋白质结构分为几个结构水平，包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构以及超二级结构结合域。 一级结构：氨基酸排列顺序，其维持键为肽键及二硫键。 二级结构：指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式。二级结构主要有ɑ-螺旋、β-折叠、β-转角。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。 三级结构：蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕、折叠形成的，三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和静电作用维持。 四级结构：在体内许多蛋白质含有两条或两条以上的多肽链，才能全面执行功能。每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为亚基，这种蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。其结合键为疏水键、离子键，氢键和范德华力。 超二级结构和结构域是介于二、三级结构之间的两个结构层次：超二级结构是有规则的二级结构聚合体，如 集合体等，而结构域是较大蛋白质中空间上可明显区分的相对独立的区域性结构。 3. 稳定蛋白质空间结构的作用力 维持蛋白质一级结构的化学键有肽键和二硫键；维持二级结构靠氢键；维持三级结构和四级结构靠次级键，其中包括疏水建、氢键、盐碱和二硫键。 （1）范德华力：非特异性相互作用，存在于所有分子及分子之间，在两个结构互补的大分子间大量存在，介导酶与底物，抗原抗体结合力很弱。 （2）氢键：呈直线排列，是维持蛋白质构象的重要作用力。 （3）离子键：数量较少，主要在R侧链间起作用。 （4）疏水作用：是球状蛋白形成稳定构象的主要作用力。 （5）二硫键：分子量较大的蛋白多借二硫键稳固其结构。 4. 二级结构的种类和特征 天然蛋白质的二级结构主要有三种类型：ɑ-螺旋、β-折叠、β-转角 （一）ɑ-螺旋的结构特点： （1）蛋白质多肽链主链像螺旋状盘曲，每隔3.6个氨基酸残基沿中心轴螺旋上升一圈，每上升一圈相当于向上平移0.54nm，即每个氨基酸残基向上升高0.15nm，每个氨基酸残基沿中心轴旋转100o 。 （生物科技行业）重庆医科大学研究生考试历年生物 化学真题 98年生物化学 一：是非题 1真核生物成熟的mRNA的3端有多聚A尾巴。 2胆固醇是胆之酸合成的前体 3在体内能转化成Depa的氨基酸是色氨酸 4硫氨素焦磷酸是丙酮酸氧化脱羧酶的辅酶。 52，3－DPG可降低血红蛋白与氧气的亲和力 6蛋白质在电场中流动的方向主要取决于其分子量。 7一个tRNA的反密码字为5-IGC-3，能与之互补的密码子是5-ACG-3。 8磷脂酶C催化甘油磷脂中磷酸脂键的水解，磷脂酶A催化甘油磷脂中脂键的水解。9磷酸肌酸与ATP都是高能磷酸化合物。 10DNA是生物的遗传物资而RNA则不能作为遗传物资。 11乙酸辅酶A羧化成丙二酸COA是脂肪酸合成的第一步反应。 12丙氨狻-葡萄糖循环是非必须氨基酸合成的途径。 13一碳单位主要来源于甘，丝，组，色氨酸的代谢。 14三羧酸循环一次，消耗的直接底物是丙酮算。 15脂肪动员的关键酶是脂蛋白脂酶。 16转氨基酸的辅酶是维生素B6的衍生物。 17前列腺素再化学分类上是属于氨基酸衍生物。 18甲羟戊酸是合成胆固醇及酮体的重要中间物。 19HMG-COA还原酶是胆固醇合成的限速酶。 20PRPP参与嘧啶核甘狻的从头合成。 二：写出下列物资的结构特征与生理功能 1LDL2tRNA3核小体4血红蛋白5信号肽 三：何谓b氧化，写出其进行的部位及主要反应。b氧化在能量代谢上有何重要作用。四：写出参与大肠杆菌DNA复制有关的酶与蛋白因子的名称及其作用。DNA两条链的复制有何不同。 五：写出胆固醇在动物体内可转化为那些有生物活性的化合物（五种以上） 六：试举例说明蛋白质的磷酸化（由蛋白质磷酸激酶催化）与磷酸蛋白质的脱磷酸化这两个反应在代谢上的普遍意义和重要作用。 94年试题 一：解释 1DNA2UDPG3Camp4一碳单位5基因表达6溶解常数Tm7核小体8酮体9限制性核酸内切酶10细胞色素P450 二写出下列酶所催化的反应 1GPT2CPK3磷酸化酶4精氨酸酶5黄嘌呤氧化酶 三：指出下列物资的前身或有何物转变而来 1前列腺素2肌酐3胆汁酸4胆红素5b-氨基异丁酸 四：苯丙氨酸，酪氨酸在体内能转化为哪些有重要生理活性的化合物，试说出他们的名称。五RNA可分为哪几类？试说出他们在蛋白质合成中的作用。 六：试分别举例由下列B族维生素组成的辅酶的名称及其参与的作用。 1泛酸2尼克酰胺3VB24VB6 七：血浆蛋白醋酸纤维薄膜电泳在PH8.6的缓冲液中进行时，试问血浆蛋白可分为拿几个部分？它们都往哪一极移动？解释其原理 八：何谓氧化磷酸化？说明其在能量代谢上的重要性。 生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等 生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法 生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存 生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。 1 离心技术 1.1 基本原理 离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。 应用：各种生物样品的分离和制备。如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。 生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。 相对离心力 离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。 1.2 离心分类 根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation） 1.2.1 差速离心法 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。 差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 关键是选择适合于各分离物的离心力。例如差速离心分离细胞组分 1.2.2 速率区带离心法 速率区带离心法是在离心前于离心管内先预装密度梯度介质（如蔗糖、甘油、CsCl等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的顶部进行离心。 离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大； 但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。 根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制。 如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有有足够的时间使在介质中分离形成区带。 由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。 常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例如，Percoll）及蔗糖。 离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列界面清楚的不连续区带。 沉降系数越大，沉降越快。离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时 生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法: 可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球 考研生物化学-15 (总分：100.00，做题时间：90分钟) 一、选择题(总题数：26，分数：40.00) 1.维生素A的结构是一种______。 （分数：1.00） A..醇√ B..酚 C..醛 D..酮 解析： 2.人和豚鼠不能合成维生素C，因为______。 A．缺乏UDPG脱氢酶 B．缺乏古洛糖酸内酯氧化酶 （分数：1.00） A. B. √ 解析： 3.维生素A在视黄醛中的活性形式是______。 （分数：1.00） A.全反视黄醛 B.11-顺视黄醛√ C.胡萝卜素 D.视黄酸 解析： 4.NAD +的组成中含有______。 （分数：1.00） A.维生素A B.维生素B C.尼克酰胺√ D.泛酸 解析： 5.临床上用于治疗恶性贫血的维生素是______。 （分数：1.00） A.维生素C B.维生素B12 √ C.维生素A D.维生素E 解析： 6.在氧化脱羧反应中，需哪种辅酶参加______。 （分数：1.00） A.抗坏血酸 B.焦磷酸硫胺素√ C.羧化生物素 D.叶酸 解析： 7.NAD + /NADP +扣传递氢的功能结构是______。 （分数：1.00） A.腺苷酸上的2"位磷酸 B.烟酰胺环中1位N C.烟酰胺环上4、5位碳间双键 D.烟酰胺环上的4位C √ E.核糖环中的3"-OH 解析： 8.以NADP +为辅酶的酶有______。 （分数：1.00） A.苹果酸脱氢酶 B.苹果酸酶 C.丙酮酸脱氢酶 D.6-P-葡萄糖脱氢酶√ 解析： 9.具有抗氧化作用的脂溶性维生素是______。 （分数：1.00） A.维生素C B.维生素E √ C.维生素A 解析： 10.肠道细菌可以合成下列哪种维生素______。 （分数：1.00） A.维生素A B.维生素C C.维生素D D.维生素E E.维生素K √ 解析： 11.下列叙述哪一种是正确的?______ （分数：1.00） A.所有的辅酶都包含维生素组分 B.所有的维生素都可以作为辅酶或辅酶的组分 C.所有的B族维生素都可以作为辅酶或辅酶的组分√ D.只有B族维生素可以作为辅酶或辅酶的组分 E.只有一部分B族维生素可以作为辅酶或辅酶的组分 解析： 12.下列化合物中除哪个外都是环戊烷多氢菲的衍生物?______ （分数：1.00） A.维生素D B.胆汁酸 C.促肾上腺皮质激素 D.肾上腺皮质激素 E.强心苷√ 解析： 13.下列化合物中，除哪个外都是异戊二烯的衍生物?______ （分数：2.00） A.视黄醇 B.生育酚√ 实验一鸡卵类黏蛋白的分离与纯化 【目的要求】 1、掌握从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白的原理及方法。 2、了解凝胶过滤层析、离子交换层析的工作原理，掌握基本操作技术。 3、掌握消光系数法测定蛋白质含量的原理及计算方法。 【实验原理】 鸡卵类黏蛋白是由鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，常用于胰蛋白酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。 鸡卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。它在10%三氯乙酸或50%丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH值及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，或得鸡卵类黏蛋白的粗提液。 含盐或其他小分子的蛋白质混合溶液，在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速速最先流出柱外，而相对分子量较低的盐或其他小分子物质则可以进入凝胶内部的微孔中，所以向下移动的速度较慢而最后流出柱外。这样鸡卵类黏蛋白粗提液经过凝胶柱层析后可以除去小分子物质（盐）而得到初步纯化。 初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经过DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。 本实验先将鸡蛋清先用三氯乙酸溶液处理，离心后去除沉淀物，然后由丙酮分级沉淀获得粗品，经SephadexG-25柱层析脱盐，DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，再经透析及丙酮沉淀进一步纯化，最后真空干燥可得到鸡卵类黏蛋白合格产品。 鸡卵类黏蛋白在280nm处得消光系数A 1%1cm=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413,据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。 【试剂与器材】 1、试剂 （1）丙酮（2）新鲜鸡蛋（3）0.5mol/L HCL溶液 （4）Sephadex G-25 (5) DEAE-纤维素粉 （6）10% pH 1.15三氯乙酸（TCA）：将称取的三氯乙酸置烧杯中，加入2/3体积的蒸馏水溶解，用6mol/L的NaOH调至约pH 1.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积。 （7）0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液 （8）0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液 （9）0.3mol/L NaCl-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液 2、器材 恒温水浴 752 紫外分光光度计离心机 pH酸度计 核酸蛋白质检测仪真空干燥器 层析柱（25×300mm, 15×200mm）贮液瓶离心管 布氏漏斗（80mm）玻璃烧结漏斗（G-3）抽液瓶沸水浴 【操作方法】 1、鸡卵类黏蛋白的提取2015高级生物化学及实验技术试题答案
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