Ion torrent 文库构建流程 16s rRNA
634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)
操作一览 (PT3000-2) 本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。 A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成 1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂： 1–3 μl RNA 样本 (对照反应，使用1 μl 的对照RNA) 1 μl SMART? IV Oligonucleotide 1 μl CDS III/3' PCR Primer 如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。 2. 混匀试剂并瞬时离心。 3. 72°C孵育2 min。冰上冷却2 min。 4. 瞬时短暂离心。 5. 向每管反应中加入以下试剂： 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM) 1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase 10.0 μl 总体积 6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。 7. 42°C孵育1 hr。之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。 8.引物延伸合成ds cDNA 分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。 B. LD PCR扩增合成cDNA 1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂： 2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7) 80 μl Deionized H2O 10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer 2 μl 50X dNTP Mix 2 μl5' PCR Primer 2 μl CDS III/3' PCR Primer 2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix 100 μl总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。 3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95°C)的PCR仪器 中。
胜任力模型的构建流程
胜任力模型的构建流程 一个相对完整的胜任力模型构建过程大致可以划分为三个步骤：职系与序列划分、能力素质要素提炼和能力素质要素评级。 首先是要进行职系与序列的划分。胜任力模型是建立在明确的职系和序列划分基础之上的。 “职系”是指由两个或两个以上的职位组成，是职责繁简难易、轻重大小及所需资格条件不同，但工作性质相似的所有职位集合。简言之，一个职系就是一种专门职业（如管理职系、操作职系等）。“序列”是指将现有组织结构中具有相同或相近专业资质要求的职位归并成一类职位群组。每个序列具有其独特的能力素质结构组合和描述，一个职系包含一个或多个序列，一个序列只能在一个职系当中。划分职系和序列的目的是通过设立不同的职业通道，为员工指明职业发展的方向。 在具体进行职系划分时，可以工作性质相似为原则，通过企业价值链分析来确定职系的划分。例如，通过对某石油炼化企业价值链进行分析，将企业的所有职位划分为管理职系、技术职系和操作服务职系。序列的划分以能力素质要求相近为标准，可以通过业务类别和职责对比归类两种方法确定序列划分。例如，根据岗位说明书在对岗位能力素质初步判断的基础上，将某企业管理职系下面的所有职位划分为中层管理序列、财务管理序列、综合管理序列和生产管理序列等。 职系和序列的划分是公司进行职位管理的基础和重点，也是胜任力模型构建的基础。通过职系分类，可以为员工设立多条职业发展通道，同时，通过序列划分，可以明确不同职位能力素质的差异，实现对员工的区别管理。 第二步是在职系和序列划分的基础上进行能力素质要素的提炼。 一个完整的胜任力模型由核心能力素质、通用能力素质和专业能力素质三部分组成。因此，能力素质要素的提炼也将围绕这三部分能力素质进行。首先是核心能力素质要素的提炼，“核心能力素质”是基于公司核心价值观、企业文化与战略愿景，要求全体员工都应具备的能力素质。核心能力素质要素提炼可以采取行业共性分析、企业资料分析和企业调研等方式进行。例如行业共性分析，可以采取行业共性分析、优秀标杆企业借鉴等方法，通过对行业的共性分析以及标杆企业核心能力素质的分析，获取行业或标杆企业在核心能力素质方面的共性需求，得出可供备选的核心能力素质要素。最终经过分析和研讨确定企业的核心能力素质；接下来是进行序列通用能力素质要素的提炼。“序列通用能力素质”是每个岗位序列所要求的能力素质，但不同岗位对能力素质的要求不同。通用能力素质要素提炼可分为以下三
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water （大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4 ul 5×first strand buffer （2）2 ul 0.1 M DTT （3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成
如何建立公司流程.doc
一．公司建立管理流程的必要性 无论是集团公司还是新建立的公司，开始的创业基础是非常关键，建立完善的管理体系是必需的，那么如何建立企业各环节的流程，搭起公司各环节的桥梁，架起与战略匹配的组织框架，使企业上下沟通流畅，准确真实的将信息传递到每一个部门及个人，从而促使公司不断地发展，实现企业价值的最大化；但是这些需要很多方面的努力，例如，企业要解决战略目标无法分解、企业总体压力无法传递下基层、业绩不能按时达成、业务进程不能把握、市场开拓力不强、人员流动性大、各部门沟通不畅、成本无法控制、劳资关系紧张等等现状。问题的存在覆盖到企业的方方面面，当然其解决办法也就不是单凭依靠咨询管理公司或者是导入人力资源管理体系就能解决。而应是在根据企业的现实和战略目标，整合员工与各种资源，发动企业投入一个清楚而动人的新兴产业远景，激发组织向一流的绩效挑战。 对企业目标、众多的技术细节需要管理、执行和实现。公司要实施管理流程体系，面对的是极具挑战性的变革目标和头绪众多的变革任务，指导规范演变过程有序而优质地进行，需要一个行之有效的管理操作方法。解决之道专心致力于“挖掘企业领先的能力，资源如何运用，如何点燃员工的热情”三个环节。与此无关的，一概略过。 二．企业管理流程的基本思路 企业管理流程具体来说就是企业在明确的整体战略的指导下，围绕公司的目标，完善公司各部门的业务流程体系，根据公司的发展阶段不断调整公司的核心角色，例如以财务流程的核心地位，以财务管理为驱动，固合企业商业思维，优化决策程序。实现组织设计、业务流程、人力资源、信息技术和基础管理机制的有机结合，有效地增强员工业务能力和工作态度，迅速形成企业的资源共享平台，使企业在经营业绩和各项业务表现方面获得显著和持续的进步。 三．企业管理流程的结构组成 1、用一个大的概念简单扼要地阐述企业的发展方向。 目的：集中企业的资源，创建激情的团队。 如果一个企业不能用一个大的概念简单扼要地阐述企业的发展方向，直接的后果就是企业的资源无法集中，没有办法发动企业投入一个清楚而动人的远景，激发组织向一流的绩效标准挑战。没有激情的团队和资源的分散的企业，很难令人信任它能完成一个宏伟的发展计划。所以目标要能够量化，可操作，利用公司的管理流程体系监督公司的每一个环节，进行考核、调整，促进公司的整体发展。 2、建立企业整体战略 1）目的：为企业快车辅设轨道
(新)流程体系框架构建简介
流程体系框架构建简介 流程体系框架的构建是一个企业进行流程管理的起点，流程体系的缺失会导致诸如企业流程的分割和关联性不强，流程层级混淆，边界不清等问题。 在这种情况下人们看到的往往只是自己眼前从事的事，即不能了解从事工作所在流程的全貌，也看与其它部门和角色的关联，即看不到所属业务模块乃至整个企业价值链中的位置和作用，更谈不上对流程整体价值的客观理解和认识。这也导致了本位主意，只关注自己局部利益的现象，最终成为企业流程优化，流程改造的阻力之一。 经过几年在流程领域的实践，也受到当年软件开发流程设计的影响，整理出以下经验作为流程体系框架建设的总结。 流程体系框架的建构原则是从宏观的业务级别到微观的活动级别，从易到难，从简到繁，完整的覆盖企业从业务到运营全部内容以及全部细节，是一套遵循业务逻辑的规划、设计体系。 流程体系的最上层是“业务级流程”，他就是在企业运营中，以业务视角所形成的不同业务流程描述。就如同在ERP中对不同业务的汇总一样的层次，如财务业务模块，物流业务模块，销售业务模块……这个层面的信息一般在公司对外介绍和高层粗线条的交流上来使用。 在“业务级流程”之下，我们要进行“部门级流程”的建设，可以说它是“业务级流程”的进一步细化，对业务流程中在部门之间的运营流程做出描述。通过它能清晰了解某个业务流程涉及到哪些部门和彼此的逻辑关系。这个层面的信息一般在部门业务讨论以及高层领导了解流程的时候使用。 “岗位级流程”是对“部门级流程”的再一步细化，它是以岗位为最小单元，对岗位在执行某项工作时所经过的流程的描述。这个层面的信息可以协助部门工作管理，职责规划来使用，也可以协助在部门岗位中用来了解岗位职责等。 最后层面的是“活动级流程”，它是流程的最小执行单位，也是流程管理和控制的落脚点。对活动的描述构成了这个岗位的标准作业指导书（SOP），这是指导一线操作人员最基本的信息。 要强调的是，在流程由上至下的细化过程中，以及流程横向关联的设计中，一定要注意输入、输出的平衡，这也是借用IT流程设计的思路。同时，尤其要注意在接口的定义，保证接口的稳定是降低整体流程风险的一个有效方式。 如果把流程的贯彻和落地也归结为流程体系框架内容的话，那用表单或者E化的方式固话流程，确保流程按设计实施也是这个体系中很重要的内容。
cDNA文库构建简易流程
1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA，加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡 核苷酸以及其它相应试剂，在适当的条件下，经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA 取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂，通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化 双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性，经氯仿:异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。酶切后，过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化，以去除小的片段和杂质，依次收集16管，经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，收集cDNA 含量最高的几管。 4、双链cDNA片段的克隆和体外包装 分级分离纯化的双链cDNA，定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上，在载体量不变的前提下，设定了3个连接梯度反应，连接结束后，3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装，体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测 用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后，分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释，稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液，在37 C进行20min的吸附后，再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂，迅速混匀倒到预热至37℃的平板上，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养，每相隔一段时间后，检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算，公式如下 : 文库的重组率则利用蓝白斑互选进行，在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml)，待噬菌斑长成后，统计蓝白斑的数量，算出重组率。 6、cDNA的PCR快速鉴定 从平皿中直接挑取噬菌斑，用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。 初步结果：按l : 10的比例稀释后滴定，过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少，滴度很低，而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高，符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想，连接效率最高。 紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定，随机挑取10个透明噬菌斑，PCR扩增均有大于500bp的插入片段，进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。
企业标准化建立流程
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企业标准化概念 1．“标准”的定义 国家标准GB/T 20000.1-2002《标准化工作指南第1部分：标准化和相关活动的通用词汇》定义：“为了在一定范围内获得最佳秩序，经协商一致制定并由公认机构批准，共同使用和重复使用的一种规范性文件”。WTO/TBT技术性贸易壁垒协议规定：“标准是被公认机构批准的、非强制性的、为了通用或反复使用的目的，为产品或其加工或生产方法提供规则、指南或持性的文件”。 上述定义，深刻提示了“标准”的内涵。制定标准的目的就是“获得最佳秩序”和“促进最佳共同效益”。“最佳秩序”是指通过制定和实施标准，使标准化对象的有序化程度达到最佳状态，而“最佳共同效益”指的是相关方的共同效益，而不是仅仅追求某一方的效益。标准产生的基础是科学、技术和经验的综合成果。制定标准的对象是“重复性事物”。标准由公认的权威机构批准。 2．“标准化”的定义 国家标准GB/T 20000.1-2002《企业标准化工作指南第一部分标准化和相关活动的通用词汇》定义：为在一定范围内获得最佳秩序，对现实问题或潜在问题制定共同使用和重复使用的条款的活动。 标准化是一个活动过程，主要是制定标准、实施标准进而修订标准的过程，它是一个不断循环、螺旋式上升的运动过程。每完成一个循环，标准的水平就提高一步。标准化是一项有目的的活动，除了为达到预期目的改进产品、过程和服务的适用性之外，还包括防止贸易壁垒，促进技术合作。标准化活动是建立规范的活动，所建立的规范（条款）具有共同使用和重复使用的特征。 3．“企业标准化”的定义 企业标准化是为在企业的生产、经营、管理范围内获得最佳秩序，对现实问题或潜在的问题制定共同使用和重复使用的条款的活动。 企业标准化的要点是： （1）企业的标准化活动可使企业生产、经营、管理活动的全过程保持高度统一行动和高效率的运行，从而实现获得最佳秩序和经济效益的目的。 （2）企业标准化的对象是企业生产、技术、经营、管理等各项活动中的重复性事物和概念。 （3）企业开展标准化活动的主要内容是建立、完善和实施标准体系，制定、发布企业标准，组织实施企业
cdna文库构建流程
cDNA文库组标准流程 一. Total RNA的提取 (2) 二. mRNA的分离 (5) 三．cDNA双链合成 (8) 四．载体制备 (11) 五. cDNA双链和载体的连接 (13) 六．电转化流程 (14) 七．快速鉴定、菌落PCR (16) 八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)
一.Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠8.25ml 10%肌氨酸钠12.375ml 异硫氰酸胍118.05g 加DEPC水定容至250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） ▲2M 醋酸钠PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温 放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):
质粒构建流程
质粒构建流程 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3） 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。 二、目的片段获取 1. RNA提取 试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存） 准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套 操作步骤： 1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4℃，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4℃，12000rpm离心60s 13）点样：5μl RNA+ 1μl 10× 14）-20℃保存 2.RNA反转录 试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存） 准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管 操作步骤： 1）基因组DNA去除（10μl体系） ② 5×gDNA eraser buffer 2μl ① gDNA eraser 1μl Total RNA 4μl(可根据RNA浓度调整) ⑥ RNase free water 3μl PCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃ 注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入 2）反转录反应（20μl体系）
构建流程化管理体系,打造企业核心竞争力
构建流程化管理体系,打造企业核心竞争力 我们所了解的企业组织大都是建立在传统管理模式下的，主要以劳动分工和职能专业化为基础，基于职能管理的按职能专业化处理企业业务流程的管理模式，这种模式源于18世纪亚当·史密斯(Smith)的“劳动分工原理”和19世纪弗雷德里克·泰勒的“制度化管理理论”,即强调按专业化分割,把企业的经营过程分解为最简单、最基本的工序,这样工人只需重复一种简单工作,熟练程度大大提高,同时对各个经营过程实施严格控制。在当时,由于工人素质低、劳动力廉价和技术水平有限,因此这些理论得到迅速推广,并有效地提高了企业的劳动生产率。这两种理论在20世纪被两大汽车巨头延伸和发展,亨利·福特(Henry Ford)将其用于福特公司的汽车生产,形成了汽车流水作业线,使生产效率倍增；阿尔弗雷德·斯隆(Alfred Sloan)将其应用于通用汽车公司的组织经营管理,形成了层层上报的金字塔式组织结构,加强了部门管理。 相当多的企业在管理实践中发现，建立在传统管理模式下的企业管理往往是事后的、静态的，运作比较好的企业则将内部组织的部门划分得更细，各部门的专业化程度更高，他们为了能保持对专业化分工后的职能部门进行有效管理、协调和控制，建立了按等级制构成的企业组织，制定了多部门、多层次、严格的管理制度，从最高管理者到最基层的员工形成了一个等级森严的"金字塔"型的组织管理体系。这种组织适合于稳定的环境、大规模的生产、以产品为导向的时代，它以各部门的简单重复劳动来赢得整个部门的效率。但其代价是整个工作时间的延长，大量的时间和资金都浪费在这些不增值的活动中了。首先我们来看看，基于传统模式下的管理可能存在着哪些方面的问题。 1、没有真正面向市场面向客户。每家企业都在强调客户价值，强调发展竞争力，强调结构和理念的变化，但真正做到3C的企业极其少数。 ----客户(Customer)：企业需要满足客户价值的最大化，充分实现从以产品为中心过渡到以客户为中心的管理思想上来，创造客户价值是企业经营的出发点和归宿。 ----竞争(Competition)：竞争是现代企业面临的生存环境之一，并且这种特点变得更加残酷，更加扣人心弦，为应对竞争激烈的市场，企业开始去寻找各种应对的办法。 ----变化(Change)：用瞬息万变来形容现代企业面临的环境变化一点都不为过，瞬间即逝的机会也是企业领导或者决策层极其头疼的事情。 2、组织机构臃肿，组织应变能力差。帕金森曾经说“机构会自动制造工作”，为了把企业内部各部门、各环节衔接起来，需要众多的管理人员作为协调器和监控器。“人多好办事”、“虱子多了不痒”。面对新的市场环境，真正能做到前瞻有远见的企业和管理者其实不多，并非是他们没有想法，没有能力，而是僵硬的机制产生了负面效用。同时随着管理层次的增多，指挥路线的延长，信息传导与沟通的成本会急剧上升，就可能造成信息在传递过程中的失真，导致企业管理存在层次重叠、冗员多、成本高、浪费大、对市场反应迟缓等缺陷，阻碍企业的进一步发展。
构建业务流程
构建业务流程，第2部分 --WebLogic Integration 开发最佳实践 时间：2004-12-22 作者：Vijay Mandava, Anbarasu Krishnaswamy 浏览次数： 本文关键字：文章工具 推荐给朋友 打印文章 本文是在BEA WebLogic Integration 8.1 上构建业务流程的最佳实践中的第二篇。第一部分（WLDJ，第3 卷，第6 期）关注于团队开发和维护的最佳实践。在本文中，我们着重于创建具有可伸缩性、可恢复性、异常处理、有保证的传送以及高性能的业务流程的最佳实践。本文适用于WLI 应用程序的开发人员和设计人员。 阅读本文的第一部分 流程的版本控制 最佳实践 指定流程文件的版本。 原因 很容易忽视版本控制，原因是流程无需任何版本就可以工作。但是对流程进行版本控制确实很重要的，特别是对于那些长期运行的流程而言。升级一个流程时，如果流程没有指定版本，那么未决（in-flight）实例要么终止，要么部署失败，这依赖于服务器的运行模式。如果服务器运行在迭代（iterative）模式，则流程中止，如果服务器运行在生产（production）模式，则部署失败。 细节 利用WebLogic Workshop 的版本控制功能，您可以对业务流程进行更改，而无需中断任何当前正在运行的流程实例。当您指定一个业务流程的版本时，您就创建了一个业务流程的子版本，该流程共享相同的公共URI（接口）作为其父流程。在运行时，被标记为活动的流程版本是那些被外部客户端通过公共URI 所访问的流程。 您可以为业务流程指定版本，但不能为与该流程相关联的单独控件或者其他与业务流程相关的组件（例如schema 和转换）指定版本。当您指定一个业务流程的版本时，您也必须指定该流程的子流程的版本，指定父流程的版本后，子流程的版本并不能被自动指定。所调用子流程的版本取
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法 1．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 1.2cDNA的合成与克隆 1.2.1 cDNA第一条链的合成 所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。RNAase H酶活性在反应中起负作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA杂交分子中的RNA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。 1.2.2 cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环，得到可供克隆的双链cDNA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mRNA5’的序列出现缺失和重排，并造成克隆效率偏低，故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4mmol/L的焦磷酸钠，以抑制发卡结构的形成，这样便避免了使用SI核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2.3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA）合成后，将此DNA与载体（质粒或噬菌体）组成重组分子，然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文
载体构建操作流程
载体构建操作流程 一、载体准备 1、质粒准备 电泳检测载体质量 好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。超螺旋结构应至少占到90%。 测定质粒浓度 用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。 2、质粒双酶切 根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。 以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下： 试剂体积 质粒<1 μg Enzyme I 1μL Enzyme II 1μL 10×X Buffer 2μL 灭菌水to 20μL 总体积20μL 将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。 根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。 3、回收质粒 凝胶回收 参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。 1)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶 块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。 2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化 （约5～10分钟）。 3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作的溶液转 移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟， 弃滤液。 5)重复操作步骤。 6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。 7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处 加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 8)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 9)室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
基因文库的构建
基因组DNA文库构建的基本流程 日期：2013-03-07 来源：网络标签：载体DNA文库文库构建 摘要: 基因组DNA文库构建的基本流程是什么？基因组DNA文库构建有哪些步骤？基因组DNA文库构建有哪些实验必备技巧？基因组DNA文库构建有哪些注意事项？相信一下内容给你个清楚的解答。 基因组DNA 文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA(gDNA) 毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA 根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体(比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM)，合适的片段长度大约为40kb;对于BAC载体(比如Ep ICE ntre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM)，平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。 构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的dna片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶(常用EcoR I、BamH I或者Hind III)来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段(比如100kb-150kb)，随后透析回收DNA。 需要注意： (1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。 (2)电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。 (3)回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择 目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体(P1人工染色体)、BAC 载体(细菌人工染色体)和YAC载体(酵母人工染色体)。选用何种载体可以参考如下几个因素： 1.目标区域的大小 如果基因组的目标区域很小(小于50kb)，那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。 如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。