人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化
中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,
2492
1
Biomedicine Research and
Development Centre of Jinan University, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China; 2
Guangzhou
(Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China; 3
Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4
Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China; 5
Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC
29634-0905, USA
He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and
Development Centre of Jinan University, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China; Guangzhou
(Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China
heshq106@https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,
人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○
何绍清1，
2，罗振宇1，
2，刘秋英1，
2，周向荣△2，
3，邓铭权△2，
3，罗 新4，姚润斯4，高 志5，王一飞○1，
2
Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts
He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2
Abstract
He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/433067504.html, https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,]
摘要
何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/433067504.html, https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,]
0 引言
间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞
[7-10]
。
目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少
和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨
髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。
脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出
何绍清，等.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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.org
Correspondence to:
Wang Yi-fei, Professor, Biomedicine Research and
Development Centre of Jinan University, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China; Guangzhou
(Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou
510632, Guangdong Province, China
Supported by: the Foundation of Guangzhou
(Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory *; International Cooperation Exchange for Science and Technology *
Received: 2010-02-17 Accepted: 2010-03-02
人脐带沃顿胶来源的间质细胞具有多能干细胞特性后，越来越多的研究集中到该领域中。
本实验主要尝试从脐带组织中分离干细胞，并从增殖能力、细胞免疫表型、分化潜能方面对其进行研究，为其未来的应用研究提供理论依据和可能。
1 材料和方法
设计：细胞学体外对比观察。
时间及地点：于2009-01/12在暨南大学生物医药研发基地完成。
材料：正常足月剖宫产健康婴儿脐带组织，取自暨南大学附属第一医院手术室，经产妇知情同意，实验经医院伦理委员会批准。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、支原体等检测。采集后4 ℃保存，6 h 内完成实验。
主要试剂及仪器：
实验过程：
人脐带间充质干细胞的分离与培养：取出脐带
放入含抗生素的Hank’s 液中，洗尽血液，剔除血管并剪成1.0~2.0 mm 3小块。组织块直接培养法：将组织块按适当密度接种于培养板，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，放置于37 ℃、体积分数5%CO 2饱和湿度培养箱内培养，每3 d 补加新鲜培养液。当镜下观察组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块，添加培养液继续培养。约20 d 后细胞生长达约80%融合时，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 的消化液消化，按 104 /cm 2传代培养。酶消化法：组织块和0.1%Ⅰ型胶原酶按1∶1体积比例于37 ℃搅拌消化4~6 h ，0.2%透明质酸酶继续消化30 min ，250 g 离心收集细胞，接种培养瓶，放置于37 ℃、体积分数5%CO 2饱和湿度培养箱内培养。96 h 后半量更换培养液，以后隔天半量换液。约
10 d 后成纤维状细胞达80%融合时按上述方法传代培养。
细胞周期及生长曲线的测定：取对数生长期的
第3代细胞，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA
的消化液消化，按2×107 L -1
接种于96孔板，每
天取4孔细胞用MTT 法检测活细胞数，连续培养8 d 。以培养时间(d)为横轴，570 nm 处吸光度值(A )为纵轴，绘制生长曲线。细胞周期采用体积分数70%乙醇5 mL 于4 ℃固定过夜，再用40 mg/L 的RNase A 37 ℃孵育20 min ，加入3 mg/L 碘化丙啶4 ℃ 30 min ，流式细胞仪测定。
细胞免疫表型的测定：取对数生长期的第3代
细胞，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 的消化液消化，PBS 洗涤3次，PBS 悬匀，流式细胞术法检测表面抗原CD59、CD44、CD29、CD105、CD34、CD28、CD45、CD31、CD40、CD86、HLA-DR 表达情况。
体外向脂肪细胞诱导分化：取第3代脐带源间充
质干细胞，细胞按2×104 /cm 2接种于6孔板，含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM 中培养至100%融合，换为成脂分化诱导液(含体积分数10%
胎牛血清，10 mg/L 胰岛素，1 μmol/L 地塞米松，0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤，100 μmol/L 吲哚美辛，100 mg /L 青霉素，100 U/mL 链霉素)。阴性对照组用不含诱导因子的培养液培养。每三四天换1次液，连续诱导14 d ，取出盖玻片，PBS 洗2次，40 g/L 多聚甲醛固定10 min ，油红O 染液染色30 min ，蒸馏水冲洗至背景干净，自然晾干后中性树脂封固，电子显微镜下观察并采集图片。
体外成骨诱导分化：取第3代脐带源间充质干
细胞，细胞按8×103/cm 2接种在6孔板内无菌盖玻片上，于含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM 中培养至80%融合，弃培养液，无菌PBS 洗2次，换成成骨分化诱导液(含体积分数10%胎牛血清，100 nmol/L 地塞米松；10 mmol/L β-甘油磷酸钠;0.2 mmol/L 抗坏血酸，100 mg/L 青霉素， 100 U/mL 链霉素)。每三四天换1次液，连续诱导三四周 ，在显微镜下观察可见黑色不透明区域时，取出盖玻片，PBS 洗2次，80%丙酮固定 10 min ，用钙钴法染色检测碱性磷酸酶活性。
主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态；流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞免疫表型；显微镜观察诱导过程中细胞形态及染色变化情况。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、三作者，评估为第二、四作者。均经过系统培训，
试剂及仪器
来源
I 型胶原酶，吲哚美辛，β-磷酸甘油, 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤 Sigma,美国 DMDM/F12培养基、胎牛血清 Gibco ，美国 鼠抗人细胞表面标志分子抗体 Abcam,美国
流式细胞仪 BeckmanCoulter,
美国
培养瓶，培养皿，离心管 Corning,美国
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1
暨南大学生物医药研发基地，广东省广州市
510632；2
广州(暨南)-香港细胞工程联合实验室，广东省广州市510632；3亚太干细胞科研中心有限公司，中国香港 999077；4暨南大学附属第一医院妇产科，广东省广州市 510632； 5
克莱姆森大学生物工程系，美国南卡罗来纳州 29634-0905
何绍清★，女，1984年生，江西省宜春市人，汉族，暨南大学在读硕士，主要从事间充质干细胞多能性的研究。 heshq106@https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,
通讯作者：王一飞，教授，暨南大学生物医药基地，暨南大学生命工程与健康研究院，广东省广州市 510632
中图分类号:R394.2 文献标识码:A
文章编号:1673-8225 (2010)14-02492-05
收稿日期：2010-02-07
修回日期：2010-03-02 (20100302024/ GW ·Z)
未采用盲法评估。统计学分析：所有数据以x _
±s 表示，用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用One-way ANOVA 方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学处理由第一作者完成。
2 结果
2.1 人脐带间充质干细胞形态学及生长特点 用组织块贴壁法分离出的脐带源间充质干细胞，在1 周左右时，可观察到有短杆状或成纤维状细胞从组织块周围爬出(图1)。去除组织块完全培养液培养，呈规则的集落生长(图2)。
酶消化法分离的细胞在48 h 内完全贴壁，出可见有短杆状和少量成纤维状细胞，还有呈鹅卵石状的内皮细胞，经过多次换液和传代可淘汰至剩下形态基本单一的成纤维状细胞。传代培养的细胞增殖较原代快，按2×104 /cm 2传代接种，一般三四天能达到80%以上融合。通过对第3代细胞生长曲线描绘，
发现传代培养细胞的潜伏期约为
24 h
，对数增殖期为
2~5 d
，五六天后进入平台期
(图
3)
。群体倍增时间约为30 h 。
2.2 人脐带间充质干细胞免疫表型分析 第3代人脐带间充质干细胞流式细胞术检测4组基质细胞表面标记、4组造血及内皮细胞相关表面标记及3组免疫排斥相关表面标记。结果显示，高表达基质细胞相关表面标记：CD44，CD29，CD59，CD105，CD28，CD31，CD34，CD45造血及内皮细胞相关表面标记与CD40，CD86，HLA-DR 等免疫排斥相关表面标记均为阴性。见图4。
Figure 1 Primary culture of human umbilical
cord-derived mesenchymal stem cells at
10 days after culture (×100) 图 1 脐带间充质干细胞原代培养第10 天(×100)
Figure 2 80% confluence of human umbilical
cord-derived mesenchymal stem cells at Primary culture (×40) 图 2 80%融合的P0人脐带间充质干细胞(×40)
Figure 3 Growth curve of the 3rd passage of human
umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
图 3 传代培养第3代人脐带间充质干细胞生长曲线
Figure 4
Antigen expression of the 3rd passage of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells 图 4 传代培养第3代人脐带间充质干细胞表面标记表达
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Cuture tine (d)
A 570 n m
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2.3 细胞向成骨和脂肪细胞诱导形态变化及功能鉴定 脐带源第3代间充质干细胞在相应的诱导培养条件下，能向脂肪细胞和成骨细胞分化。前者油红O 染色显示胞浆中充满红色的油滴(图5)。后者碱性磷酸酶钙钴法染色显示大部分细胞呈阳性反应，细胞胞质呈黑色(图6)。
3 讨论
目前，人脐带间充质干细胞主要分离自脐带的沃顿胶及脐静脉内皮下层[16-17]，可通过酶消化法和组织块直接培养法获得。本实验采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞并在体外扩增培养。组织块直接培养法有操作简单，经济，还能很好地保持细胞活力的特点，从接种到首次传代时间约20 d 。酶消化法较组织块法昂贵、操作较复杂，传代所需的时间一般为10 d 。因此，酶消化法较组织块直接培养法能更加快速地得到细胞，更符合应用的要求。另外，作者应用改良的酶消化法，Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合消化的方法成功获得细胞。脐带血管周围组织因富含黏多糖和蛋白多糖。透明质酸酶是一种能水解透明质酸
黏多糖的酶，能水解Ⅰ型胶原酶消化后的粘稠的消化液。如此便能减少因离心次数多而造成的细胞损伤，并能更多地将细胞富集。
流式细胞术分析获得的人脐带间充质干细胞显示，70%以上的细胞处于G 0期，这表明细胞增殖活跃，符合干细胞的基本特性。
人脐带间充质干细胞是区别于胚胎干细胞和成体干细胞的胎儿干细胞，是一种新的多能间质干细胞。人脐带间充质干细胞除了满足国际细胞疗法和间充质与组织干细胞委员会制定的最低间充质干细胞标准[18]，还表达一些原始干细胞标记[19-22]。另外，人脐带间充质干细胞可抑制淋巴细胞的增殖
[23-24]
，这表明它作为一种免
疫缺陷的细胞，在移植应用中发生免疫排斥的可能性小。目前体外分离培养的间充质干细胞的鉴定仍未有标准可执行。间充质干细胞能表达多种表面抗原，但是没有特异的表面抗原，这些抗原可在基质细胞、内皮细胞和表皮细胞中出现，但是造血干细胞阴性表达[25]。根据文献报道，表面抗原表达阳性的有CD 29、CD44、CD59、CD71等，而造血干细胞标记CD14、CD34、CD45、CD117、CDHLA-DR 等表达为阴性[26-27]。由于间充质干细胞没有特异表达的抗原，本实验仅选择其中几个文献报道过的抗原测定。流式细胞术分析结果显示，人脐带间充质干细胞强表达CD29，CD44，CD59，CD105，阴性表达CD28，CD31，CD34，CD45，CD40，CD86，HLA-DR 。这表明作者分离得到的细胞是一类非造血、非内皮、免疫缺陷的基质细胞。
由于没有鉴定人脐带间充质干细胞的特异表面抗原，其向多种间质组织细胞如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化的多向分化潜能被认为是最有力的证据[28]。本实验分离的细胞可定向诱导分化为脂肪和成骨细胞。脂肪分化细胞经染色胞浆中充满油滴空泡；成骨分化细胞可分泌碱性磷酸酶。这说明分离得到的细胞确实是具有多向分化潜能的间充质干细胞。
应用间充质干细胞作为种子细胞治疗骨发生疾病、心脏病、脑卒中，肝病和肿瘤等疾病是目前成体干细胞研究的热点。尽管目前研究报道显示已有不少间充质干细胞在动物模型治疗的成功案例，但由于其研究不够深入，另外其在体内的作用机制尚不清楚，所以其应用还有待深入研究。作者用新的方法，从易于取材、间充质干细胞含量丰富的胎儿脐带中分离纯化得到的间充质干细胞，为临床研究和应用提供了新的视角。
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Figure 5 Oil red O staining of adipocytes (×200) 图 5 脂肪细胞油红O 染色(×200)
Figure 6 Alkaline phophatase staining of osteblasts (×40)
图 6 成骨细胞碱性磷酸酶染色(×40)
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CRTER 杂志“学术探讨”栏目稿件体例修改内容：本刊中文部 [3]
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CRTER 杂志为加强“学术探讨”栏目稿件的可读性、实用性水平，又能够有区别于他刊他篇的特色，特发出如下体例修改内容要求。
摘要：4段结构式，中文400~500字，英文200~300单词。 目的：说明要认识和解决的问题。 方法：应有纳入和排除标准，严格的检索策略，检索过的数据库类型。 结果：分别得到多少篇文章，多少篇由于什么样的原因被排除，最后纳入了多少文章，并且对所有纳入的文章有详细的相关数据介绍以及质量评价等，数据分析的结果。
结论：总结本文的主要观点，可能的应用前景及其局限性。
关键词：5~8个 0 引言 依据主题发展、现状及存在的问题，提出问题。
1 对象/资料和方法 1.1 资料/对象的纳入与排除标准 1.
2 资料提取策略：包括文献检索的资格；文献检索的时间范围和使用的关键词；尽可能获取所有文献(包括研究文献作者的个人通信)；检索的数据库和档案库；采用检索软件及其版本
号，包括使用的特殊功能(如：进行主题词及其下位词的扩展检索)；手工检索(如：已有文献的参考文献清单)；处理非英语文献、只有摘要和未发表文献的方法；介绍个人通信的情况(资料
的搜寻除了检索，还包括联系研究者，获取未
发表的资料和对发表资料的说明)。
1.3 检索结果及评价 2 结果 此部分是对检索到的文章进行进一步的解析，建议从文献中抽出相关 内容列表说明或做图说明。下面列举出9项解析内容，可以根据文
章的具体情况选择5~9项进行解读。
2.1 研究人群/对象：对检索文章人群或动物的分析。
2.2 多中心与单中心：对检索文章科研设计类
型的分析。
2.3 随机、对照与设盲：对检索文章统计学方法设计及实施情况的分析。 2.4 干预方案：对检索文章干预方案的分析与比较，可选一部分列表、列图说明。 2.5 结果分析：对检索文章结果的分析，也可以用图表表示。
2.6 样本量：检索文章样本量的分析及意义。 2.7 统计学差异：检索文章统计学处理的特点。 2.8 临床意义：检索文章具有的临床价值。 2.9 其他。
3 讨论(按如下层次内容修稿) 3.1 本文相关知识点 3.2 热点问题的讨论：以问句形式提出。
4 参考文献 文献数应≥20条
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R 2010年版权归《中国组织工程研究与临床康复》杂志社所有
脐带间充质干细胞综述(转)
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.sodocs.net/doc/433067504.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进_李艳琪
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.sodocs.net/doc/433067504.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts
脐带间充质干细胞的前世今生
脐带间充质干细胞的前世今生 概念：脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。 分离培养方法：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至 1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。 优势：脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[2] ，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
脐血间充质干细胞分离培养与鉴定-新桥医院
脐血间充质干细胞分离、培养与鉴定 李启明1程天民1李宁2*粟永萍1冉新泽1 (1.第三军医大学全军复合伤研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室 2.第三军医大学新桥医院, 高压氧中心重庆400038) 摘要：目的研究脐带血(HUCB)中含有的间允质干细胞(MSCs)体外分离、培养条件，探讨其作为种子细胞用于下一步实验研究的稳定性与实用性。方法无菌条件下取正常足生产的脐带血，经CPDA-1复合抗凝剂抗凝，然后经过去红细胞处理，再用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，DMEM/F12培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层，采用定向诱导分化方法检测鉴定获得的MSCs 结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，问充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态，但偏向半月形弯曲状，经过成肌、成脂肪、成神经细胞诱导分化成功后确定为间充质干细胞。结论脐血来源的间充质干细胞能够在体外分离、培养出有用的进一步实验所需要的种子细胞。 关键词：脐带血；间充质干细胞；细胞培养；诱导分化鉴定 中图法分类号：文献标识码： THE ISOLATION CULTURE AND IDENTIFICATION OF HUCA MSCs LI Qi-ming, CHEN Tian-min LI ning, SU Yong-ping, RUAN xin-ze (1.State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institute of Combined Injury, 2. Hyperbaric oxygen Center Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China) Abstract: Objective To investigate the isolation，cultivation, differentiation and identification of human umbilical cord blood(HUCB) mesenchymal stem cells(MSCs) in vitro，and to observe the feasibility of using MSCs as seed cells in experimental furthermore．Methods HUCB were collected from full term childbirth scheduled for Cesarean section and vagina deliveries, a11 specimens was obtained sterilely with Preservative-free CPDA-1 compound natrium citricum. After lyse red blood cell, the cord blood mononuclear cell was isolated by human lymphocyte separating medium. culture with dulbecco's modified eagle's medium(DMEM/F12) medium to produce adherent layer and identification with orientation differentiation results. Results The UCB-derived mononuclear cells，when set in culture，gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-1ike but crescent-shaped or bending-shaped morphology or mesenchymal-like phenotype. It can be affirmed as the MSCs which characterized with multi-differentiating potentiality after the myogenic、lipogenic and neurogenic differentiation. Conclusion MSCs in HUCB can be isolated and cultivated in vitro，which could be regarded as an alternative source of MSCs for further experimental tests。 Key words: umbilical cord Blood；mesenchymal stem cells；culture in vitro；differentiation and identification *通信作者
胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016.07.21
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定 刘亭 2016.7.21 目录 前言 (2) 1分离制备PMSC组织的选取 (3) 2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (5) 2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (5) 2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (6) 3 原代培养和继代培养 (10) 3-1培养基 (10) 3-2培养密度 (11) 3-3培养条件 (11) 3-4换液 (11) 3-5 传代培养 (12) 3-6细胞形态与生长速度 (12) 3-7 MSC的冻存与复苏： (12) 4细胞表面抗原检测 (13) 5生长曲线 (13) 6细胞周期 (13) 7分化潜能 (13) 参考文献 (13) 附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (15) 脐带血 (15) 脐带 (15) 羊膜 (17) 绒毛膜 (18) 蜕膜层 (18) 胎盘 (19) 整体灌注法 (20) 附件2 背景知识 (20) 附件3 PMSC实验所需试剂 (21)
前言 干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。 间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。 MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞。此外，一些研究学者还发现，MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。近年来MSC 已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014）。 目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每105-106个单个核细胞中大约只有1个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干