DNA染色实验

DNA染色实验

1、原理与解析

(1)真核细胞的DNA主要分布在细胞核内，RNA主要分布在细胞质中。

(2)甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿对DNA亲和力强，使DNA 显现出绿色，而吡罗红对RNA的亲和力强，使RNA呈现出红色。用甲基绿、吡罗红的混合染色剂将细胞染色，可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布。(同时甲基绿用二苯胺或龙胆紫代替做平行)

(3)盐酸的作用

①盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂的跨膜运输；

②盐酸使染色体中的DNA与蛋白质分离，便于DNA与染色剂的结合。

注意事项

1.材料的选择

①选用的实验材料既要容易获得，又要便于观察；

②常用的观察材料由人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰，不可使用紫色表皮细胞)

2.取材要点

①取口腔上皮细胞之前，应先漱口，以避免装片中出现太多的杂质；

②取洋葱表皮细胞时，尽量避免材料上带有叶肉组织细胞。

3.冲洗载玻片时水的流速要尽量慢，切忌直接用水龙头冲洗。

4.安全要点

①用酒精灯烘烤载玻片时，不要只集中于材料处，而应将载玻片在火焰上来回移动，使载玻片均匀受热，以免破裂；

②烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中，最好先自然冷却1分钟。

5.换用高倍镜观察材料时，只能用细准焦螺旋进行调焦，切不可动粗准焦螺旋。

主要步骤(以观察口腔上皮细胞为例)

1.取材

①滴：在洁净的载玻片上滴一滴质量分数为0.9%的NaCl溶液；

②刮：用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻地刮几下；

③涂：将牙签上的碎屑涂抹在载玻片的生理盐水中；

④烘：将涂有口腔上皮细胞的载玻片在酒精灯的火焰上烘干。

2.水解

①解：将烘干的载玻片放入装有30ml质量分数为8%的盐酸的小烧杯中，进行材料的水解；

②保：将小烧杯放入装有30℃温水的大烧杯中保温5分钟。

3.冲洗涂片

①冲：用缓缓的蒸馏水冲洗载玻片10秒钟；

②吸：用吸水纸吸去载玻片上的水分。

4.染色

①染：用2滴吡罗红甲基绿混合染色剂滴在载玻片上，染色5分钟；

②吸：吸去多余染色剂；

③盖：盖上盖玻片。

5.观察

①低：在低倍物镜下，寻找染色均匀，色泽浅的区域，移至视野中央，将物像调节清晰；

②高：转到高倍物镜，调节细准焦螺旋，观察细胞核和细胞质的染色情况。

2%甲基绿水溶液的配制

甲基绿（methyl green）蒸馏水加至50mlc 用三氯甲烷抽提，甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面，在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生甲基紫。因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2%甲基绿水溶液20ml 倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷20ml 充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。

英文名称：Methyl Green 分子式：C27H35Cl4N3Zn 分子量：608.78 IUPAC 名称：4-((4-(dimethylamino)phenyl)(4-(dimethyliminio)cyclohexa-2,5-dieny lidene)methyl)-N-ethyl-N,N-dimethylbenzenaminium dichloride compound with zinc(II) chloride 甲基绿是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末。溶于水，显蓝绿色。稍溶于乙醇，不溶于戊醇。盐酸中显红黄色，在氢氧化钠中无色。试剂溶液在可见光区有吸收峰(λmax=633.8nm)。与ReO4-、HgCl42-、BiI4-、AuCl4-和GaCl4-等形成离子缔合物。用于光度法测定Hg2+、ReO4-等，定性检出铁氰化物，酸碱指示剂和细胞染色剂。

甲基绿为碱性染料，它易与聚合程度高的DNA 结合呈现绿色。又称双绿SF 双绿SF。绿色晶体，具金黄色光泽，或淡绿色粉末。溶于水，呈蓝绿色。微溶于乙醇，不溶于乙醚。由氯甲烷与甲基紫(C.I.碱性紫1)反应制得。商品通常为锌复盐C26H33N3Cl2ZnCl2(称C.I.碱性蓝20)。用于细菌染色(新鲜标本细胞核染色)甲基绿-盐酸混合物用于检定精子、淋球菌和肥大细胞染色。甲基绿可用于鉴定DNA。DNA 遇甲基绿（常温）会被染成蓝绿色。甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA 结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA 选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。

甲基绿易与聚合程度高的DNA 结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA 结合呈现红色（但解聚的DNA 也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA 对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA 对甲基绿亲和力大，被染成绿色。

使用配制方法关于吡罗红和甲基绿分装粉的使用方法试剂及配制方法（1）试剂）质量分数为0.9%的NaCl 溶液，质量分数为8%的盐酸，乙酸钠，乙酸，蒸馏水，吡罗红甲基绿混装粉。如果化学试剂商店没有吡罗红甲基绿混装粉，可以分别购买甲基绿和吡罗红G，然后按 A 液的第二种方法配制（见下文）。（2）染色剂的配制）①染色剂 A 液的两种配制方法第一种方法：取吡罗红甲基绿粉 1 g，加入到100 mL 蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。第二种方法：取甲基绿 2 g 溶于98 mL 蒸馏水中，取吡罗红G 5 g 溶于95 mL 蒸馏水中。取 6 mL 甲基绿溶液和 2 mL 吡罗红溶液加入到16 mL 蒸馏水中，即为 A 液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）②染色剂 B 液的配制方法 B 液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解至 1 000 mL 备用；再取乙酸12 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL 备用。取配好的乙酸钠溶液30 mL 和稀释的乙酸20 mL，加蒸馏水50 mL，配成pH 为 4.8 的 B 液（缓冲液）。③染色剂的配制染色剂是由 A 液、B 液混合配制而成的。取 A 液20 mL 和 B 液80 mL 混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现配现用。

实验一-DNA提取

实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

考题- 染色基本知识

第一章染色基本知识 1. 什么叫染色？它的目的和要求是什么？ 2. 物体为什么会有颜色？物体具有颜色的基本条件是什么？ 3. 什么叫染色牢度？常见的染色牢度有哪些？ 4. 什么叫浸染？什么叫轧染？各适用于何种织物的染色？ 第二章染色基本理论 TOP 1. 亲和力和直接性有何不同？ 2. 酸性染料染羊毛或聚酰胺纤维有无饱和值？用什么法其求出它？ 3. 何谓平衡吸附等温线？它分为哪几种类型？有何特点，方程式如何？ 4. 什么叫上染？上染过程分哪几个阶段？它和染色过程是否相同？ 5. 什么叫上染百分率？平衡上染百分率？它们在上染速率曲线上各有何特征？ 6. 染料在纤维中的扩散与染色效果有什么关系？影响扩散速率的因素有哪些？染料的扩散活 化能大小对扩散有什么影响？ 7. 试从染料的扩散速率、扩散活化能以及平衡吸附等方面说明温度对上染的影响。 8. 什么扩散边界层？染色时染液的流动对其有何影响？ 9. 染料在水溶液中有几种存在形式？染色时染料是以何种形式上染色？ 10. 浓度、温度及中性电解质对染料在溶液中的聚集有何影响？ 11. 在一般上染过程中，△H0和△S0为何是负值？根据△H0、△S0和T的关系式，讨论染色温 度T对平衡上染百分率的影响？ 12. 试说明某些酸性染料上染蛋白质纤维时，△S0为正值，即整个染色体系混乱度增加的原 因。 13. 什么叫稳态扩散、非稳态扩散？写出对应的Fick扩散方程式及其物理意义。 14. 什么叫无限染浴、有限染浴？它们在染色过程中各有何特点？ 15. 什么叫半染时间？在不同的染色条件下，其变化和哪些因素有关？ 16. 何谓孔道扩散模型和自由体积扩散模型？根据其基本理论简述纤维微结构的差异对染料扩 散速率的影响。 17. 什么叫初染率、移染性？染料的标准亲和力及染料的扩散性能对其有何影响？ 18. 为获得满意的染色效果，一般可通过哪些工艺条件来控制染料的上染速率。 19. 什么叫泳移、半匀染时间？ 第三章直接染料的染色 TOP 1. 直接染料染色时加入中性电解质的作用是什么？说明其作用原理。 2. 直接染料分为哪几个类型？各类有何特点？分别用什么方法来控制上染过程以纠正染色不 匀的现象。 3. 直接染料为何须进行后处理，常用的固色剂及其固色原理如何？

HE染色原理

苏木精-伊红染色方法 苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色方法，简称HE染色方法，是细胞与组织学最广泛的染色方法。 一、HE染色的基本原理 （一）细胞核染色的原理 细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。 （二）细胞浆染色的原理 细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH 值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染我以，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。（三）、二甲苯的作用

烤片后切片进入二甲苯是脱蜡的作用。组织处理和染色后进入二甲苯是透明作用。组织处理的透明是为了石蜡能进入到细胞中去，染色后透明是为了使细胞的折光率与玻璃相同，以便显微镜观察。（四）、酒精的作用 酒精用于苏木精染色前由高浓度至低浓度是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯。 伊红染色以后的酒精由低浓度至高浓度酒精逐渐过度是为了彻底脱去组织中的水份。 （五）、水洗的作用 在脱蜡经酒精处理之后，水洗切片，是为了苏木精染液能更好的进入细胞核中去，使细胞核染色均匀。 染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染液。 分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。 在伊红染色之后也可以水洗，是为了减少伊红染液进入脱水的酒精中。 （六）分化和蓝化作用 1、分化作用 苏木精染色之后，先用水洗去未结合在切片中的染液。然后用分化液1%盐酸酒精脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附 的染料，这个过程称为染色的分化作用。 2、蓝化作用

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。 洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。 此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。 实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

实验 __DNA的粗提取与鉴定

实验 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使DNA 充分溶解而使杂质沉淀或DNA 沉淀而杂质溶解。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA 对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA 没 有影响）都具有较好的耐性。 4． DNA ＋二苯胺?? →?沸水浴 蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验材料： 鸡血细胞液（5-10ml ），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml 的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l 和0.015mol/l 的氯化钠溶液，二苯胺试剂 实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml 柠檬酸钠100ml 置于500ml 烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清 液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡 血细胞自行沉淀） 活鸡血180ml

[思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速 搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和 其他核物质，如蛋白质 （1）提取鸡血细胞的细胞核物质 原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞 破裂 （2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现 丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液 相当于稀释到0．14mol/L） （4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上 （5）DNA粘稠物再溶解：在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min 使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。 （6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状 物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA鉴定：

实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定 一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 二、实验原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS 或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+]HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺蓝色化合物 在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。 三、实验器材 猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅 四、实验试剂 氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。 五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL 蒸馏水）。 氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。 二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml 分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。 （3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀 （4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h； （4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。 （4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。 （6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。 （13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增 （1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

塑料着色原理

塑料着色原理 塑料着色就是利用加入着色剂对日光的减色混合而使制品着色。亦即通过改变光的吸收和反射而获得不同的颜色，如吸收所有的光时呈现黑色，如果只吸收一部分光(某一波长的光)，并且散射光的数量很小，那么塑料变成有色透明，而形成的颜色取决于反射光的波长；若全部反射则塑料呈白色。如未被吸收的光全部反射，那么塑料则变成“有色不透明”的，其颜色也取决于未被吸收光的波长。反射光表现为实色，散射光则为明色。通常将纯度较好，明度较大的红、黄、蓝三色称为原色，三原色中的任意两种相互调合，可以得到的各种不同颜色称为间色(二次色)，一种原色一种间色调合而成的颜色为再问色(三次色)，每个间色把合成它的二原色以外的原色称为干扰色，在配色时应防止干扰色的引入，否则使原有色光变得暗钝，影响颜色的明亮度。 用于塑料的着色物质有染料或颜料，染料一般能均匀溶于水中或特殊溶液中，或借助于适当化学药品而成可溶物，以达到着色的目的，它不单能使塑料表面着色，而且内部亦被浸入，颜料需调和于展色剂(油或树脂)中制成油墨、油漆等，涂于制品表面使其着色，也可将极细微的颗粒或膏状物等混于塑料内进行内外着色。 一、塑料的染色原理 塑料的染色与塑料的原液着色有很大区别，后者产生的颜色十分单调，不宜小批量多品种加工，尤其是对日用品如钮扣、发夹、玩具、装饰挂件以及机械配件等。塑料染色对色泽要求敏感的加工件无疑十分有用，并且大部分塑料都有染色官能团，可以用相应染料过仃染色而且其染色实际上是一种表面着色。 聚酯塑料的染色是靠温度或载体使结构紧密的聚酯链段出现“空隙”，让疏水性分散染料吸附-扩散-固着在被染基质内部，这种被染基质(固体)吸收的染料(固体)完全是处于溶解状态的。 聚酰胺用分散染料染色机理是依靠末端氨基和酰氨基对染料产生氢键和范德华力结合，上染率不受聚酰胺末端氨基的限制，加之染色时染浴的pH值适应范围较广，所以分散染料对聚酰胺有良好的覆盖性。再从大分子末端含有氨基的羧基看，还有类似羊毛的染色性质，可应用阴离子染料(酸性、直接、活性等染

实验一 DNA提取

实验一DNA的小量制备 小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的： 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理 细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。 关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法： 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。 几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

染色的基本原理

染色得基本原理 就是利用染料在组织切片上给与颜色,使其与组织或细胞内得某种成分发生作用,经过透明后通过光谱吸收与折射,使其各种微细结构能显现不同颜色,这样在显微镜下就可显示出组织细胞得各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色得过程与物理与化学作用两者都有关系。 一、染色得物理现象 1、溶解性: 这种染色最典型得例子就就是脂肪染色,苏丹类染色剂为脂溶性染料,它可以被脂质溶解,使脂质着色,就就是利用染色剂在脂质中得溶解度大于在酒精等溶剂中得溶解度这一特性。因此,当苏丹类得酒精溶液与组织细胞中得脂质接触时,染色剂就从溶液中“转移”到脂质中去,而使脂质着色。 2、吸附作用: 较大物体有从周围介质吸附小颗粒到自身得特性。有些染色则就是染色剂分子通过渗透与毛细管作用而被吸收或沉淀到组织,细胞得小孔中去而着色得。例如活性炭吸附各种分子,甚至胶质与微生物等较大得颗粒一样。 二、染色得化学反应 酸性染料与碱性染料得染色作用常就是对立得,而不就是一致得。任何染料均可电离,离解出阳离子或阴离子。酸性染料中得酸性部分有染色作用得就是阴离子;碱性染料中得碱性部分有染色作用得就是阳离子,细胞内同时含有酸性与碱性物质,酸性物质与碱性染料中得阳离子相结合,如细胞核(含有核酸)黏液与软骨基质呈酸性部分被盐基性染料苏木素所染、反之碱性物质与酸性染料得阴离子相结合,如细胞浆及其内部得某些颗粒物质被酸性染料伊红所染。染料得颜色基不就是在阳离子,就就是在阴离子上,这些离子将因组织反应不同而发生化学结合,如显示含铁血黄素得普鲁士兰反应就是最典型得例子。但就是,大量染色得化学反应并不像铁反应那样明确,实际情况远为复杂。这就是因为蛋白质分子就是个分子量自几万至几百万得大分子,每个分子中含有很多阳离子与阴离子基因,在等电点时能形成游离得两性离子,如: P为蛋白质,就是具有两性得胶体物质。它呈酸性或碱性与环境得PH值有关,如溶液得PH值小于该蛋白质得等电点则此溶液对该种蛋白质即为酸性,蛋白质就带正电,将被酸性染色剂所着色。反之,溶液得PH值大于蛋白质得等电点,则此溶液对该蛋白质来说即为碱性,蛋白质带负电,将被带有阳离子得染色剂所浸染。 在日常工作中,长久固定于甲醛得组织切片,往往染色不良,尤其就是核得着色欠佳。这就是因为固定液甲醛氧化生成甲酸,组织亦随之变为酸性,所以不易被苏木素所着色,补救得办法就是,先用流水冲洗组织块,然后用碱性溶液如稀氨酒精等处理使之中与,恢复正常PH值后再进行染色。 大多数染色得原理至今仍未搞清楚。有些可能就是物理得,有些可能就是化学得,有些

第二章 染色基本理论

第二章染色基本理论 2-1概况 染色理论的研究内容： 1 染色热力学即染料能否对纤维上染； 2 上染可能达到的程度（染色平衡）； 3 染色动力学即染料上染纤维的快慢(上染速率)。 具体包括：染料浓度、浴比、温度、pH、电解质、染色助剂以及染色设备等对平衡上染程度及上染速率的影响。 通过染色理论的研究，对于合理选用染料及助剂、提高染料利用率、提高上染速率、改善匀染性、降低染色成本、减少废水的排放等染色工艺的制定以及设计制造生产效率高的染色设备具有重要指导意义。 2-2 染料的上染过程及特点 上染过程－是指染料舍染液(或其他介质)而向纤维转移并将纤维染透的过程。 上染过程和通常所指的染色过程不尽相同… eg：酸性染料、直接染料、活性染料、还原染料、活性染料… 一上染过程及特点 1 染料从染液向纤维表面扩散 2 染料在边界层中的扩散 3 染料吸附在纤维表面

纤维对染料分子的吸附主要是通过物理吸附及化学吸附等来完成的。 吸附速率受纤维表面的电荷性质、染料的分子结构及所带电荷、染料的溶解性质、亲和性以及染料分子在扩散边界层中的扩散速率等因素的影响。 染液与被染物相对运动的重要性… 扩散模型…吸附模型… 4 纤维表面的染料向纤维内部扩散直至平衡并结合 染料与纤维结合：染料的聚集、吸附、物理结合、化学结合… ＊染料的吸附与解吸 ①两个过程同时进行，不同染色阶段，二者程度不一； ②多数染色过程就是一个上染过程，而有些上染过程后还需经过一些化学处理，染色过程才能完毕；而另一些在上染过程中同时发生与纤维的化学反应。 上染的各个阶段均是可逆的！ [D]f,t / [D]s,t= k吸/ k解= K E = K / (K+L) K为直接性；L为染色浴比；E为平衡上染百分率 浴比L对染料上染百分率具有重要意义！

简单DNA提取实验

实验材料 透明杯子、筷子、盐、洗洁精、冰箱冷藏的白酒、冰块、隐形眼镜护理液、蒸馏水、牙签等 实验步骤 1.获取口腔上皮细胞。含一口蒸馏水，开始漱口，试着用自己的舌头舔口腔内壁，大约2分钟； 2.用透明的杯子收回口腔中的液体； 3.在杯中加入半勺盐，缓慢搅拌10圈，记住动作要慢哦； 4.在杯中加入洗洁精5~6滴，均匀慢速地搅拌3分钟，切记越慢越好； 5.加入5滴隐形眼镜清洗液，继续缓慢搅拌10圈，加入冰块静置5分钟； 6.再次搅拌10圈，从冰箱拿出冷藏的白酒，缓慢倒入杯中，于是酒精便自然分层游离在唾液上方，唾液则沉淀在杯底； 7.由于DNA不溶于酒精，此时在上清下浑的酒精和唾液分层中间，能看到固态絮状的DNA。用筷子轻轻搅拌，将DNA缠绕起来，缓缓拉出水面，就能目睹DNA的真容了。这就是你的DNA哦！ 8.将DNA放入小瓶中，也可加入一些精油或酒精。这样，一条兼具观赏价值与特殊含义的精油项链就做好了。 实验原理：

DNA主要存在于真核生物的细胞核中，动物、植物都属于真核生物。在高温的条件下，DNA会变性(被破坏)，而在常温和低温条件下，则可以保存。由于哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核，因此人类的血液当中含有的DNA是比较少的，如果想要在非实验室环境下提取自己的DNA，建议选择其他容易获得的细胞，比如口腔的上皮细胞等。 下面我们就对具体操作步骤中涉及的原理进行解释 1.获取细胞：用漱口的方式，获取的是口腔的上皮细胞。 2.盐的作用：在漱口时细胞已经破碎，加盐可吸附DNA。带正电的钠离子会和DNA分子中带负电的区域发生反应，可使DNA分子聚到一起。 3.洗洁精的作用：洗洁精中含有十二烷基硫酸钠，它可以破坏细胞膜，这样就可以将细胞内的物质溶解于溶液当中，从而释放DNA，也可用牙膏、洗发香波等来代替。 4.缓慢搅拌：防止用力太大，速度太快会使DNA断裂。 5.隐形眼镜清洗液的作用：去除镜片上的蛋白质，主要是依靠清洗液中含有的蛋白酶，蛋白酶可以分解溶液中的蛋白质。加入隐形眼镜清洗液，其中蛋白酶的成分就可去除溶液中蛋白质的干扰，使DNA 更容易被提取出来，也可用菠萝或嫩肉粉来代替。 6.冰块和冷藏酒：在低温环境下，由于DNA不溶于酒精，因此可以析出DNA。 如果是植物细胞，就先要加洗洁精，然后再加盐。因为植物细胞有细胞壁，清水中不能吸水胀破。所以要先去除细胞壁。另外，在实验室提取DNA的过程中，会进行多次的氯化钠(NaCl)浓度调节，并且

DNA提取实验报告

生物学大实验（二） 实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验 实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生 物学基本技术的理解和掌握。 实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、 磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。 实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的 培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质 粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合 于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对 提取的质粒dna进行电泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的 泳动速度快。 实验步骤： 一质粒扩增 （1）普通lb固体培养基制备： 制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。 （2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分) 二质粒dna的提取(碱法) 1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到 较多的细菌沉淀； 2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。 3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。 4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免 dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。 5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀 地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。 6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10 倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。 7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的 1ml 70％乙醇。 8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。 9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10 、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中 三dna酶切反应 1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入 dna（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶 液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操 作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱 的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）， 37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、每管加入2υl0.1mol/l edta（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。 四 dna的琼脂糖凝胶电泳 1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。

染色基本原理

第二章 染色基本原理 第一节 概述 一、何谓染色？ 染色是指染料舍染液而转移到纤维上，并在纤维上形成均匀、坚牢、鲜艳色泽的加工过程。 举例说明： 二.衡量染色品质量的指标 染料与纤维发生物理化学或化学结合 用化学方法使染料在纤维上生成沉淀 着色机理 染料溶液

第二节 染料在溶液中的存在形式 一、染料的电离 阴离子染料 DM D － (染料母体 )＋ M ＋（伴随的阳离子） 阳离子染料 DX D ＋（染料母体）+ X －（伴随的阴离子） 非离子染料染料 在水中不电离的称为非离子染料，如分散染料。 二、染料的溶解 染料的溶解性与染料的分子结构、温度、所加助剂有关。 （1）染料结构及所含水溶性基团的数目 染料分子量小、结构简单、亲水性基团含量高的溶解性好。 （2）染液的温度 温度高有利于染料的溶解。 （3）与染液中所加助剂有关 尿素及表面活性剂 溶解度增加 中性电解质 溶解度降低 用量多时，染料发生沉淀 （4）与染液的pH 值有关 色泽均匀性 染料在纤维上均匀分布的程度 色泽坚牢度 染料在纤维上固着力和稳定性的大小 色泽中染料光谱色含量的大小 又称匀染性 即染色牢度 饱和度，纯度

例如：冰染料在酸性条件下易溶解，还原染料在碱性条件下易溶解等。 三、染料的聚集 1.染料在溶液中的三种形态 ●离子型染料可以有三种不同形态的存在形式： （1）染料完全离解成正或负离子，如D＋或D－； （2）染料离子聚集成离子胶束，如(nD)n－或(nD)n＋； （3）染料分子聚集成胶核，然后再吸附一部分染料离子形成胶粒，在胶粒外再吸附电荷相反的离子形成胶团，如[m(DA)·nD] n－或[m(DM)·nD] n＋。以D－为例，三种形式呈下列关系。 ?非离子型染料三种不同存在形式： 2.影响聚集的因素： （1）染料分子结构 分子结构较大，分子成线形结构的，染料在溶液中的聚集倾向较大，聚集度较高。 （2）染色温度 提高染色温度，染料聚集度降低。 （3）染料的浓度 一般浓度大的聚集度高。 （4）所加助剂与电解质 ?加入过量食盐，染料聚集度增高，甚至还会发生沉淀。

DNA 提取过程及原理

DNA 提取过程及原理 一、实验原理 从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。 盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于 0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。 分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内，吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外，生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA分子污染。 操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。 提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。 二、仪器设备 高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱 三、试剂 EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2mlβEDTA、0.2% -巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml；β①2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L -巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g ②氯仿:异戊醇(24:1) ③洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml； ④无水乙醇、70%乙醇； ⑤TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0 四、操作步骤 ①将材料在液氮中研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ul b-巯基乙醇，轻轻转动使之混匀； ②样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀；

染色的基本原理

染色的基本原理 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

染色的基本原理 是利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色的过程与物理和化学作用两者都有关系。 一、染色的物理现象 1.溶解性： 这种染色最典型的例子就是脂肪染色，苏丹类染色剂为脂溶性染料，它可以被脂质溶解，使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。因此，当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中去，而使脂质着色。 2.吸附作用： 较大物体有从周围介质吸附小颗粒到自身的特性。有些染色则是染色剂分子通过渗透和毛细管作用而被吸收或沉淀到组织，细胞的小孔中去而

着色的。例如活性炭吸附各种分子，甚至胶质和微生物等较大的颗粒一样。 二、染色的化学反应 酸性染料和碱性染料的染色作用常是对立的，而不是一致的。任何染料均可电离，离解出阳离子或阴离子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子；碱性染料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，细胞内同时含有酸性和碱性物质，酸性物质与碱性染料中的阳离子相结合，如细胞核（含有核酸）黏液和软骨基质呈酸性部分被盐基性染料苏木素所染、反之碱性物质与酸性染料的阴离子相结合，如细胞浆及其内部的某些颗粒物质被酸性染料伊红所染。染料的颜色基不是在阳离子，就是在阴离子上，这些离子将因组织反应不同而发生化学结合，如显示含铁血黄素的普鲁士兰反应是最典型的例子。但是，大量染色的化学反应并不像铁反应那样明确，实际情况远为复杂。这是因为蛋白质分子是个分子量自几万至几百万的大分子，每个分子中含有很多阳离子和阴离子基因，在等电点时能形成游离的两性离子，如： P为蛋白质，是具有两性的胶体物质。它呈酸性或碱性与环境的PH值有关，如溶液的PH值小于该蛋白质的等电点则此溶液对该种蛋白质即为酸性，蛋白质就带正电，将被酸性染色剂所着色。反之，溶液的PH值大于蛋白质的等电点，则此溶液对该蛋白质来说即为碱性,蛋白质带负电，将被带有阳离子的染色剂所浸染? ?? ?。

实验四植物DNA的提取

实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。