姜黄素对慢性应激模型大鼠学习记忆能力的影响
·论 著·
姜黄素对慢性应激模型大鼠学习记忆能力的影响
朱洁瑾1，廖守法2，赵乐萍3，都霞1，林蒙蒙1，潘建春1
（1.温州医学院 药学院， 浙江 温州 325035；2.温州光明医院，浙江 温州 325001；3.温州医学院附属乐清医院 药剂科， 浙江 温州 325600）
[摘 要]目的：研究姜黄素对慢性应激模型大鼠空间学习记忆能力的影响及其可能机制。方法：随机分为正常组、应激模型组、姜黄素组（2.5、5和10 mg/kg，p.o.）和氟西汀（10 mg/kg，i.p.）组，每组8只。采用21d 慢性不可预知的刺激法建立大鼠应激模型，观察大鼠八臂迷宫和Y 迷宫学习记忆成绩的改变，同时采用Western -blot 等方法检测海马内脑源性神经营养因子（BDNF）和磷酸化cAMP 反应元件结合蛋白（pCREB）的表达情况。结果：与正常对照组比较，应激模型组学习记忆能力明显下降（P <0.01），姜黄素组（5和10 mg/kg）能明显改善这一现象（P <0.05，P <0.01）
；应激模型组大鼠海马内BDNF 和pCREB 的含量较正常组显著降低（P <0.01），姜黄素组（5和10 mg/kg）与模型组比较含量有所提高（P <0.05，
P <0.01），这一结果与阳性对照药氟西汀组相似。结论：姜黄素可以逆转慢性应激对大鼠学习记忆的损伤，
这一作用可能与增强cAMP -CREB -BDNF 信号转导通路，从而影响神经元存活及其可塑性机制有关。[关键词]
姜黄素；慢性应激；学习记忆；脑源性神经营养因子；cAMP 反应元件结合蛋白；大鼠
[中图分类号]
R964
[文献标识码]
A
[文章编号]
1000-2138（2011）05-0462-04
Effect of curcumin on learning and memorial ability in chronically stressed rats
ZHU
Jiejin*，LIAO Shoufa，ZHAO Leping，DU Xia，LIN Mengmeng，PAN Jianchun.
*Department of
pharmachology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035
Abstract: Objective: To investigate the offect of curcumin on learning memorial ability deficit in the chronically stressed rats and the its possible protective effects on learning -memory ability． Methods:Adult male Wistar rats were randomly divided into six groups: the control rats were housed in normal situations without any treatment；the chronically stressed rats were subjected to a variety of unpredictable stressor for 21 days ；curcumin group （2.5，5，10 mg/kg，p.o）and fluoxetine group（10 mg/kg，i.p.）. After the stress experiment，all rats were tested for eight -arm maze task and Y -maze spatial recognition memory. In addition，the possible mechanism of neurogenesis on stressed rats and the effects of curcumin were also analysed by western -blot and immunohistochemistry assay. Results:Compared with the control group，the stress induced mouse model decreased learning ability （P <0.001），curcumin （5，10mg/kg）could improve the ability of learning memory （P <0.05，P <0.01）
. The expression of pCREB and BDNF in hippocampus was distinctively decrease in stressed rats （P <0.01）
，while curcumin （5，10 mg/kg） could reverse this condition.（P <0.05，
P <0.01）. Conclusion:Curcumin reverses the learning memory damage. These effects may be related to facilitaion of the cAMP -CREB -BDNF signal transduction cascades， which influences the neuron survival and adaptive plasticity induced by curcumin.
Key words: curcumin；chronic stress；learning memory；BDNF；CREB；rats
收稿日期：2010-10-15
基金项目：鹿城区科技计划资助项目（S 090213）。作者简介：朱洁瑾（1986-），女，浙江杭州人，硕士生。通讯作者：潘建春，教授，硕士生导师，E m a i l ：W e n z ho u p a n 2003@https://www.sodocs.net/doc/404073377.html,。
任何来自环境、社会、工作、生活、躯体精神、心理的刺激均能使机体处于生理或心理的应激之
中。现代文明社会的发展和高科技对人类生存环境全方位的渗透，使人类承受着越来越复杂、越来越强烈的生理和心理应激。适当应激可增强人们对外界有害因素的免疫和抗御能力，但持久的应激可导致机体生理功能紊乱，使机体出现学习和记忆功能障碍、抑郁症、应激性精神紊乱、痴呆等多系统的损坏[1-2]。
在中枢神经系统中，海马是与认知行为功
能密切相关的脑区，富含各种信使受体，尤其是富含糖皮质激素受体，在应激反应中，它不仅是高位调节中枢，更是受应激累及的最敏感区域，极易受到高浓度糖皮质激素的攻击[3]。慢性应激或长期在应激水平糖皮质激素的作用下，会使海马神经元发生萎缩甚至死亡[4]。cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路的激活介导脑源性神经营养因子（BDNF）的表达并促进神经元再生。
姜黄素（curcumin)是从姜科植物Curcuma longa L.中提取的一种相对分子质量小的多酚类物质，通常认为它是姜黄中的最有效成分。研究发现，姜黄素具有抗氧化、抗炎、免疫调节和神经保护作用[5]。因此本研究采用综合性交替刺激，建立大鼠慢性应激模型，并观察其空间学习记忆能力的变化模式，同时从神经保护的角度探讨姜黄素对慢性应激所致学习记忆障碍大鼠脑内信号转导通路的影响。
1材料和方法
1.1药品和试剂姜黄素、氟西汀购自美国Sigma 公司。姜黄素用花生油溶解，氟西汀用双蒸水溶解，不同剂量的姜黄素（
2.5、5.0和10 mg/kg）和氟西汀（10 mg/kg）分别口服和腹腔注射21d，末次给药后60min（姜黄素）和30min（氟西汀）开始实验。在预实验中，花生油和双蒸水用作对照组，两种溶液对大鼠行为学结果的影响没有明显差异。因此，正式实验选择花生油作为对照组。兔抗人BDNF 多抗、兔抗大鼠CREB、pCREB多抗、ECL发光底物显色试剂盒均购自美国SantaCruz公司。
1.2主要仪器精密电子天平（FA-1004），上海精科天平厂生产；八臂迷宫；MG-3Y迷宫刺激器（张家港生物医学仪器厂）；EPS601型稳压稳流电泳仪（美国Amersham公司)；DYCZ-24D垂直板电泳槽、DYCP-40C型石墨电极水平电泳槽（北京六一仪器厂）。1.3实验动物成年雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，购自温州医学院动物中心。饲养条件：4只/笼，室温（22±1）℃，湿度50%±10%，自然光照，自由摄食饮水。所有动物于饲养环境中适应7d后开始实验，实验前禁食12～16h，食水自由。随机分为6组（每组8只）：正常对照组、应激模型组、姜黄素组（
2.5、5和10 mg/kg）、氟西汀组（10 mg/kg）。
1.4大鼠慢性应激模型的建立慢性应激时程共计21d，每日1次，时间：上午9:00-下午2:00之
间，应激组每天选取7种刺激中的一种进行刺激：强迫游泳（水温10 ℃）5 min；制动2 h；夹尾（距尾根1 cm）1 min；禁水（水瓶取掉12 h后，放空瓶1 h，之后恢复正常饮水）；禁食（鼠粮取空12 h 后，每笼放3 g鼠粮2 h，之后恢复正常饮食）；足底电击（1 mA，时程1 s，1次/min）30 min；换笼孤养24 h；刺激时间和形式每天随机。每日测定体重，于每天实验前60 min或30 min按体重给予不同剂量的姜黄素（2.5、5、10 mg/kg，p.o.）、花生油或氟西汀（10 mg/kg，i.p.）。第21天进行行为学实验。
1.5Y迷宫实验Y型电迷路三臂（I、I I、I I I）间的夹角为120°，每一臂尺寸30 cm×8 cm×15 cm （长×宽×高），各臂末端均装有信号灯。将大鼠放入迷宫刺激器的一臂，适应环境5 min后给予电刺激（60 V，持续2 s)。其余两臂中的任一臂给予灯光信号，示为安全区。大鼠进入安全区，为正确反应，否则为错误反应。第2次训练以此安全区作为起步区，并使大鼠停留在安全区1 min以巩固记忆。再给予电刺激，以此类推，按方向（I-I I-I I I-I）依次改变安全区位置。开始训练时，小鼠受电击逃离起步区后直接跑向安全区，或跑向非安全区，并在电击作用下最终才跑至安全区（被动回避反应），故会出现错误反应。多次训练后，安全区灯亮，电刺激尚未开始时，小鼠立即逃往安全区，即为形成明暗辨别条件反射（主动回避反应）。测试成绩分为学习成绩和记忆成绩，测试达到连续10次中有9次（9/ 10）正确反应前所需的电击次数即尝试次数表示学习能力[6]；记忆成绩以学习完后再电击10次中正确反应的次数（n/10）为准，于应激前后记录测试成绩。
1.6八臂迷宫实验八臂迷宫中动物通过观察周围一些固定的参照物来学习和记忆自身与饵（置于迷宫臂末端的一颗鼠粮）的相对位置。训练前大鼠先在迷宫中适应2 d，每天1次。每次训练中，八臂中只有四臂放置了饵（分别是1、2、4和7号臂），整个实验过程均维持此顺序。大鼠放在迷宫中央区，此时中央区四周用门关住，15 s后门开放，大鼠可选择进入任意一臂，以摄取饵。大鼠进人有饵的臂且摄取了饵为一次正确选择，进入饵臂而未摄取饵或重新进入放饵臂称为工作记忆错误（working memory error，WME），进入不放饵臂称为参考记忆错误（reference memory error，RME），总记忆错误（TE）记为WME和RME的总和。共训练约l0～l5
次，连续5次训练TE 不超过1，且WME 为0，认为训练成功。1.7
组织蛋白提取与定量
实验结束后，冰上断
头取脑，迅速剥离全脑，分离完整的海马，按照50mg 组织/500μL 裂解液的比例冰浴匀浆组织，裂解30 min 后超声处理溶液10 s，裂解液于4 ℃、13000 r/min 离心20 min。吸取上清，测定蛋白含量。蛋白定量测定应用考马斯亮兰标准定量方法。595 nm下测光密度值。以标准蛋白浓度对光密度值作标准曲线，计算待测样品蛋白浓度1.8
检测指标
Western blot 检测pCREB、BDNF，
操作均严格按说明书和实验室要求进行。胶片扫描
并用Scionimage 4.02 Beta 软件分析。1.9
统计学处理方法
蛋白免疫印迹分析和行为
学成绩均用±s 表示，采用单因素方差分析法，组间差异采用Dunnett’s 检验。2
结果
2.1姜黄素对慢性应激大鼠Y迷宫实验的影响实验结果（见表1）显示，与正常对照组相比，应激模型组大鼠学习所需的尝试次数显著增加（P <0.01），而姜黄素组大鼠学习完成所需训练次数均明显少于
应激模型组（P <0.05，
P <0.01)；停止训练后姜黄素大鼠记忆成绩明显高于应激模型组（P <0.05)。
2.2姜黄素对慢性应激大鼠八臂迷宫实验的影响
表2显示，与正常组相比，应激模型组的TE明显增多（P <0.001)
；2.5 mg/kg 姜黄素组的TE 减少不明显（P >0.05)；10 mg/kg 姜黄素组和氟西汀组的TE 较模型组明显降低（P <0.01)。
2.3姜黄素对慢性应激大鼠海马BDNF表达的影响图1显示，蛋白免疫印迹分析结果显示，慢性应激大鼠海马中BDNF 的表达均明显下降（P <0.01)，姜黄素和氟西汀慢性给药拮抗了慢性应激引起的BDNF 表达的下调（P <0.01)。
2.4姜黄素对慢性应激大鼠海马磷酸化的CREB
（pCREB）水平的影响
图2显示，pCREB 变化明显，
慢性应激大鼠额海马中pCREB的表达水平与正常对照组相比明显下降（P <0.01），而给予10 mg/kg姜黄素后，海马中pCREB的表达水平与应激组比较上升（P <0.01），给予氟西汀组的pCREB 表达水平也显著上调（P <0.01）。
3讨论
随着社会的发展及各方面竞争压力的增加，人
们易产生紧张、抑郁、焦虑等情绪反应。许多资料
表1
各组大鼠Y 迷宫实验的成绩比较（±s ，n =8）
组别正常对照应激模型姜黄素
氟西汀剂量（m g /k g ）2.5510
10
学习成绩
29.33±4.3248.00±4.34
##
44.00±3.8940.17±4.79*39.00±1.26**37.67±7.03**
记忆成绩8.33±1.034.67±1.21##6.00±0.896.33±1.03*6.50±1.05*7.00±0.63**
与正常对照组比：##P <0.01；与应激模型组比：*P <0.05，**P
<0.01
与正常对照组比：##P <0.01；与应激模型组比：*P <0.05，**P <0.01
图1姜黄素对慢性应激大鼠B D N F 在海马中表达的影响（n =6，±s ）
与正常对照组比：##P <0.01；与应激模型组比：*P <0.05，**P <0.01
图2姜黄素对慢性应激大鼠p C R E B 在海马中表达的影响（n =6
，±s ）
表2
各组大鼠八臂迷宫实验的成绩比较（±s ，n =8）
组别正常对照应激模型姜黄素
氟西汀剂量（m g /k g ）
2.5510
10
TE 2.83±0.757.33±2.58##4.83±1.474.50±1.38*4.33±0.82**3.67±0.52**
与正常对照组比：##P <0.01；与应激模型组比：*P <0.05，**P
<0.01
显示长期应激可损害健康，引发疾病；同时影响脑的认知能，包括学习记忆等。目前，应激对脑功能，尤其对学习记忆能力的影响引起了人们极大的关注，并已成为神经科学和心理学领域研究的热点[7]。目前认为，慢性应激减少脑内一些关键神经营养因子的表达，这些神经营养因子对于神经元的发育、分化和存活，以及成熟神经元发挥功能是必需的。BDNF是神经营养因子的一种，有研究报道，它是维持神经元功能和再生修复及防止神经元退行性病变的重要细胞因子[8]。另外其对神经元的可塑性也具有一定的影响[9]。以前的研究证明，慢性应激与BDNF 表达的下调密切相关，幼年期母爱剥夺的大鼠，在成年后其海马BDNF的水平降低[10]。慢性应激导致大鼠海马区BDNF表达明显降低，表现为持续的功能性的BDNF调节缺陷，可能是因为应激状态下，有效的反应能力遭到损害[11]，大鼠海马神经元形态改变和大量丢失、脑内单胺类神经递质含量改变，致其发生抑郁，同时其介导的空间学习记忆功能显著下降[12]。本研究通过蛋白免疫印迹实验发现，慢性应激可引起海马中BDNF的表达减少，而姜黄素慢性给药明显拮抗这种效应。这说明姜黄素能增强抑郁动物的学习记忆能力，其涉及的机制与BDNF的上调有关，影响海马及前脑皮层神经细胞再生及突出可塑性，保护慢性应激引起的海马和前脑皮层神经元的损伤[13]。这一作用与经典药物氟西汀（10 mg/kg，i.p.）相似，提高海马BDNF水平，促神经元再生[14]。应激诱导BDNF下调的确切机制还不清楚，糖皮质激素受体激活后抑制BDNF基因启动子的转录可能起到一定作用，但一些细胞内信号转导通路可能也参与了这一过程。
相关研究表明，cAMP-CREB信号转导与应激诱导的BDNF下调有关，这一信号转导通路在抑郁发病中受损[15]。CREB具有转录激活作用的关键在于其Ser133位点的磷酸化，磷酸化后CREB才能与cAMP 反应元件（CRE）结合，从而诱导基因转录。在实验中发现，慢性应激对海马中总的CREB影响不明显，但pCREB在应激状态下明显减少，说明应激确实影响了CREB的磷酸化；姜黄素可以拮抗应激状态下pCREB的减少。这结果提示慢性应激很可能使脑中cAMP-CREB信号转导通路受损，阻断了CREB的磷酸化，使脑源性神经营养因子BDNF的表达减少，导致学习记忆障碍症状的出现；姜黄素可以逆转慢性应激对大鼠学习记忆的损伤可能与上调cAMP-CREB信号转导通路，从而影响神经元存活及其可塑性机制有关。
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（本文编辑：吴健敏）
姜黄素对慢性应激模型大鼠学习记忆能力的影响
作者：朱洁瑾， 廖守法， 赵乐萍， 都霞， 林蒙蒙， 潘建春， ZHU Jiejin， LIAO Shoufa， ZHAO Leping，DU Xia， LIN Mengmeng， PAN Jianchun
作者单位：朱洁瑾,都霞,林蒙蒙,潘建春,ZHU Jiejin,DU Xia,LIN Mengmeng,PAN Jianchun(温州医学院,药学院,浙江,温州,325035)， 廖守法,LIAO Shoufa(温州光明医院,浙江,温州,325001)， 赵乐萍,ZHAO Leping(温州医学院
附属乐清医院,药剂科,浙江,温州,325600)
刊名：
温州医学院学报
英文刊名：JOURNAL OF WENZHOU MEDICAL COLLEGE
年，卷(期)：2011,41(5)
被引用次数：2次
参考文献(15条)
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2.陈纯白,都霞,赵乐萍,王林,潘建春反式白藜芦醇对卵巢摘除小鼠的抗抑郁作用[期刊论文]-温州医学院学报 2013(03)
引用本文格式：朱洁瑾.廖守法.赵乐萍.都霞.林蒙蒙.潘建春.ZHU Jiejin.LIAO Shoufa.ZHAO Leping.DU Xia.LIN Mengmeng.PAN Jianchun姜黄素对慢性应激模型大鼠学习记忆能力的影响[期刊论文]-温州医学院学报 2011(5)