Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library

De novo测序文库构建方法

一、De novo测序的原理

De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。

利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。

De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。

拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。

二、文库构建技术路线

1. Ion 200 or 400-base-read library

Workflow

基因组DNA提取

↓

OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量

↓

超声波打断

↓

末端修复

↓片段纯化

接头连接

↓纯化

文库片段筛选（E-Gel胶回收）

↓

文库片段扩增

↓纯化

Agilent检测，Qubit定量

↓

OneTouch、ES

↓

上机测序

2. Ion mate-pair library

基因组DNA提取

↓

基因组定量检测

↓

DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA）

↓

末端修复

↓

文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）

↓

文库片段定量

↓

MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒）

↓纯化

Qubit定量

↓

确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）

↓

DNA片段环化

↓

分离纯化环状DNA

↓

定量

↓

环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化

↓

T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切

↓纯化

末端修复

↓

文库片段于链霉素亲和素微珠相连

↓

连接Ion接头

↓

缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）

↓

片段扩增

↓SOLiD试剂盒纯化

片段切胶回收

↓

Agilent检测

↓

Q-PCR定量

↓

文库构建完成

三、文库构建用到的试剂盒

Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme Module

Mate-Paired Library Amplification Module

Mate-Paired Library Oligo module

Library Micro Column Purification Kit

Agencourt AMPure XP 60 mL Kit

Qubit 2.0 Fluorometer及相应的试剂

Agilent 2100 及相应的试剂

四、400bp测序文库构建步骤

1.细菌基因组DNA的提取

要求客户提供足量菌体。将培养至对数期的菌液分装到2-3支2mL离心管，采用适当的转速离心使菌体沉淀到管底，除去上清液，迅速放入液氮速冻后，放入装有干冰的保温盒内运送。

细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。

取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA 浓度达到文库构建的量。

2.DNA片段化

采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断

步骤：

1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg

2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色

3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE 至总体积为50mL

4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子

5）选择Ion_Torrent_400bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”

6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中

3.末端修复及接头连接

3.1 末端修复

使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时

离心2s

步骤：

1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min

3.2 片段纯化

片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行

步骤：

1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清4）重复第三步

5）用20μL墙头小心吸去多余的液体

6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）

9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接

4.接头连接、缺口修复和纯化

片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头

4.1 接头连接

在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）

DNA 25μL

10×Ligase Buffer 10μL

Ion P1 Adaptor 2μL

Ion Xpress Barcode X+2μL

dNTP Mix 2μL

Nuclease-free water 49μL

DNA Ligase 2μL

Nick pair polymerase 8μL

Total 100μL

将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增

25℃15min

72℃5min

4℃hold

循环×1

立即转移至一个新的1.5mL离心管中

4.2 纯化

片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行

步骤：

1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min

2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清4）重复第三步

5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体

6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋

窝震荡10s，充分混合

8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）

5.文库片段筛选

方案1

E-Gel Agarose System

采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。

主要步骤：

1.上胶将E-Gel系统包含的2%Agarose凝胶安装到基座上

2. 点样胶孔内加入250ng的DNA Ladder、1μg DNA文库

3. 电泳打开电源，设置电泳时间，开始电泳

4. 片段回收根据Ladder选择需要回收的片段切胶回收

5. 片段纯化

方案2

采用琼脂糖凝胶电泳，胶回收法

步骤：

制备1%琼脂糖凝胶

1）称取0.7g琼脂粉置于锥形瓶中，加入70mL 1×TAE

2）锥形瓶放置于微波炉中加热至融化，取出，将融化的凝胶转移至凝胶区专用的100mL小烧杯中，向小烧杯中加入35μL 0.5μL/mL的EB（或其他染色物，如goldview，duRed等，使用浓度和用量各不相同）

3）将染液充分混匀，倒入装有制胶板且插上了梳子的胶槽中，待凝胶冷却后，轻轻拔下梳子，将装有凝胶的制胶板放入到电泳槽中，其中电泳槽内装有1×TAE 缓冲液，没过胶约1~2mm

4）加样。向装有20μL的片段化DNA离心管中加入2μL的6×loading buffer，将离心管内的DNA溶液转移到胶孔中，同时在于凝胶间隔的位置点入3~5μL DL 1000 marker

5）120V电泳15~20min，蓝色条带到距离另一侧边缘1~2cm时停止电泳

6）将凝胶放置到切胶仪上，在紫外灯下迅速将400bp左右的片段切胶回收

7）使用胶回收试剂盒，按照说明书操作步骤，实现400bp左右大小文库片段的筛选

6.文库片段扩增

6.1 100ng文库PCR体系

扩增采用Ion Plus Fragment Library Kit

体系包括：

Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100μL

Library Amplification Primer Mix 5μL

文库片段25μL

Total 130μL

放入PCR仪中，按以下循环进行：

95℃5min

95℃15s

58℃15s 8个循环

70℃1min

4℃hold

6.2 扩增产物纯化

1）体系中加入195μL Agencourt AMpure XP Reagent

2）上下震荡5次，瞬时离心后室温放置5min

3）将离心管放置于DynaMag-2磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上

4）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清

5）重复第四步

6）瞬时离心后，放置于磁力架上，用20μL墙头小心吸去多余的液体

7）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min

8）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合

9）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）

10）将转移的离心管放置到磁力架上至少1min，将上清液小心转移到一支新的1.5mL离心管中

7.Agilent Test & Qubit Qualify

片段大小在400bp左右，片段浓度不低于1μL/mL

五、Ion Mate-Pair文库构建步骤

1.细菌基因组DNA提取、检测

2.DNA片段化

使用HydroShear DNA Shearing Device对基因组DNA进行片段化处理，将DNA断裂为3kb或10kb大小的片段。

原理：

通过压力作用，使DNA通过中间的孔口，使之断裂

步骤：

1）3kb片段在一支1.5mL离心管中加入5μL DNA和150μL无核酸酶水5kb 片段在一支1.5mL离心管中加入20μLDNA和150μL无核酸酶水

2）在Edit Wash Scheme Tab上，进行以下设置

2轮WS1（0.2N HCl）

2轮WS2（0.2N NaOH）

3轮无核酸酶水处理

3）设置完仪器参数，运行片段化程序

4）运行清洗程序

5）使3kb DNA文库总体积小于70μL，10kb DNA文库总体积小于100μL

3.末端修复（以3kb文库为例）

按照以下体系配置

DNA 片段＜67μL

5×Reaction Buffer 20μL

10 mM dNTP 4.0μL

End Polishing E1 4.0μL

End Polishing E2 5.0μL

Nuclease-free Water varies

Total 100μL

室温下（25-30℃）放置30min

向体系中加入

20% SDS 8.5μL

10×BlueJuice Gel Loading Buffer 10.0μL

65℃水浴10分钟

冰上放置5分钟后，加入胶孔中进行琼脂糖凝胶电泳

4.片段切胶回收

使用1%琼脂糖凝胶分离3kb片段文库，使用0.6%琼脂糖凝胶分离10kb片段文库。使用1×SYBR Safe Gel染色剂，1×TAE buffer

1×TAE 200mL

Agarose 2g for 1% gel and 1.2g for 0.6% gel

10000×SYBR Safe gel stain 20μL

Total 200mL

低电压（5v/cm）电泳过夜

切胶回收

1）在Safe Imager蓝光底座上切胶。3Kb片段选取ladder 2.8-3.5kb的片段，10kb 片段选取Ladder 10-11kb片段。如果胶块体积过大，切成小块。

2）使用SOLiD Library Quick Gel Extraction Kit进行片段回收纯化

胶块＜200mg，使用1.5mL离心管溶胶

步骤

a.向离心管内加入30μL Gel Solubilization Buffer(L3) /每10 mg凝胶

b.混匀，震荡，室温下静置15min，待凝胶溶解（不可高温水浴）

c.按照每10mg凝胶加入10μL异丙醇的比例，向体系中加入异丙醇

3）按照每支分离柱分离400mg凝胶的量，或者分离小于2000μL混合液的比例，将上述混合液加入到分离柱上，室温下12000r/min 离心1分钟，弃去液体，将柱子放到离心管中

4）洗柱子

向柱子中加入500μL Wash Buffer（W1），12000r/min 室温离心1min，弃去液体，开盖离心2分钟，除去多余的乙醇

5）收集DNA

将柱子转移到一支新的1.5mL离心管，加入50μL Elution Buffer，室温下放置10分钟后，12000r/min 室温离心1分钟，离心管中包含纯化的DNA片段

5.片段定量

使用Qubit 2.0对纯化的DNA片段进行定量

6.DNA与MP接头连接

6.1.计算需要加入的接头量Y（μL）：

Y=106/660/平均片段长度×DNA质量（μg）×50/25

=106/330×DNA质量（μg）/平均片段长度

如Y＜1μL，则加入1μL接头到体系中

6.2 体系

末端修复的DNA ＜60μL

5×Reaction Buffer 20μL

MPR Adaptor (ds), 25μM YμL

MPL Adaptor (ds), 25μM YμL

T4 DNA聚合酶，5U/μL 10μL

无核酸酶水Variable

Total 100μL

室温下放置30min

6.3片段纯化

6.3.1制作磁珠悬液

样品溶液100μL

无核酸酶水150μL

Agencourt AMPure XP Reagent 200μL

Total 450μL

旋窝震荡混匀15s，瞬时离心

室温（20-25℃）下，放置5min

将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液

6.3.2 将结合有DNA的磁珠清洗两遍，过程中保持装有磁珠的离心管在磁力架上

加入600μL 70%乙醇于离心管中，不震荡磁珠

保持离心管在磁力架上至少1min，小心除去上清

6.3.3 将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，将离心管放回磁力架，使用20μL小枪头除去上清液

6.3.4 打开离心管盖，室温（20-25℃）风干不超过3min

6.3.5 洗脱DNA

将离心管从磁力架上取下，加入50μL Elution Buffer（E1）

旋窝震荡15s，瞬时离心，室温下（20-25℃）放置3min

将离心管再次放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清

将上清液转移到一支新的1.5mL LoBind离心管

6.4 Qubit定量分析

如果纯化的DNA含量＞初始DNA总量的5%，则可进入下一步。

如果纯化的DNA含量＜初始DNA总量的5%，也可进入下一步，但在后续的纯化步骤中为了最小化地减少DNA损失量，应该重新确认一开始DNA片段的长度，建议增加或减少10%的插入片段长度。

如果纯化的DNA含量小于50ng，重新开始DNA样品的定量以及mate-pair

文库构建初始步骤。

7.通过分子内杂交环化DNA

Mate-paired接头包括一个阻塞寡核苷酸来保护3’端MP接头自连接。环化时，

热变性使阻塞寡核苷酸移除。DNA分子内杂交环化必须在低浓度条件下进行。7.1 加热块中所有的孔中都加入水，预热至70℃

7.2 计算环化反应的总体积（μL），因此根据已知的DNA浓度和体积，将最终的浓度定量为0.5ng/μL

T=[DNA]×V/0.5

如：DNA=5ng/μL，V=50μL，则T=500μL

7.3 体系

DNA vμL

10×Plasmid-Safe Buffer T/10.0μL

Nuclease-free Water T-（T/10）-VμL

Total TμL

7.4 将体系放置到加热模块中70℃，5min，然后将体系放置到冰上，3kb体系5min，10kb体系30min

8.分离环化DNA

使用Plasmid-Safe DNase除去非环化DNA。处理过后，使用Agencourt AMPure XP Reagent进行纯化

8.1 配置下面的反应体系，其中T为环化DNA的总体积

环化DNA体积TμL

ATP，100mM T/100μL

Plasmid-Safe DNase，10 U/μL T/100μL

混合反应液，37℃保温40min

8.2 片段纯化

8.2.1 使Agencourt AMPure XP Reagent 磁珠再悬浮

8.2.2 将DNA结合到磁珠上

a. 准备磁珠

样品体积TμL

磁珠稀释buffer 0.7×TμL

Agencourt AMPure XP Reagent 0.3×TμL

b. 旋窝震荡15s后，瞬时离心

c. 室温下（20-25℃）放置5min

d. 将磁珠放置到磁力架上1min以上，至溶液澄清，小心除去上清

8.2.3 洗涤DNA2次，每次洗涤时，将离心管放置到磁力架上

a. 向体系中加入600μL 70%乙醇，不混动磁珠

b. 将离心管保持在磁力架上至少1min，小心除去上清

8.2.4 将离心管取下，瞬时离心后，放回到磁力架上，用20μL枪头小心除去上清

8.2.5 打开管盖，室温（20-25℃）下放置3min

8.2.6 混合

无核酸酶水84μL

Nick Translation Buffer 10.0μL

8.2.7 洗脱DNA

a.将离心管从磁力架上取下，加入91μL Nick Translation Buffer的pre-mixed solution于装有DNA的离心管中

b.轻轻混合15s，瞬时离心，然后室温下放置3min

c.将离心管放置到磁力加上至少1min，至溶液澄清

d.将上清转移到一支新的0.2 mL PCR管中

注意：立即进行下一步骤

定量：如果3kb文库的初始DNA量为1-2μg，10kb文库的初始DNA量小于15μg，则跳过定量步骤，立即进行下一步操作。否则，使用Qubit 2.0进行定量。

9.环化DNA缺口转化

使用E.coli DNA聚合酶Ⅰ将环化DNA缺口转化为基因组DNA区，环化目标区域大小可通过反应温度和时间控制。为了方便实验步骤，不同的mate片段大小采用不同的反应时间但相同的反应速度进行。

9.1 环化DNA缺口转化

注意点：DNA聚合酶Ⅰ对温度变化敏感，因此在反应前先将DNA聚合酶Ⅰ放置到5℃条件下数分钟

a. 向0.2mL PCR管中加入以下组分

DNAse-treated，纯化DNA 90μL

10 mM dNTP 5.0μL

b. 混合体系后，瞬时离心

c. 将体系放置到PCR仪上5℃，2-3min，不加入DNA聚合酶，不打开热盖

d. 在另一支0.2mL离心管中加入5.0μL DNA聚合酶Ⅰ，瞬时离心

e. 将DNA聚合酶Ⅰ放置到PCR仪上5℃，大于1min，不打开热盖

f. 计时器设置10min

g. 将DNA聚合酶Ⅰ混合到体系中，轻轻吹打混匀，瞬时离心，放回到PCR 仪中

h. 开始计时

i. 准备400μL含异丙醇的Binding Buffer（B2-S）于一支1.5mL离心管中

j. 0.2mL离心管混合体系孵化结束后，立即将混合液转移至1.5mL包含Binding Buffer的离心管中，Binding Buffer能使酶失活，终止反应。

9.2 使用SOLiD柱式文库纯化试剂盒纯化DNA

9.2.1 将空柱子放置到离心机上10000r/min，预离心1min，离心后的柱子盖

子关闭

9.2.2 将DNA装到分离柱上

a. 将缺口转化的DNA和混有异丙醇的Binding Buffer充分混合

b. 将所有的混合液加入到分离柱上

c. 室温下10000 r/min离心1min，取出液体，环化DNA保留在柱子底部

9.2.3 洗涤分离柱

a. 将分离柱放回到原先的离心管中

b. 加入650μL 加入乙醇的Wash Buffer（W1）于分离柱中

c. 室温下10000 r/min离心1min，弃液体

d. 14000 r/min 离心除去剩余的洗脱液

9.2.4 洗脱DNA

a. 将分离柱转移到一支新的1.5mL离心管

b. 加入25μL Elution Buffer（E1）于分离柱正中心，将DNA洗脱，保持分离柱竖直1min

c. 室温下14000 r/min离心1min

d. 将离心的液体重新加入到分离柱上，保持分离柱竖直1min

e. 室温下14000 r/min离心1min

9.2.5 必要时，将纯化的DNA转移到一支新的1.5mL LoBind离心管中

10. 使用T7核酸外切酶和S1核酸酶对DNA进行酶切

10.1 使用T7核酸外切酶进行酶切

10.1.1 体系

DNA 25μL

10×Buffer4 5.0μL

T7 核酸外切酶 2.0μL

无核酸酶水18.0μL

Total 50μL

10.1.2 将体系混合后37℃温浴15min

10.1.3 将体系放置到70℃下20min，使T7核酸外切酶失活

10.1.4 冰上放置5min

10.2 S1核酸酶处理

10.2.1 使用S1 Nuc Dilution Buffer对1.0μL 50U/μL S1核酸酶稀释

10.2.2 体系

DNA 50μL

3M NaCl 1.7μL

S1 Nuclease 2.0μL

Total 53.7μL

10.2.3 37℃温浴15min

10.3 使用Agencourt AMPure XP Reagent纯化DNA

10.3.1 将Agencourt AMPure XP Reagent磁珠再悬浮

10.3.2 DNA于磁珠结合

a. 体系：

反应样53μL

Agencourt AMPure XP Reagent 95μL

Total 148μL

b. 旋窝混匀15s，瞬时离心

c. 室温下（20-25℃）放置5min

d. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清

10.3.3 洗涤DNA 2次，每次洗涤时，保持离心管始终在磁力架上

a. 加入600μL 70%乙醇于离心管中，不搅动磁珠

b. 保持1min后，小心除去上清

10.3.4 将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，放回磁力架，使用20μL离心管小心除去上清液

10.3.5 打开离心管盖，室温下放置3min使磁珠干燥

10.3.6 洗脱DNA

a. 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入50μL Elution Buffer （E1）

b. 震荡混匀15s，瞬时离心，室温下（20-25℃）放置3min

c. 将离心管放回磁力架至少1min至溶液澄清

d. 将上清转移到一支新的1.5mL LoBind离心管

11. DNA片段末端修复

11.1 将以下组分混合进行末端修复

T7/S1 酶切DNA 50μL

5×Reaction Buffer 20.0μL

10mM dNTP Mix 2.0μL

End Polishing Enzyme 2 2.0μL

Nuclease-free Water 26μL

Total 100μL

11.2 混合液室温下放置30min（在此期间可以进行下一步的磁珠预洗步骤）

11.3 向体系中加入5.0μL 0.5M EDTA，终止反应

体系

Stopped end-repair mix 105μL

Bead Binding Buffer 200μL

Nuclease-free Water 95μL

Total 400μL

12. 文库片段与链霉素亲和素磁珠结合

12.1 磁珠准备

12.1.1 准备1×BSA 缓冲液

100×BSA 5.0μL

Nuclease-free Water 495μL

Tota l500μL

12.1.2 旋窝震荡Dynabeads MyOne Streptavidin C1的离心管，取50μL

磁珠装入一支1.5mL LoBind离心管中

12.1.3 加入500μL Bead Wash Buffer于50μL磁珠体系中，旋窝混匀15s，

瞬时离心

12.1.4 将磁珠放置到磁力架上至少1min至溶液澄清，小心除去上清

12.1.5 加入500μL 1×BSA，旋窝震荡15s，瞬时离心

12.1.6 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清

12.1.7 加入500μL Bead Binding Buffer，旋窝震荡15s，瞬时离心

注意：第八步在DNA末端修复结束后进行

12.1.8 将离心管放置到磁力架上至少1min，至上清澄清，除去上清

12.2 将文库DNA于磁珠连接

12.2.1 将含有Bead Binding Buffer的400μL文库DNA加入到准备好的磁

珠中，旋窝震荡15s

12.2.2 室温下（20-25℃）放置30min后，瞬时离心

12.3 洗涤DNA-磁珠混合体系

12.3.1 准备1×Reaction Buffer

5×Reaction Buffer 120μL

Nuclease-free Water 480μL

Total 600μL

12.3.2 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清

12.3.3 洗涤磁珠三次：

a. 向体系中加入500μL Bead Wash Buffer，旋窝震荡15s，瞬时

离心

b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去

上清

12.3.4 洗涤再悬浮磁珠

a. 加入500μL 1×Reaction Buffer，旋窝混匀15s，瞬时离心

b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清

c. 将磁珠在87μL 1×Reaction Buffer中悬浮

13. 连接Ion接头

13.1 Ion接头于DNA-磁珠复合体连接

a. 体系

DNA-bead 复合物87μL

Ion Library Adaptor Mix 3.0μL

T4 DNA连接酶，5U/μL 10.0μL

Total 100μL

b. 室温下旋转混合30min

c. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液

13.2 洗涤DNA 3次

a. 向离心管中加入500μL Bead Wash Buffer，旋窝震荡15s，瞬时离心

b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，溶液澄清后，除去上清

13.3 洗涤、再悬浮DNA-磁珠复合体

a. 向体系中加入500μL Elution Buffer（E1），旋窝震荡15s，瞬时离心

b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清

c. 加入30μL Elution Buffer（E1）使DNA-磁珠复合体再悬浮

14. 缺口修复和文库预扩增

14.1 配置与扩增PCR体系

连接接头且纯化的DNA通过PCR过程完成缺口修复，使用Platinum PCR Amplification Mix进行。

接下来，使用Ion Amplification Primer Mix以及Platinum PCR Amplification Mix对文库进行预扩增。预扩增是用来决定用于最终扩增的循环数，避免过多的扩增循环。选择适当的扩增循环数，使用2% E-Gel EX凝胶电泳时，扩增片段恰好可见。

14.1.1 准备PCR扩增体系

组分

Platinum PCR Amplification Mix 70μL

Ion Library Amplification Primer Mix 2.5μL

Total 72.5μL

14.1.2将体系旋窝混合，瞬时离心，对照管向其中加入23μL PCR反应体系混合液，标号“PCR #0”

第二代测序技术

第二代测序技术 --以Illumina/Solexa Genome Analyzer为例 1.概述 DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展，传统的Sanger 测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。 2.基本原理 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成变测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 3.操作流程 1）测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需

二代测序NGS实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。 随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用： 全基因组从头测序或者重测序 目标序列重测序 转录组分析 微生物组研究 基因调控研究 NGS 序列 二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。？ 从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。 台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。目前，这些仪器的通量在10 Mb到 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。 因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。 有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的工作流程如下： DNA样本制备 文库构建和验证 文库分子大规模平行克隆扩增 测序 ？ 二代测序DNA样本的质量控制

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

二代测序NGS实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程与应用。 随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序,具有广泛的应用: ?全基因组从头测序或者重测序 ?目标序列重测序 ?转录组分析 ?微生物组研究 ?基因调控研究 NGS 序列 二代测序仪器有很多种组合,在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格与技术方面存在存在差异。 从规格与初始成本的角度而言,二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围,也就就是所谓的“台式测序仪”与高通量仪器。 台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样,自己进行测序。这些仪器可以与一些靶标序列富集技术相结合,用在一些临床的应用中,其中:选定的靶标基因用于深度分析,以检测稀有的突变,或者检测多样样本中(比如癌症样本)中的突变。目前,这些仪器的通量在10 Mb到7、5 Gb之间,但就是随着硬件,软件与试剂的持续改善,通量也在稳步增加。 高通量测序仪非常适合于大量的,基因组范围的研究,每次测序能测定600 Gb的序列。一些这样的高通量与高精度的平台,能测定的片段长度相对较短,这对于高重复性的序列与未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反,也有一些仪器能测序的片段较长(达到2500 bp),但就是其精度与测序能力(90 Mb)要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器(~800 bp,700 Mb)。 因此,应用决定了哪一种仪器就是最合适的。 有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中,根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变,可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体,而不需要生成新的DNA链。 DNA测序 二代DNA测序的工作流程如下: ?DNA样本制备 ?文库构建与验证 ?文库分子大规模平行克隆扩增 ?测序 二代测序DNA样本的质量控制 首先,评价基因组DNA的质量就是非常必要的(完整性与纯度)。 凝胶电泳法

二代测序内容

二代测序： 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕 捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。 DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的 应用。早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测 序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里 程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法 因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着 科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序 技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价 比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成 本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而 在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽 然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程 等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测 序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。 基本原理是：Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。 在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 3操作流程 1）测序文库的构建（Library Construction） 首先准备基因组DNA（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将 DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如 果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加 上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小 （Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说， 通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。 2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification） Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性 成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。 3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification）

基因组DNA测序文库构建

基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间， 体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系

DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul

三代基因组测序技术简介及其原理整理.

三代基因组测序技术简介及其原理整理 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。 1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 Sanger法原理： 1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。 2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 化学裂解法原理： 与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 第二代测序技术 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不

二代测序之建库步骤

第一部分DNA酶处理：试剂为PROMEGA( RQ1 RNase-Free DNase ) 目的：失活DNase酶 RNA（TE洗脱）8微升 RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1微升 RQ1 RNase-Free DNase 1微升/微克RNA 合计10微升 37℃ 30分钟孵育 加1微升的RQ1 DNase 终止液 65℃ 10分钟使DNase酶失活 （PS:经验这一步最好在核酸提取之前就处理好，具体步骤如下：取样本反复冻融三次，然后一万转离心十分钟，取上清，用0.22微米的滤膜过滤，加DNase，提核酸） 第二部分RNA-seq system V2(cat.7102) 目的：生成并纯化cDNA 一、第一链合成 1. 融解第一链cDNA合成试剂（蓝色盖）和无核酸酶的水（绿色） 2. 短时离心A3ver1 放在冰上，votex A1Ver4和A2ver3，离心后放在冰上；无核酸酶水放在室温； 3. 在冰上，取2ul A1和5ul total RNA （500pg到100ng）放在0.2mlPCR管里； 4. 将PCR管放在PCR仪中运行程序1： RNA量≤ 1ng时，65℃ 2min，4℃存放 RNA量> 1ng时，65℃ 5min，4℃存放； 5. PCR仪降到4℃后取出PCR管放在冰上，加入制备好的第一链合成试剂，每个样本加入3ul，混匀后，离心放在冰上： 第一链合成试剂：2.5ul buffer mixA2+ 0.5ul 酶混合液A3（共3ul）注意：加酶A3时要慢慢加入，反复吹打枪头至少5次确保酶加入进去 6. 把加入第一链合成剂和样本的PCR管放在PCR仪上运行程序2： 4℃ 1min，25℃ 10min，42℃ 10min，70℃ 15min，4℃hold 二、第二链合成