沙门氏菌检测
沙门氏菌检测
1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1 冰箱：2℃～5℃。
1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。
1.3 均质器。
1.4 振荡器。
1.5 电子天平：感量0.1g。
1.6 无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。
1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。
1.8 无菌培养皿：直径90mm。
1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。
1.10 无菌毛细管。
1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.12 全自动微生物生化鉴定系统。
2 培养基和试剂
2.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。
2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。
2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。
2.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。
2.5 HE琼脂：见附录中5。
2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。
2.7 沙门氏菌属显色培养基。
2.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。
2.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。
2.10 尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。
2.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。
2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。
2.13 糖发酵管：见附录中12。
2.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。
2.15 半固体琼脂：见附录中14。
2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15。
2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。
2.18 生化鉴定试剂盒。
3 操作方法
3.1 试验前准备
3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。
3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。
3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。
3.2 前增菌
称取25g（ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。
3.3 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于42℃±1℃培养18 h～24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。
3.4 分离
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h
（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。
表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
3.5 生化试验
3.5.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。
3.5.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。
3.5.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
3.5.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
3.5.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
3.5.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据3.5.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
3.6 血清学鉴定
3.6.1 抗原的准备
一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～
0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。
3.6.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
3.6.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同3.6.2。
3.7 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录培养基和试剂
1 缓冲蛋白胨水（BPW）
1.1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠（含12 个结晶水）9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水1000ml
pH 7.2±0.2
1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。
2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
2.1 基础液
蛋白胨10.0g
牛肉膏 5.0g
氯化钠 3.0g
碳酸钙45.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.0±0.2
除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20 min。
2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g
蒸馏水加至100ml
高压灭菌121℃，20 min。
2.3 碘溶液
碘片20.0g
碘化钾25.0 g
蒸馏水加至100 ml
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。
2.4 0.5％煌绿水溶液
煌绿0.5g
蒸馏水100ml
溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。
2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐10.0g
蒸馏水100ml
加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 ℃，20min。
2.6 制法
基础液900ml
硫代硫酸钠溶液100ml
碘溶液20.0ml
煌绿水溶液 2.0ml
牛胆盐溶液50.0ml
临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。
3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖 4.0g
磷酸氢二钠10.0g
亚硒酸氢钠 4.0g
L-胱氨酸0.01g
蒸馏水1000ml
pH 7.0±0.2
3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10ml（称取0.1g L-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。
4 亚硫酸铋（BS）琼脂
4.1 成分
蛋白胨10.0g
牛肉膏 5.0g
葡萄糖 5.0g
硫酸亚铁0.3g
磷酸氢二钠 4.0g
煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml
柠檬酸铋铵 2.0g
亚硫酸钠 6.0g
琼脂18.0g～20g
蒸馏水1000ml
pH 7.5±0.2
4.2 制法
将前三种成分加入300 ml 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和
30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。
5 HE琼脂（Hektoen Enteric Agar）
5.1 成分
蛋白胨12.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水杨素 2 .0g
胆盐20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂18.0g～20.0g
蒸馏水 1 000ml
0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0ml
Andrade 指示剂20.0ml
甲液20.0ml
乙液20.0ml
pH 7.5±0.2
5.2 制法
将前面七种成分溶解于400 ml 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 ml
蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃～55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠34.0g
柠檬酸铁铵 4.0g
蒸馏水100ml
③乙液的配制
去氧胆酸钠10.0g
蒸馏水100ml
④Andrade指示剂
酸性复红0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液16.0ml
蒸馏水100ml
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml～2ml。
6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂
6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-赖氨酸 5.0g
木糖 3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
去氧胆酸钠 2.5g
柠檬酸铁铵0.8g
硫代硫酸钠 6.8g
氯化钠 5.0g
琼脂15.0g
酚红0.08g
蒸馏水 1 000ml
pH 7.4±0.2
6.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。
7 三糖铁（TSI）琼脂
7.1 成分
蛋白胨20.0g
牛肉膏 5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵（含6 个结晶水）0.2g
酚红0.025g或5.0 g/L溶液5.0ml
氯化钠 5.0g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂12.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.4±0.2
7.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2ml～4ml，高压灭菌121℃10 min 或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。
8 蛋白胨水、靛基质试剂
8.1 蛋白胨水
蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g
氯化钠 5.0g
蒸馏水1000ml
pH 7.4±0.2
将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。
8.2 靛基质试剂
8.2.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。
8.2.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95％乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20ml。
8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约
0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
9 尿素琼脂（pH 7.2）
9.1 成分
蛋白胨 1.0g
氯化钠 5.0g
葡萄糖 1.0g
磷酸二氢钾 2.0g
0.4％酚红 3.0ml
琼脂20.0g
蒸馏水1000ml
20%尿素溶液100ml
pH 7.2±0.2
9.2 制法
除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 ml 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121℃高压灭菌15min。冷至50℃～55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2％。分装于无菌试管内，放成斜面备用。
9.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
10 氰化钾（KCN）培养基
10.1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸二氢钾0.225g
磷酸氢二钠 5.64g
蒸馏水1000ml
0.5％氰化钾20.0ml
10.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌
15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100ml 培养基加入0.5％氰化钾溶液2.0ml （最后浓度为1:10000），分装于无菌试管内,每管约4ml,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1 d～2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。
11 赖氨酸脱羧酶试验培养基
11.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
蒸馏水1000ml
1.6％溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0ml
L-赖氨酸或DL-赖氨酸0.5g/100ml 或1.0g/100ml
pH 6.8±0.2
11.2 制法
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5％加入，DL-赖氨酸按1％加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。
11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养18h～24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
12 糖发酵管
12.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠 3.0g
磷酸氢二钠（含12个结晶水） 2.0g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.0ml
蒸馏水1000ml
pH 7.4±0.2
12.2 制法
12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养,一般2d～3d。迟缓反应需观察14d～30d。
13 ONPG 培养基
13.1 成分
邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10.0ml
1％蛋白胨水（pH7.5）30.0ml
13.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，用橡皮塞塞紧。
13.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1 满环接种于36℃±1℃培养1h～3h 和24h 观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h 变黄色，如无此酶则24h不变色。
14 半固体琼脂
14.1 成分
牛肉膏0.3g
蛋白胨 1.0g
氯化钠0.5g
琼脂0.35g～0.4g
蒸馏水100ml
pH 7.4±0.2
14.2 制法
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
15 丙二酸钠培养基
15.1 成分
酵母浸膏 1.0g
硫酸铵 2.0g
磷酸氢二钾0.6g
磷酸二氢钾0.4g
氯化钠 2.0g
丙二酸钠 3.0g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.0ml
蒸馏水1000ml
pH 6.8±0.2
15.2 制法
除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。
15.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。
沙门氏菌快速检测方法
沙门氏菌快速检测方法 1试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3所用试剂和培养基 1.3.1缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15min，冷至常温。 1.3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1配制BPW培养基（第一天） 2.2培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟,关灯60min 后使用。（第一天） 2.3预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4配制TTB增菌液（第一天） 2.5增菌（第二天） 2.5.1接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mLTTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。 2.5.2培养现象 菌名菌号生长状况 TTB培养特征 静置后浑浊CMCC(B)50071 伤寒沙门氏菌良好 静置后浑浊良好鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115 静置后清亮不生长大肠埃希氏菌 ATCC25922
沙门氏菌检验
沙门氏菌的检验 1．目的 规范沙门氏菌检测方法，使产品检验有据可依。 2．消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃仪器、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 注：本实验采用湿热灭菌法，吸管、培养皿、培养基等盖好塞子并包好瓶口在高压灭菌锅中按要求的温度和压力灭菌，一般是121℃（）下灭菌20min。 3．原理 沙门氏菌的检验分四个连续阶段： 4．操作步骤 准备工作 配制实验所需的缓冲蛋白胨水、亚硒酸盐胱氨酸培养基（无需灭菌）、HE培养基、三糖铁培养基等，并将准备好的均质杯、吸管、培养皿、大试管等一起灭菌。 前增菌 在无菌环境下，称取25g待检样品放入盛有225ml灭菌好的缓冲蛋白胨水中，然后放到36±1℃的恒温培养箱内进行前增菌4-6h; 增菌 在无菌环境下，用灭菌好的吸管吸取10ml前增菌液接种与100ml亚硒酸盐胱氨酸培养基中进行二次增菌，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 分离培养 将增菌培养液摇匀，以无菌操作，用直径3mm的接种环挑取一环，划线于表面无凝结水的BS和SS琼脂平板各一个，于36±1℃培养18-24h。观察各个平板上有无典型或可疑沙门氏菌属的菌落。如无典型或可疑菌落，应再继续培养24±2h。然后观察培养的平板（黄色的菌落是大肠杆菌；蓝绿色或蓝色，产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色为可疑沙门氏菌）。 沙门氏菌属各亚属在其他选择性琼脂平板的菌落特征 生化实验 用灭菌好的接种针在培养平板上挑取可疑的沙门氏菌单菌落，接种到三糖铁培养基上，恒温培养箱36±1℃，培养18-24h; 典型沙门氏菌培养物斜面显红色（碱性），底端显黄色（酸性），有气体产生，形成硫化氢（琼脂变黑）。 三糖铁培养基变化表 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 食品学院14食品质量与安全1班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 2 2 2 2 摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。 关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定 前言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1仪器设备 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头
电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 1.1.2试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 1.1.3培养基 蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基 1.2 实验方法 1.2.1培养基的制备 1.2.1.1培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml 基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml 1.2.1.2配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 1.2.2 沙门氏菌群检测 1.2.2.1沙门氏菌检测程序
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 食品学院 14食品质量与安全1班 刘文敏柳基炜卫杰恒温紫君 2 2 2 2 摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。 关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定 前言 沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界范围内的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1仪器设备 均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃ 吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头
电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂 1.1.2试剂药品 鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 1.1.3培养基 蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基 1.2 实验方法 1.2.1培养基的制备 1.2.1.1培养基的配制步骤 蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。分装10瓶，每瓶90ml 四硫磺酸钠煌绿（TTB）：高压灭菌 121 ℃，15 min灭菌冷却后至30℃，每100ml基础培养液加碘液2ml，煌绿液1ml 1.2.1.2配制培养基的注意事项 （1)按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末； （2）加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量； （3）往试管中放小导管时，注意处理气泡。 1.2.2 沙门氏菌群检测 1.2.2.1沙门氏菌检测程序
沙门氏菌检测方法的研究进展
沙门氏菌检测方法的研究进展 摘要：沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，而且，沙门氏菌的检验在食品检测中具有重要意义。建立一种快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。本文通过查阅大量文献，详细阐明了沙门氏菌的各种快速检测方法的原理，对近年来沙门氏菌的检测进展进行了综述。认为，传统方法可以对沙门氏菌做出鉴定，但需要4~7 d的时间；以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，且灵敏性高和特异性强；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于沙门氏菌检测。但是这些方法仍然存在一定的不足，需要进一步加以改进，关于食品中沙门氏菌的检测方法的研究还有待进一步深入。 关键词：沙门氏菌；检测；传统方法；免疫；分子
前言 沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病之一，沙门氏菌属于肠杆菌科细菌，由此类细菌引起的各种动物的疾病称为沙门氏菌病。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性，属于偏嗜性沙门氏菌，绝大多数对人和动物均适应，可寄居在哺乳类、爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中，种类繁多的家养和野生动物的感染率在1%—20%或者更高。故各种家禽、家畜在喂养、屠宰、运输、包装等加工处理过程中均有污染的机会。各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。除初生动物，人畜感染后一般呈无症状带菌状态,长期排菌，污染肉蛋产品，同时它们也可表现为有临床症状的致死疾病，可能加重病情或者增加死亡率，或者降低动物生产力等，对养殖业的经济效益影响较大，并严重影响人类健康。近年来，随着免疫学实验技术和分子生物学技术的发展，沙门氏菌检验技术的研究也有了新的研究进展。本文将近年来国内外关于沙门氏菌检验技术研究进展情况作以概述，供参考。 1 传统的检测方法（国标法） 常规检验技术基本特征与步骤:沙门氏菌常规检验技术具有以下3项特征：常规方法是编入国标方法或国际方法中的基本方法，是检验其他检测方法准确性、敏感性的参照；常规方法最终将能分离到细菌纯培养物；常规方法简单、准确、可重复性强、有一定的灵敏性。随着经济和技术的发展以及研究的深入，标准方法也处于不断进步，不断更新中。 常规检验包括以下5个基本步骤：前增菌和增菌；分离纯培养物；属和种的鉴定；血清学分型；菌型的判定和结果报告。在具体实践中用此方法检测畜产品中的沙门氏菌时，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。 虽然该方法鉴定结果准确可靠，但由于沙门氏菌血清型繁多，生化特性各异，检验程序复杂，耗时长，至少需要4~7d才可得到准确的检测结果[1,2]。 2 免疫学标记检测方法 免疫标记技术就是将已知抗体或者抗原上标记上易显示的物质(标记分子)，通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接检测出微量的抗原或者抗体。 所谓的标记分子是那些即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出来，高敏感性的标记分子主要有突光素、酶、放射性同位素3种。免疫标记技术不仅大大提高了试验的敏感性，和光镜或电镜技术结合后，能对待检物质做精细定位，为临床研究和诊断提供了极大的方便。由此建立的沙门氏菌免疫学检测方法有多种，包括免疫酶标记技术，使用较多的如酶
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验 2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A 中A.1。 3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A 中A.2。 3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A 中A.3。 3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A 中A.4。 3.5 HE 琼脂：见附录A 中A.5。 3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A 中A.6。 3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录A 中A.7。 3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A 中A.8。 3.10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录A 中A.9。 3.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录A 中A.10。 3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A 中A.11。 3.13 糖发酵管：见附录A 中A.12。 3.14 邻硝基酚β-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A 中A.13。 3.15 半固体琼脂：见附录A 中A.14。 3.16 丙二酸钠培养基：见附录A 中A.15。 1 前增菌 称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～ 2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。 2 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 ℃±1 ℃培养18 h～24h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC 内，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 3 分离 分别用接种环取增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36 ℃±1 ℃分别培养18 h～24 h （XLD 琼脂平板、
沙门氏菌检测的基准方法(20210201165718)
沙门氏菌检测的基准方法 内容 1 范围 2 参考标准 3 定义 4 原理 4.1 概要 4.2 前增菌——非选择性液体培养基 4.3 增菌——选择性液体培养基 4.4 划平板和鉴定 4.5 确认 5 培养基、试剂和血清 5.1 概要 5.2 培养基和试剂 5.3 血清 6 设备和玻璃器皿 7 采样 8 检验样品的制备 9 程序 9.1 试验样品和原始悬浮液 9.2 非选择性前增菌 9.3 选择性增菌 9.4 划平板和鉴定 9.5 确认 10 结果表示 11 检验报告 12 质量保证附录A （标准化）程序图表 附录B （标准化）培养基和试剂的成份及准备附录C （非标准化）实验室间试验结果参考书目 、尸、- 前言 ISO （国际标准化组织）是国际标准化团体的全世界同盟。通常由ISO技术委员会来执行国际标准的制订工作（ISO成员体）。通常由ISO技术委员会来完成国际标准的准备工作。在委员会中，若对建立的技术委员会有兴趣的话，每个成员体有权作为代表。国际组织、政府或非政府组织，通过ISO联系，也可以参加这项工作。在所有电工标准方面，ISO与国际电工委员会（IEC）紧密合作。 国际标准按照ISO/IEC 指南第三章所列的规则草拟。 技术委员会的主要任务是准备国际标准。被技术委员会采用的国际标准草案以投票方式在成员体内运行。至少要75%成员体的投票赞成，才能作为一个国际标准发布。 要引起注意的可能性是:本国际标准的一些要素可能是专利权主体。ISO 不应承担鉴定部分或全部的这种专利权。 ISO6579是由食品ISO/TC34技术委员会、微生物SC9分委员会所准备的。第四版删除或更换了第三版(ISO6579: 1993),并已作了技术性修订。附录A和附录B形成了本
沙门氏菌快速检测方法
沙门氏菌快速检测方法文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
沙门氏菌快速检测方法 1 试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3 所用试剂和培养基 1.3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15 min，冷至常温。1.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1 配制BPW培养基（第一天） 2.2 培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟, 关灯60 min后使用。（第一天） 2.3 预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm 下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4 配制TTB增菌液（第一天） 2.5 增菌（第二天） 2.5.1 接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1mL，转种于9mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。
2.5.2 2.6 配制沙门氏菌显色培养基平板（第二天） 2.6.1 取瓶内干粉4.75g，用100mL蒸馏水溶解，可按比例扩大或者缩小。 2.6.2 混合加热至100℃，搅拌加热至完全溶解，冷却至50℃倒平板。 2.6.3 样品用画线或者涂布法接种，37℃培养24小时。 2.6.3 观察菌落颜色：（第三天）
沙门氏菌基本知识及检测方法
沙门氏菌基本知识及检测方法 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有2000多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属Salmonella 。本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。 根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(甲型、乙型、丙型)。第二类群：能引起人类食物中毒——食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。 一、沙门氏菌属的生物学特征： 1.形态染色特性：G-无芽孢杆菌。大小通常为 0.7～1.5μm × 2.0～5.0μm，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。需氧或兼性厌氧菌，生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃，适宜pH为6.8～7.8，对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛，胆盐可促进其生长。 2.培养特性：需氧或兼性厌氧菌；生长温度范围为10～42℃，最适生长温度为37℃；适宜pH为6.8～7.8；对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛；胆盐可促进其生长。 §普通琼脂：圆形、光滑、无色半透明、边缘整齐或不太整齐的中等大小(2 ～ 4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。§麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂(EMB)：菌落无色半透明
沙门氏菌检验标准操作规程
1目的P URPOSE 规范888物料、产品的沙门氏菌检验操作，确保检验结果的可靠性。 2范围SCOPE 适用于888物料、产品的沙门氏菌检验工作。 3责任RESPONSIBILITY 微生物检验员严格执行本规程，品质部负责人监督执行。 4程序PROCEDURE 定义和原理 沙门氏菌广泛存在于动物的肠道和内脏，以及被粪便污染的水和土壤中，是细菌性食物中毒的主要病因。本方法利用沙门氏菌呈辛酸酯酶阳性，而氧化酶和脂肪酶均呈阴性的特性，对物料、产品进行沙门氏菌检验。 材料和设备 紫外灯：波长366nm，功率不小于6W。 放大镜：3至4倍。 毛细滴管。 LX-B35L压力蒸汽灭菌锅。 无菌的培养皿。 无菌的接种环。 培养基和试剂 SCDLP液体培养基：按《化妆品卫生规范》（2007版）或使用商品培养基干粉配制。 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：按—2010附录配制或使用商品试剂。 SS琼脂培养基（含1%蔗糖）：牛肉浸膏(或牛肉粉)，蛋白胨，乳糖，蔗糖，胆盐，柠檬酸钠，硫代硫酸钠，柠檬酸铁，煌绿，中性红，琼脂，蒸馏水1000mL。 HE琼脂培养基：按—2010附录或使用商品培养基干粉配制。 玉米油维多利亚蓝琼脂培养基：灭菌后的基础培养基冷却至50℃左右，边摇边加入玉米油乳化液。倾注平皿，制成平板。基础培养基及玉米油乳化液配方如下： a）基础培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，氯化钠5g，琼脂13g，水900mL，。将 各成分加入水中，加热溶解。调节，116℃15min高压灭菌。 b）玉米油乳化液：玉米油100mL，%维多利亚蓝水溶液100mL，%琼脂溶液80mL， 吐温801mL。玉米油加维多利亚蓝水溶液混合，边振动边在沸水中加热溶化。然后， 放入分液漏斗中，弃去蓝色水部分，再将着色的脂肪用水洗1-2次。将着色脂肪20mL 加入810mL琼脂溶液中，再加1mL吐温80，116℃15min高压灭菌。冷却后用超声 波乳化。
沙门氏菌检测方法
沙门氏菌快速检测方法 1 试剂与仪器 1.1所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针 1.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 1.3 所用试剂和培养基 1.3.1缓冲蛋白胨水（BPW）培养基 称取BPW培养基20.1g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，以90mL/瓶分装到各锥形瓶，并于121℃灭菌15 min，冷至常温。 1.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 取TTB增菌液基础93.6g，加入蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于锥形瓶中，每瓶100mL。 将锥形瓶放入灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷至30℃，每100mL基础培养基中加入TTB配套试剂碘液和煌绿各一支（开启前用75%酒精棉消毒西林瓶表面），混合均匀。 2、操作步骤 2.1 配制BPW培养基（第一天） 2.2培养基冷却至室温后，对培养基和整个房间进行紫外灭菌15分钟, 关灯60 min后使用。（第一天） 2.3 预增菌（第一天） 称量样品10g至含BPW培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡10min，于36℃±1℃培养18h左右。 2.4配制TTB增菌液（第一天） 2.5增菌（第二天） 2.5.1接种和培养 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于9mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。 2.5.2
2.6配制沙门氏菌显色培养基平板（第二天） 2.6.1 取瓶内干粉4.75g，用100mL蒸馏水溶解，可按比例扩大或者缩小。 2.6.2 混合加热至100℃，搅拌加热至完全溶解，冷却至50℃倒平板。2.6.3 样品用画线或者涂布法接种，37℃培养24小时。
沙门氏菌检验方法
沙门氏菌检验方法 关于GB 4789.04-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验解决方案 GB 4789.04-2010 沙门氏菌检验流程图 环凯针对标准的修改，扩充完善了微生物检测试剂，推出了成套的沙门氏菌检验解决方案，为生产企业提供方便。 功能阶段实验 序号 产品编号产品名称规格类别 前增菌1023130缓冲蛋白胨水（B PW）250g瓶（干粉）
CP0680缓冲蛋白胨水（B PW）225 mL×10袋盒（袋装）CP0290缓冲蛋白胨水（B PW）225 mL×6瓶盒（瓶装）CP0560A缓冲蛋白胨水（B PW）9 ml×20支盒（管装） 选择性增菌2 023030四硫磺酸钠煌绿增菌液基础（TTB）250g瓶（干粉）SR0040 四硫磺酸钠煌绿增菌液配套试剂 （碘液、煌绿各一支添加于100ml培养基） 2×5支/盒盒（西林瓶）CP0300四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）10 ml×20支盒（管装）3 023040亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）250g瓶（干粉）CP0050亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）10 ml×20支盒（管装） 选择性分离4023050亚硫酸铋琼脂（BS）（配送指示剂）250g瓶（干粉）5 023070HE琼脂培养基250g瓶（干粉）CP0110HE琼脂培养基90mm×20盒（平板） 6 029999木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD）250g瓶（干粉）029999P木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD） 300 mL/袋 ×10袋 盒（袋装） 颗粒培养基CP0180木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂（XLD）90mm×20盒（平板）7 CRM004沙门氏菌显色培养基1000 mL瓶（干粉）CP0560A沙门氏菌显色培养基平板90mm×20盒（平板）8HM42沙门氏菌乳胶凝集试剂盒50 tests套 生理生化 9 022080三糖铁琼脂（TSI）250g瓶（干粉）CP0080三糖铁斜面20支盒（管装）075750三糖铁20支盒（西林瓶） 10 022110蛋白胨水 (靛基质培养基，色氨酸肉汤)100g瓶（干粉）075240蛋白胨水 (靛基质培养基，色氨酸肉汤)20支盒（西林瓶）029230靛基质试剂10 mL×1支盒 11 023090尿素琼脂培养基基础100g瓶（干粉）02910040%无菌尿素溶液 2 mL×10支盒（西林瓶）075150尿素琼脂培养基20支盒（西林瓶）12 075330氰化钾生长实验管20支盒（西林瓶）075340氰化钾对照管20支盒（西林瓶）13 075280赖氨酸脱羧酶培养基20支盒（西林瓶）075290氨基酸脱羧酶对照培养基20支盒（西林瓶）029110无菌石蜡油10 mL×1支瓶14075090山梨醇20支盒（西林瓶）15075040甘露醇20支盒（西林瓶）16075180β-半乳糖苷 ONPG20支盒（西林瓶）17071740沙门氏菌生化鉴定试剂盒10种×10支盒（西林瓶）18075100卫矛醇20支盒（西林瓶）19075140水杨素20支盒（西林瓶）20075190丙二酸盐20支盒（西林瓶）
沙门氏菌检验
沙门氏菌检验 范围1.本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2.设备和材料 处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。 2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 2.3均质器。 2.4振荡器。 2.5电子天平：感量0.1g。 2.6无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。 2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌培养皿：直径90mm。 2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10无菌毛细管。 2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.12全自动微生物生化鉴定系统。 3.培养基和试剂 3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。 ）增菌液。TTB四硫磺酸钠煌绿（3.2．
3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5HE琼脂。 3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7沙门氏菌属显色培养基。 3.8三糖铁（TSI）琼脂。 3.9蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10尿素琼脂（pH7.2）。 3.11氰化钾（KCN）培养基。 3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13糖发酵管。 3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15半固体琼脂。 3.16丙二酸钠培养基。 3.17沙门氏菌O和H诊断血清。 3.18生化鉴定试剂盒。 4.检验程序 沙门氏菌检验程序见图1。
检样36℃±1℃，18h～ 24h 25g（mL）样品36℃±1～℃，℃±42118h24h ℃，18h～24h 1mL+SC10mL 1mL+TTB10mL 36℃±1℃，40h～48h 36℃±1℃，18h～24h 1沙门氏菌检验程序图操作步骤5. 前增菌5.1称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min 均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。
沙门氏菌检测
沙门氏菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 1.3 均质器。 1.4 振荡器。 1.5 电子天平：感量0.1g。 1.6 无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。 1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。 1.8 无菌培养皿：直径90mm。 1.9 无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 1.10 无菌毛细管。 1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 1.12 全自动微生物生化鉴定系统。 2 培养基和试剂 2.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。 2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。 2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。 2.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。 2.5 HE琼脂：见附录中5。 2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。 2.7 沙门氏菌属显色培养基。 2.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。 2.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。 2.10 尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。 2.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。 2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。
2.13 糖发酵管：见附录中12。 2.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。 2.15 半固体琼脂：见附录中14。 2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15。 2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。 2.18 生化鉴定试剂盒。 3 操作方法 3.1 试验前准备 3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 前增菌 称取25g（ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8 h～18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。 3.3 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于42℃±1℃培养18 h～24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 3.4 分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h
沙门氏菌快速检测技术
沙门氏菌快速检测技术研究进展 摘要：沙门氏菌是食品中最常见的致病菌，是导致食物中毒的重要病原菌之一，严重危害人类的健康安全和食品安全。传统的细菌学检测耗时繁琐，不能满足当今发展的需求。本文简要介绍了近年来沙门氏菌快速检测技术研究进展，并分析各种检测方法的优缺点，以期寻找一种快速、简便、特异、灵敏，能检测绝大多数血清型沙门氏菌的方法。 关键词：沙门氏菌；快速检测、免疫学技术、分子生物学技术 Research Progress on the Rapid Detection of Salmonella Zhao Hui (College of Food Science and Engineering , Northwest A&F University , Yangling, Shaanxi 712100, China) Abstract：Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about hazard on human , The traditional bacteriology detections have not bee satisfied the requirement of development because of time -consuming. This review briefly introduced research progress of the rapid detection of Salmonella in recent years and analyzed the advantages and disadvantages of various detection methods，hoping to find a fast，simple，specific and sensitive method that could detect the majority serotypes of Salmonella． Keywords:salmonella；rapid detection；immunological techniques；molecular biological techniques 随着国民经济的发展，食品、海产品中存在的卫生隐患问题愈发严重，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2 位，在中国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒事件占到全部食物中毒事件的40% -60%[1]。沙门氏菌是常见的重要食源性致病菌，它们广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖等区域，寄生在海洋生物体中，通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒，严重危害人体健康。目前我国食品中致病菌的检验普遍采用传统的细菌学检验方法和血清学方法，这些方法一般都复杂繁琐、耗时费力，大致需要4 d~6 d 才能出检验结果，难以应对突发事件的发生。因此，建立一些快速、简便、准确度高的检测方法一直是沙门氏菌检测研究的核心问题。随着生物技术的进步，在食源性致病菌检测领域出现了许多比传统方法更快捷、敏感性更好的新技术，如免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。本文总结了一些食品中沙门氏菌的快速检测方法，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，以期加快检测工作的进行[2]。 1 免疫学检测技术 在所有食品中的沙门氏菌的检测技术手段中，免疫学检测技术占有重要的地位，主要是因为其价格低廉，不需要特定的实验仪器，容易在基层推广开来。免疫学技术以抗原和抗体的特异性结合
沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测
沙门氏菌的鉴定与PCR快速检测 摘要：沙门氏菌是一种常见的重要的人畜共患病原菌，不仅能引起各种动物的沙门氏菌病，而且与人类多种疾病有关，在世界各地的食物中毒病例中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门氏菌在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要的意义。本实验通过SS培养基的培养以及革兰氏染色检测鉴定和纯化菌株，并选用操作简便、快速、费用低廉的热裂解法来获得细菌基因组DNA，同时对热裂解的时间进行了比较实验，以及对PCR检测的敏感性和所用引物的特异性进行了试验。结果表明，所培养的菌确为沙门氏菌；菌体煮沸时间2min即可得到比较好的PCR效果；通过PCR能检测出129 pg的沙门氏菌DNA。所设计的引物对沙门氏菌属有比较好的特异性。关键词：沙门氏菌；PCR；快速检验 Identification and Rapid Detection of Polymerase Chain Reaction of Salmonella Abstract: The strain was identified and purified by cultivation with SS media and Gram’s stain. The pyrolysis method was selected to obtain the genome DNA of Salmonella. Comparison of pyrolysis time, the sensitivity of PCR to the template DNA and the specificity of primer were studied. The results showed that the culture was absolute specific Salmonella. The better effectiveness of PCR was obtained when the mycelium of Salmonella was boiled for 2min. 129 pg DNA of Samonella would be able to detect by PCR. The primer used in this experiment was specific to Salmonella. Key words : Salmonella；PCR；rapid detection 1 前言 1.1 细菌性食物中毒严重威胁人类健康 “民以食为天，食以安为本”。然而，近年来世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生，食源性疾病的发生率均居高不下。全球每年发生40－60亿例食源性腹泻，发展中国家每年有180万人口死于食源性腹泻；即使是在工业化国家，亦有30%以上人群患食源性病症[1]。在我国，微生物污染食品是最重要的卫生问题之一，它所引发的细菌性食物中毒是所有食物中毒中最普遍、最具爆发性的一种食物感染[2]。由于缺乏快速诊断及溯源技术，食源性疾病漏报率极高。据WHO估计，发展中国家食源性疾病漏报率高达95%以上，我国目前掌握的食物中毒数据也可能仅为我国实际发生的食源性疾病的“冰山一角”[1]。可引起食物中毒的细菌有沙门氏菌（Samonella.spp）、志贺氏菌（Shigela.spp）、金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特杆菌（Listeria monocytogenes）、肉毒杆菌（Clostridium botulinum）等等。
沙门氏菌检验
沙门氏菌检验1.范围 本法适用于食品中沙门氏菌的检验。 2.设备和材料 处微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。 2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 2.3均质器。 2.4振荡器。 2.5电子天平：感量0.1g。 2.6无菌锥形瓶：容量500mL，250mL。 2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌培养皿：直径90mm。 2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10无菌毛细管。 2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.12全自动微生物生化鉴定系统。 3.培养基和试剂 3.1缓冲蛋白胨水（BPW）。 3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。
3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。 3.4亚硫酸铋（BS）琼脂。 3.5HE琼脂。 3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。 3.7沙门氏菌属显色培养基。 3.8三糖铁（TSI）琼脂。 3.9蛋白胨水、靛基质试剂。 3.10尿素琼脂（pH7.2）。 3.11氰化钾（KCN）培养基。 3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。 3.13糖发酵管。 3.14邻硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG）培养基。 3.15半固体琼脂。 3.16丙二酸钠培养基。 3.17沙门氏菌O和H诊断血清。 3.18生化鉴定试剂盒。 4.检验程序 沙门氏菌检验程序见图1。 42℃±1℃，18h～24h
36℃±1℃，40h～48h 36℃±1℃，18h～24h 图1沙门氏菌检验程序 5.操作步骤 5.1前增菌 称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2.无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。 如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。 5.2增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。 5.3分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。与36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD平板、HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。