各种转染方法比较

各种转染方法比较

转染方法原理主要应

用

特点主要的厂家及产品

DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸

带负电的磷酸骨架相互作用形成

的复合物被细胞内吞

瞬时转

染

相对简便、重复比磷酸钙好,但对细

胞有一定的毒副作用,转染时需除血

清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS

细胞系

Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran

Transfection Kit)

DNA复合物吸附细胞膜稳定转

染,染瞬

转染

不适用于原代细胞（所需的DNA浓

度较高）,操作简便但重复性差,有些

细胞不适用

细胞建议用CSCL梯度离心，转染

是拷贝数较多

GIBCO BRL，Promega

阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的

磷酸基团形成复合物，然后脂质

体上剩余的电核与细胞膜上的唾

液酸残基的负电核结合；另一种

解释是通过细胞是内吞作用而被

进入细胞。(若DNA浓度过高，

中和脂质体表面电核，而降低了

与细胞的结合能力)

稳定转

染,瞬时

转染,所

有细胞

使用方法简单，可携带大片段DNA，

通用于各种类型的裸露DNA或

RNA，能转染各种类型的细胞，没

有免疫原性。虽在体外基因转染中

有很高的效率，但在体内，能被血

清清除，并在肺组织内累积，诱发

强烈的抗炎反应，导致高水平的毒

性，这在很大程度上限制了其应用

Invitrogen（Lipofectamine

2000，Lipofectamine，

Lipofectin，Lipofectamine

Plus，Cellfectin）

Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE

6）

CPG Biotech Co（GeneLimo

Plus，GeneLimo Super）

Promega（Transfast，Tfx，

Transfectam）

阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负电的

磷酸基团形成带正电的复合物后

与细胞表面带负电的蛋白多糖相

互作用，并通过内吞作用进入细

胞。

稳定转

染,瞬时

转染,所

有细胞

除了具有阳离子脂质体的转染效率

高，操作简单，适用范围广，重复

性好等特点外，还具有在体内，转

染效率高，细胞毒性低等特点，是

新一代的转染试剂。

Sunma(梭华－Sofast)

Qbiogene（jetPEI?）

Qiagen(SuperFect，

Polyfect）

病毒介导法逆转录病

毒(RNA)

通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞

表面的受体相互作用而进入宿主

细胞，之后反转入酶启动合成

DNA并随机整合到宿主基因组

中

稳定转

染,特定

宿主细

胞

可用于难转染的细胞、原代细胞，

体内细胞等,但携带基因不能太大

（<8kb）,细胞需处分裂期,需考虑安

全因素中国科学院典型培养物保藏委员

会

腺病毒(双

链DNA)

先和细胞表面的受体结合，继而

在αv整合素介导下被细胞内吞

瞬时转

染,特定

宿主细

胞

可用于难转染的细胞,需考虑安全因

素

Biolistic 颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）将DNA用显微重金属颗粒沉淀，

再将包被好的颗粒用弹道装置投

射入细胞，DNA在胞内逐步释

放，表达

瞬时性

转染，稳

定转染

可用于：人的表皮细胞，纤维原细

胞，淋巴细胞系以及原代细胞

显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶

细胞核

稳定转

染,瞬时

转染

转染细胞数有限,多用于工程改造或

转基因动物的胚胎细胞

电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，

DNA通过膜上形成的小孔导入

稳定转

染,瞬时

转染,所

有细胞

适用性广，除了质粒外，还可转染

大的基因组（>65kb）但细胞致死率

高，DNA和细胞用量大，需根据

不同细胞类型优化电穿孔实验条

件，拷贝数较少1-20

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

miRNA及其inhibitor转染方法

miRNA及其inhibitor转染方法 1 对mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control进行稀释和分装（终浓度为100 nmol/μl）。 （1）Mimics加入250 μl DEPC处理的水； （2）Mimics control加入125 μl DEPC处理的水； （3）inhibitor加入250 μl DEPC处理的水； （4）inhibitor control加入125 μl DEPC处理的水； 对以上进行分装：mimics 20 μl每管，mimics control 10 μl每管，inhibitor 20 μl每管，inhibitor control 10 μl每管。 分装后于－80 ℃保存。 2经过调整，细胞状态较好。晚上铺细胞，4个60 mm培养皿，每皿×105细胞。做好标记，（1）为mimics（2）为mimics control（3）为inhibitor（4）为inhibitor control。 3 上午八点对昨天晚上的细胞进行转染。 （1）a 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics，作用5 min b 用500 μl opti-MEM稀释20 μl mimics control，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释20 μl inhibitor control，作用5 min （2）a 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min b用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min c 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min d 用500 μl opti-MEM稀释10 μl lip 2000，作用5 min （3）分别将（1）、（2）对应的a、b、c、d混合，轻轻吹打均匀后室温作用20 min。（4）用无血清的DMEM将培养皿中的细胞清晰干净，至少2次 （5）向培养皿中加入3 ml无血清DMEM （6）向培养皿中加入a和b的混合液（成点状均匀加入） （7）放入细胞培养箱作用6 h。 4 下午三点对转染细胞进行换液：弃去无血清DMEM后每个60 mm培养皿加入4 ml 含10%血清的DMEM，18 h后接毒。

各种转染试剂的中文转染方法

各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤： 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁细胞的稳定转染： 转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：

lipo2000转染操作步骤(精)

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分

两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分精品论文 两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分 析 韦伟，赵元元，张维娅，赵书红，李新云 5 ,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室～华中农业大学～武汉 430070, 摘 要:C2C12 细胞是鼠的骨骼肌成肌细胞～常用于体外研究肌细胞成肌分化～研 究表明 C2C12 细 胞的转染效率较低～为了提高 C2C12 细胞的转染效率～建立理想的转染条件 ～本研究对 比分析了 FuGENE HD 和 Lipofectamine 2000 两种常用转染试剂的转染效 率。研究结果表明 10 FuGENE HD 转染寡核苷酸的效率比 Lipofectamine 2000 高～而转染 质粒的效率比 Lipofectamine 2000 低。另外我们还发现培养基中的血清会降低细胞的转染 效率。本研究结 果为提高 C2C12 细胞的转染效率提供了新的信息。 关键词:转染效率,寡核苷酸,质粒,C2C12 细胞 中图分类号:Q-33 15 Compare analysis of the transfection efficiency of two transfection regents in C2C12 Cells

Wei Wei, Zhao Yuanyuan, Zhang Weiya, Zhao Shuhong, Li Xinyun (Key Lab of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, 20 Huazhong Agricultural University, WuHan 430070) Abstract: C2C12 cells are the myoblast of mice, which are used as the model for investigating the differentiation of myoblast in vitro. The transfection efficiency of the C2C12 cells was not good in many studies. In order to improve the transfection efficiency of C2C12 cells and contribute an ideal condition of transfection. The transfection efficiency of two transfection reagents, FuGENE 25 HD and Lipofectamine 2000, was analyzed in this study. According the results, the transfection efficiency of FuGENE HD was higher than that of Lipofectamine 2000 when oligo nucleic acids was transfected, but it was lower than Lipofectamine 2000 when plasmid was transfected in the C2C12 cells. Also, we found that serum in cultured medium could inhibit the transfection efficiency. These results offered useful information for improving the transfection efficiency of 30 C2C12 cells. Key words: transfection efficiency; oligo nucleic acids; plasmid; C2C12 cells 0 引言 简转染是指将外源遗传物质转入到真核细胞内的过程。转染对现代分子生物学研究意义

各种转染方法比较

各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓 度较高）,操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL，Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物，然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合；另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电核，而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA，能转染各种类型的细胞，没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率，但在体内，能被血 清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒 性，这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine， Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin） Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co（GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega（Transfast，Tfx， Transfectam）

病毒转染原理及步骤

病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

真核细胞转染操作方法

一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。 一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。 利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途： (1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。 (2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。 (3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。

(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的 情况。 (5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。 (6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列 得到表达。 (7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。 DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。 进行真核转染的一般程序： 克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定 下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。 一、试剂准备 1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。 2、核酸贮存液，过滤除菌。 3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。 二、操作步骤 (一)克隆目的基因 1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。 2、回收特异性扩增片段，连入T载体。 3、转化DH5α，质粒制备。 4、酶切初步鉴定，测序证实。 (二) 真核重组表达载体的构建：

细胞转染的步骤

【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

转化和转染

转染和转化的区别 转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。 基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。 转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。 感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 基因转染 基因转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。 基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，

各种转染试剂中文说明

FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 72 ·研究原著· 孙莉，女，1990年生，江苏省靖江市人，汉族，在读硕士，主要从事细胞生物学和分子生物学方面的研究。 通讯作者：魏建峰，博士，副教授，江苏省脑病生物信息重点实验室，江苏省徐州市 221004；徐州医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，江苏省徐州市 221004 文献标识码:A 来稿日期：2019-03-19 送审日期：2019-03-27 采用日期：2019-05-31 在线日期：2019-09-26 Sun Li, Master candidate, Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; School of Nursing, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China Corresponding author: Wei Jianfeng, MD, Associate professor, Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China 两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较 孙 莉1， 2，纵艳艳1，魏建峰1， 3 (1江苏省脑病生物信息重点实验室，江苏省徐州市 221004；徐州医科大学，2护理学院， 3基础医学院组织胚胎学教研室，江苏省徐州市 221004) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1870 ORCID: 0000-0002-1800-8057(孙莉) 文章快速阅读： 文题释义： 胚胎干细胞：是一类起源于胚胎发育早期囊胚内细胞群中未分化的细胞，具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能。 转染：是真核细胞主动或被动导入外源DNA 片段而获得新的表型的过程。 摘要 背景：现有方法将外源分子如DNA 导入到人胚胎干细胞用于科学研究的效率普遍较低，如何优化现有条件，提高转染效率显得尤为重要。 目的：比较两种不同的传代方法对人胚胎干细胞系H9转染效率的影响，优化胚胎干细胞转染条件。 方法：人胚胎干细胞系H9分别采用小克隆传代法和单细胞传代法进行传代，传代后继续培养细胞48 h ，用Lipofectamine 3000转染pAdTrack-AKT1荧光质粒2 d 后，荧光显微镜下观察荧光质粒的表达，流式细胞仪检测人胚胎干细胞的转染效率；RT-qPCR 和Western blot 分别检测转染后AKT1在mRNA 和蛋白质水平的表达。 结果与结论：①荧光显微镜下观察发现单细胞传代组表达荧光质粒的细胞数量更多，流式细胞仪检测单细胞传代法的转染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆传代法的转染效率[(19.52±0.86)%]，差异有显著性意义 (P < 0.01)；②单细胞传代组转染后AKT1 mRNA 和蛋白的表达均高于小克隆传代组，差异有显著性意义 (P < 0.01)；③结果表明，采用单细胞传代法，增加细胞与转染试剂脂质体的接触面积可提高人胚胎干细胞的转染效率。 关键词： 人胚胎干细胞；小克隆传代法；单细胞传代法；脂质体转染；转染效率 中图分类号：R459.9；R394.2；R318 基金资助： 江苏省高校自然科学基金(14KJB310021)，项目负责人：魏建峰；江苏省脑病生物信息重点实验室开放课题(JSBl1403)，项目负责人：魏建峰 Comparison of two passage methods affecting the transfection efficiency of human embryonic stem cells Sun Li 1, 2, Zong Yanyan 1, Wei Jianfeng 1, 3 (1Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2School of Nursing, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 3Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China) Abstract BACKGROUND: In the research of human embryonic stem cells, introducing exogenous molecules such as DNA into cells is a common research method, but the transfection efficiency is relatively low. It is crucial to answer the question of how to optimize the existing conditions to improve the transfection efficiency. OBJECTIVE: To compare the effects of two different passaging methods on H9 transfection efficiency, in order to 人胚胎干细胞 单细胞传代法