(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910293456.4
(22)申请日 2019.04.12
(71)申请人 长沙市惠瑞生物科技有限公司
地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区隆平高
科技园雄天路1号湖南金丹科技创业
大厦B栋第5层505号房
(72)发明人 王中华
(74)专利代理机构 长沙中海宏图专利代理事务
所(普通合伙) 43224
代理人 罗霞
(51)Int.Cl.
C12P 7/22(2006.01)
C07C 37/68(2006.01)
C07C 37/72(2006.01)
C07C 39/21(2006.01)
A01H 4/00(2006.01)A01G 22/25(2018.01)A01C 21/00(2006.01)
(54)发明名称
一种白藜芦醇的提取方法
(57)摘要
本发明涉及一种白藜芦醇的提取方法,其包
括以下步骤:1)粉碎;2)煎煮;3)接种发酵;4)酶
解;5)萃取;6)脱色干燥。本发明选用高白藜芦醇
含量的虎杖为提取原料,从源头上提高白藜芦醇
的提取率;提取方法上,釆用微生物发酵+酶解
+超声波萃取相结合的技术,最大限度地保持白
藜芦醇的生物活性,并使天然白藜芦醇(98%)的
得率达到了1.8%以上,并且基本实现了三废零排
放,
有效保护了生态环境。权利要求书1页 说明书6页CN 110066834 A 2019.07.30
C N 110066834
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110066834 A
1.一种白藜芦醇的提取方法,其特征在于包括以下步骤:
1)粉碎:选择高白藜芦醇含量的虎杖为原料,经破碎后其颗粒在0.5cm以下,再经超微粒化球磨成300目左右;
2)煎煮:加水煎煮60分钟,冷却到35℃-40℃;
3)接种发酵:接种复合菌种母液,混合均匀,密封,恒温发酵24-48h;
4)酶解:先加入5‰的仿人胃消化液,消化8-12h,加热至100℃约30-60min;再调ph值为6.5-8,然后加入5‰仿人肠消化液,消化8-12h,加热至100℃约30-60min;
5)萃取:粗滤,滤液通过超声波和加有机溶剂萃取;
6)脱色干燥:萃取液经膜分离后再上柱脫色,浓缩比重为1.2-1.25,啧雾干燥即得白藜芦醇粉。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的高白藜芦醇含量的虎杖为白藜芦醇含量在1%以上的虎杖原料。
3.根据权利要求1或2所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的高白藜芦醇含量虎杖由以下方法培育:
1)虎杖繁育培植:选择白藜芦醇含量高的野生虎杖,进行植物培育,育种挑选出白藜芦醇含量在0.9%以上的虎杖种株进行扩大栽培;
2)虎杖栽培施肥:虎杖栽培管理期间,使用专用农肥,该专用农肥是以虎杖提取加工后的废渣60-70%,配合人工合成白藜芦醇生产废渣废水30-40%,接种微生物发酵后加工而成。
4.根据权利要求3所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的植物培育为植物组织细胞培育,具体操作如下:
选择野生虎杖的根或茎切段,经无菌水清洗干净,用70%乙醇浸润消毒10-30秒,在无菌室放入准备好的组培瓶内,在25℃条件下培养7-15天;
其中培育采用的培养基由以下方法制得:1)培养基制备:愈伤组织诱导培养基即SM培养基,蔗糖含量为10g/L、2,4-D含量2mg/L;2)试验培养基:在SM培养基中加入吲哚乙酸、6-苄基氨基腺嘌呤和白藜芦醇3g/L;3)培养基灭菌:将配好的培养基加入琼脂加热溶解,调至PH5.6-5.8,无菌分装于100ml组培瓶中,每瓶约30ml,冷却后盖上组培瓶盖,在1kg/C㎡压力、121℃条件下灭菌20mim。
5.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的复合菌种母液为乳酸杆菌、复合酵母菌和芽孢杆菌等量混合而成。
6.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的仿人胃消化液为复合食用酸、胃蛋白酶和纤维素酶构成的混合酸,其中:所述复合食用酸由浓度为10%的食用盐酸、浓度为10%的食用醋酸及浓度为15%乳酸按体积1:1:1的比例构成,该复合食用酸的ph 值为1-2;所述胃蛋白酶活力1:400,按混合酸体积每1000ml加入3g;所述纤维素酶按混合酸体积每1000ml加入3g。
7.根据权利要求1或2或4或5或6所述的任一白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的仿人肠消化为胰蛋白酶和木瓜酶解等量接入。
2
白藜芦醇的提取工艺 专业:化学工程与技术学号:2010001220班级:生研1004班姓名:刘珊珊 摘要:从虎杖等植物中提取的白藜芦醇具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、保护肝脏、保护心血管等功能,鉴于白藜芦醇的多种重要的应用价值,本文综述了白藜芦醇的提取方法,其中包括有机溶剂提取法、超声波及微波辅助萃取法等。通过对各种方法的综合比较,找出了最佳优化条件。 关键词:白藜芦醇;提取;正交实验 1.1白藜芦醇的理化性质 白藜芦醇分子式是C14H12O3,相对分子质量为228.25,化学名称为3,4,5’—三羟基—1,2—二苯乙烯,是一种蒽醌萜类化合物,熔点为256~257℃。它主要存在于葡萄、虎杖、花生、朝鲜槐等植物中,尤其在种皮中含量较高[1]。白藜芦醇易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂中。其存在形式主要有四种,分别是顺式-白藜芦醇、反式-白藜芦醇、反式-白藜芦醇糖苷及顺式-白藜芦醇糖苷,但只有反式异构体具有生物活性[2]。 图1反式白藜芦醇的结构式 白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂,可降低血液粘稠度,抑制血小板凝结和血管舒张,保持血液畅通,可预防癌症的发生及发展,具有抗动脉粥样硬化和冠心病,缺血性心脏病,高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有雌激素样作用,可用于治疗乳腺癌等疾病。它既是肿瘤疾病的化学预防剂,也是对降低血小板聚集,预防、治疗动脉粥样硬化,心脑血管疾病的化学预防剂。20世纪90年代,我国科技工作者对白藜芦醇的研究不断深入,并揭示其药理作用:抑制血小板非正常凝
聚,预防心肌硬塞、脑栓塞,对缺氧心脏有保护作用,对烧伤或失血性休克引起的心输出量下降有效恢复,并能够扩张动脉血管及改善微循环。 1.2白藜芦醇的提取方法 1.2.1溶剂提取法 溶剂法是国内外最广泛应用的提取方法。常用溶剂主要有水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等。溶剂法对设备要求简单,产品得率较高,但缺点是成本高,杂质含量也高。常见报道的溶剂法有三种:浸提法、渗漉法、回流法[3]。浸提法对温度要求不高,但费时较长,效率不高;渗漉法由于保持一定的浓度差,所以提取率较高,浸液杂质较少,但费时较长,溶剂用量大,操作麻烦;回流法较前两种方法效率高,速度快,但容易对受热敏感的原料造成破坏,因此根据不同的原料应采取不同的提取方法。 1.2.2碱性水或碱性稀醇提取法 白藜芦醇具有弱酸性,在碱性条件下酚羟基可以被转变成盐而使水溶性显著增加。碱提取法的原理是利用白藜芦醇这一性质,使其在一定条件下和某些无机碱、碱性盐形成酚盐而从体系里溶解出来;再通过调节溶液pH值的方法使之沉淀而得以分离,从而富集提取白藜芦醇。常用的碱性溶液为NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3 。 1.2.3超声波提取法 超声技术对中药有效成分提取分离有许多优点,如提高提取率、缩短提取时间、需求温度低等。超声波提取是一种物理破碎过程,对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用,用超声波辅助提取白藜芦醇,有利于保持较高的白藜芦醇的相对含量[4]。 超声波提取的工艺流程:样品处理→加入适量的提取试剂→热水浸提→超声波提取→离心分离样液→浓缩过滤→固相萃取,富集白藜芦醇→提取物样品[5]。 1.2.4酶解法 近年来文献对白藜芦醇的提取工艺报道较多,但白藜芦醇的提取率和提取物中白藜芦醇的含量较低,生产成本高。如果直接提取,白藜芦醇苷不易转化为白藜芦醇;其次白藜芦醇包裹在细胞壁内,若直接用有机溶剂提取,白藜芦醇难以溶出,酶解作用可以使细胞壁疏松、破裂,减小传质阻力,加速有效成分的释放,从而
葡萄籽中白藜芦醇提取和检测方法的研究现状 黄德成 李 华 王 华 (西北农林科技大学葡萄酒学院,杨凌,712100) 摘 要 介绍了白藜芦醇的理化性质及其提取和检测方法的研究现状,并对这些方法的优缺点作出简要总结,为葡萄籽功能性食品中白藜芦醇的检测提供参考。关键词 葡萄籽,白藜芦醇,理化性质,提取,检测 第一作者:硕士(李华教授为通讯作者)。收稿日期:2006-08-14 白藜芦醇(resveratrol ),化学名称为3,5,4′2三羟 基21,22二苯乙烯(trans 23,5,4′2trihydroxy 2stilbene ),是一种含有茂类结构的多酚化合物;少量以游离态的形式广泛存在于葡萄、虎杖和花生等天然植物或果实当中,到目前为止至少己在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇[1]。多年来人们对白藜芦醇研究结果表明,白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗氧化、降血脂和抗诱变等作用[2]。在日本,已将含白藜芦醇植物提取物作为食品添加剂使用;在我国,也有将白藜芦醇提取物制成降脂、美容、减肥和抗癌天然保健食品及胶囊[3]。但是目前国内外对白藜芦醇的检测还没有统一的方法标准[4],本文从白藜芦醇的理化性质、提取和检测方法3个方面作出简要综述,为葡萄籽功能性食品中白藜芦醇检测提供参考。 1 白藜芦醇的理化性质 白藜芦醇为无色针状结晶,分子式为C 14H 12O 3,相对分子质量228125,其结构式有顺、反2种,并各自可以与葡萄糖结合形成顺、反式白藜芦醇苷(其结构见图1),白藜芦醇常与葡萄糖结合以糖苷的形式存在;白藜芦醇熔点256~257℃,261℃升华,易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙醇等。在366nm 的紫外光照射下能产生荧光,并能和三氯化铁2铁氰化钾起显色反应[5]。其反式异构体的生物活性强于顺式异构体,在紫外光照射下反式白藜芦醇能够转化为其顺式异构体。纯白藜芦醇对光不稳定,在完全避光条件下,反式白藜芦醇可在乙醇中稳定数月,仅在高p H (≥10)下稳定性差一些;顺式白藜芦醇在避光条件下只有中性p H 下较稳定。反式与顺式白藜芦醇在紫外光(UV )210nm 处有强吸收,其第二吸收峰分别在305~330nm 和280~295nm 。在乙醇中,反式在308nm 的摩尔吸收系数为30000,顺式于288nm 的摩 尔吸收系数为12600[6] 。 R =H.trans resveratrol R =H.cis resveratrol R =G lu.trans piceid R =G lu.cis piceid 图1 白藜芦醇及其苷的化学结构 2 白藜芦醇的提取 目前,国内外大多采用葡萄皮、葡萄籽和虎杖等 植物为原料提取白藜芦醇。先将原料粉碎,采用有机溶剂(如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等)进行提取,经过滤后将滤液浓缩,即得白藜芦醇粗品。有机溶剂提取方法主要分为回流法、浸渍法、索氏法、超声波法等。211 回流法 加热回流提取白藜芦醇的溶剂主要有甲醇、乙醇和乙酸乙酯,对提取液萃取分离的萃取剂有石油醚、氯仿、乙酸乙酯等。朱鸿津[7]利用加热回流提取虎杖中白藜芦醇的方法是称取虎杖粉末(过40目筛)50g ,用体积分数95%乙醇水浴回流提取3次,第1次用4倍质量乙醇回流提3h ,第2、3次分别用3倍质量乙醇回流提取各1h ,合并提取液,冷却,过滤,滤液减压浓缩,得到白藜芦醇粗品溶液。回流法有着提取率较高,成本低的优点;然而由于提取时间较长,导致白藜芦醇的氧化,使检测结果失真。212 浸渍法姚宝书[8]等人以乙酸乙酯为提取剂,考察浸提时间、浸提温度、浸提次数、料液比对提取效果的影响,确定的最适的浸提条件:提取时间40min ,温度 综述与专题评论 2006年第32卷第10期(总第226期) 113
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910293456.4 (22)申请日 2019.04.12 (71)申请人 长沙市惠瑞生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区隆平高 科技园雄天路1号湖南金丹科技创业 大厦B栋第5层505号房 (72)发明人 王中华 (74)专利代理机构 长沙中海宏图专利代理事务 所(普通合伙) 43224 代理人 罗霞 (51)Int.Cl. C12P 7/22(2006.01) C07C 37/68(2006.01) C07C 37/72(2006.01) C07C 39/21(2006.01) A01H 4/00(2006.01)A01G 22/25(2018.01)A01C 21/00(2006.01) (54)发明名称 一种白藜芦醇的提取方法 (57)摘要 本发明涉及一种白藜芦醇的提取方法,其包 括以下步骤:1)粉碎;2)煎煮;3)接种发酵;4)酶 解;5)萃取;6)脱色干燥。本发明选用高白藜芦醇 含量的虎杖为提取原料,从源头上提高白藜芦醇 的提取率;提取方法上,釆用微生物发酵+酶解 +超声波萃取相结合的技术,最大限度地保持白 藜芦醇的生物活性,并使天然白藜芦醇(98%)的 得率达到了1.8%以上,并且基本实现了三废零排 放, 有效保护了生态环境。权利要求书1页 说明书6页CN 110066834 A 2019.07.30 C N 110066834 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110066834 A 1.一种白藜芦醇的提取方法,其特征在于包括以下步骤: 1)粉碎:选择高白藜芦醇含量的虎杖为原料,经破碎后其颗粒在0.5cm以下,再经超微粒化球磨成300目左右; 2)煎煮:加水煎煮60分钟,冷却到35℃-40℃; 3)接种发酵:接种复合菌种母液,混合均匀,密封,恒温发酵24-48h; 4)酶解:先加入5‰的仿人胃消化液,消化8-12h,加热至100℃约30-60min;再调ph值为6.5-8,然后加入5‰仿人肠消化液,消化8-12h,加热至100℃约30-60min; 5)萃取:粗滤,滤液通过超声波和加有机溶剂萃取; 6)脱色干燥:萃取液经膜分离后再上柱脫色,浓缩比重为1.2-1.25,啧雾干燥即得白藜芦醇粉。 2.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的高白藜芦醇含量的虎杖为白藜芦醇含量在1%以上的虎杖原料。 3.根据权利要求1或2所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的高白藜芦醇含量虎杖由以下方法培育: 1)虎杖繁育培植:选择白藜芦醇含量高的野生虎杖,进行植物培育,育种挑选出白藜芦醇含量在0.9%以上的虎杖种株进行扩大栽培; 2)虎杖栽培施肥:虎杖栽培管理期间,使用专用农肥,该专用农肥是以虎杖提取加工后的废渣60-70%,配合人工合成白藜芦醇生产废渣废水30-40%,接种微生物发酵后加工而成。 4.根据权利要求3所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的植物培育为植物组织细胞培育,具体操作如下: 选择野生虎杖的根或茎切段,经无菌水清洗干净,用70%乙醇浸润消毒10-30秒,在无菌室放入准备好的组培瓶内,在25℃条件下培养7-15天; 其中培育采用的培养基由以下方法制得:1)培养基制备:愈伤组织诱导培养基即SM培养基,蔗糖含量为10g/L、2,4-D含量2mg/L;2)试验培养基:在SM培养基中加入吲哚乙酸、6-苄基氨基腺嘌呤和白藜芦醇3g/L;3)培养基灭菌:将配好的培养基加入琼脂加热溶解,调至PH5.6-5.8,无菌分装于100ml组培瓶中,每瓶约30ml,冷却后盖上组培瓶盖,在1kg/C㎡压力、121℃条件下灭菌20mim。 5.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的复合菌种母液为乳酸杆菌、复合酵母菌和芽孢杆菌等量混合而成。 6.根据权利要求1所述的白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的仿人胃消化液为复合食用酸、胃蛋白酶和纤维素酶构成的混合酸,其中:所述复合食用酸由浓度为10%的食用盐酸、浓度为10%的食用醋酸及浓度为15%乳酸按体积1:1:1的比例构成,该复合食用酸的ph 值为1-2;所述胃蛋白酶活力1:400,按混合酸体积每1000ml加入3g;所述纤维素酶按混合酸体积每1000ml加入3g。 7.根据权利要求1或2或4或5或6所述的任一白藜芦醇的提取方法,其特征在于所述的仿人肠消化为胰蛋白酶和木瓜酶解等量接入。 2