毕赤酵母高密度发酵生产白地霉脂肪酶研究
分类号学号M201071402 学校代码10487密级
硕士学位论文毕赤酵母高密度发酵生产白地霉
脂肪酶研究
学位申请人：柯锋
学科专业：生物工程
指导教师：闫云君教授
答辩日期：2112年6月28日
A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of Master of Microbiology
High cell-density fermentation of Geotrichum candidum lipase GCL in recombinant
Pichia pastoris
Candidate：F eng Ke
Major：B ioengineering
Supervisor：P rof. Yunjun Yan
Huazhong University of Science & Technology
Wuhan 430074, P. R. China
June, 2012
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：
日期：年月日
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本论文属于
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学位论文作者签名：指导教师签名：
日期：年月日日期：年月日
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摘要
白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL) 对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸具有高度底物特异性，基于这一性质可选择性地水解脂肪酸而富集高营养价值的多不饱和脂肪酸或选择性酯化分离共轭亚油酸异构体，应用潜力巨大。本文对含有GCL B基因的重组毕赤酵母(Pichia pastoris)Mut+表型和Mut s表型工程菌进行了摇瓶发酵条件优化及10-L发酵罐高密度发酵产酶条件优化。主要研究结果如下：
（1）将实验室构建的X-33/pPICZα-gcl 57#进行罗丹明B平板检测及摇瓶发酵酶活验证，其初始酶活力为140 U/mL(橄榄油乳化液,碱式滴定法)。对该菌株的摇瓶发酵条件进行了优化，其最佳产酶条件为装液量40 mL/500 mL三角瓶、pH 7.0、诱导时间72h、甲醇添加量1%，优化后酶活力达到375 U/mL。对57#重组子进行了10-L 发酵罐高密度发酵条件优化研究，其最佳诱导产酶条件为：细胞生长阶段温度29.0°C、pH 5.0，诱导阶段温度27.0°C、pH 6.0。最佳条件下发酵162.8h，生物量达到338 g/L，蛋白含量达到2.68 g/L，酶活力达到5,000 U/mL，酶活生产率达到30.69 U/(mL·h)。采用甲醇与甘油混合补料，发酵139.8h生物量达到398 g/L，蛋白含量达到2.56 g/L，酶活力达到5,600 U/mL，酶活生产率达到40.06 U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高16.7%，酶活生产率提高46.0%；而采用甲醇与山梨醇混合补料，发酵123h生物量达到395 g/L，蛋白含量达到2.74 g/L，酶活力达到6,000 U/mL，酶活生产率达到48.78 U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高25.0%，酶活生产率提高78.2%。
（2）通过电转将载体p PICZα-gcl整合至P. pastoris KM71H中，得到一株酶活力最高达215 U/mL的Mut s表型33#重组子，其摇瓶诱导产酶最佳甲醇添加量为0.6%。对其进行10-L发酵罐高密度发酵，甲醇单独诱导发酵196.7h，生物量达到332 g/L，蛋白含量达到2.61 g/L，酶活力达到5,450 U/mL，酶活生产率达到27.69 U/(mL·h)。采用甲醇与山梨醇混合补料发酵168.3h，生物量达到394 g/L，蛋白含量达到3.06
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g/L，酶活力达到6,500 U/mL，酶活生产率达到38.62 U/(mL·h)。
（3）将实验室构建的双启动子重组菌GS115/9K gcl-FLD gcl 26#进行10-L发酵罐混合碳源补料发酵研究。以甲醇和山梨醇作为混合碳源进行诱导，发酵113.1h，生物量达到396 g/L，蛋白含量达到4.52 g/L，酶活力达到11,200 U/mL，酶活生产率达到98.98 U/(mL·h)。
（4）对比三株工程菌在10-L发酵罐中的发酵特性及产酶情况，结论为：Mut s 型参数变化较Mut+型更稳定；甲醇与山梨醇混合补料可以明显减少色素（FAD）的产生；采用甲醇与山梨醇混合补料相对甲醇单独补料，酶活力提高20%，酶活生产率提高30%~60%；而采用分子手段构建的双启动子工程菌，其酶活相对单一启动子工程菌提高约1倍，酶活生产率也提高1倍左右。
关键词：白地霉脂肪酶；毕赤酵母；摇瓶优化；高密度发酵；混合补料
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Abstract
The Geotrichum candidum lipase (GCL) is a catalyst with substrate specificity to the fatty acids owning a cis-double bond in the 9-position. Thus, GCL can be used to selectively hydrolyze fatty acids to enrich unsaturated fatty acids (UFAs) with high nutritional value or to selectively esterificate and separate conjugated linoleic acid isomers. The objectives of this thesis are to optimize shake flask fermentation conditions and high-density fermentation conditions of the recombined Pichia pastoris harboring GCL B gene and appearing Mut+ phenotype and Mut s phenotype, for enzyme production in 10-L fermenter. The main results are as follows:
(1) Rhodamine B flat and shake flask fermentation were employed to quanlitatively and quantitatively detect the enzyme activity of X-33/pPICZα-gcl 57#. The initial enzyme activity is 140U/mL (olive oil emulsion, alkali type titration). The optimized shake flask fermentation conditions were 40 mL culture medium in 500 mL shake flask, pH 7.0, 1% methanol, and induced 72 hours with the highest enzyme activity at 375 U/mL. Then, the fermentation conditions of X-33/pPIC Zα-gcl 57# in 10-L fermenter were optimized, and the optimal conditions of enzyme production were: fermentation temperature 29.0℃, pH 5.0 in cell growth phase, and the temperature 27.0℃, pH 6.0 in the induction phase. Under such conditions, the biomass reached 338 g/L, the protein content 2.68 g/L, the enzyme activity 5,000 U/mL, and the productivity of enzyme activity 30.69 U/(mL?h) after 162.8 hours. With methanol and glycerol mixed fed culture, the biomass attained at 398 g/L, the protein content at 2.56 g/L, enzyme activity at 5,600 U/mL, and the productivity of activity enzyme at 40.06 U/(mL?h). Compare with methanol fed culture, the enzyme activity increased by 25.0%, and the productivity of enzyme activity by 78.2%.
(2) The pPICZα-gcl vector was imported into the P. pastoris KM71H by electrical conversion, and the recombinant 33#with muts phenotype was sieved. The highest enzyme activity was up to 215 U/mL, and the optimal loading dosage of methanol for enzyme production was 0.6%. The biomass reached 332 g/L, the protein content 2.61 g/L, the enzyme activity 5,450 U/mL, and the productivity of enzyme activity 27.69 U/(mL?h)
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after 196.77 hours under high-density fermentation in 10-L fermenter. While the biomass reached 394 g/L, the protein content 3.06 g/L, the enzyme activity 6,500 U/mL, and the productivity of enzyme activity 38.62 U/(mL?h) after 168.3 hours with methanol and sorbitol mixed fed culture.
(3) The mixed carbon source fed fermentation was explored with the dual-promoter recombinant, GS115/9K gcl-FLD gcl 26# in 10-L fermenter. The biomass reached 396 g/L, the protein content 4.52 g/L, enzyme activity 11,200 U/mL, and the productivity of activity enzyme 98.98 U/(mL?h) after 113.1 hours with methanol and sorbit ol mixed fed culture.
(4) The following conclusions are drawn by comparing the fermentation characteristics and enzyme production of the three engineering strains in the 10-L fermenter: i. Changes in parameters of Mut s are more stable than those of mut+; ii. methanol and sorbitol mixed fed culture can significantly reduce the production of pigment (FAD); iii. the enzyme activity increased 20% and the productivity of enzyme activity increased by 30%-60% with methanol and sorbitol mixed fed culture in comparison to methanol fed culture alone; iv. the enzyme activity increased by ca. 100% and the productivity of enzyme activity also increased by 100% with the dual-promoter recombinants by genetic engineering in comparison to the single-promoter recombinants.
Keywords: Geotrichum candidum lipase(GCL); Pichia pastoris; optimization of shaking flask fermentation ; high-density fermentation; mixed carbon resources fed-batch
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目录
摘要............................................................................................................. I Abstract ........................................................................................................... I II 1 文献综述
1.1 脂肪酶概述及应用 (1)
1.2 毕赤酵母表达系统研究进展 (3)
1.3 毕赤酵母高密度发酵研究进展 (6)
1.4 白地霉脂肪酶GCL及其研究进展 (7)
1.5 本课题研究的目的及意义 (8)
2 Mut+型工程菌摇瓶及10-L发酵罐发酵条件优化
2.1 引言 (10)
2.2 材料与方法 (11)
2.3 结果与分析 (15)
2.4 讨论 (25)
2.5 本章小结 (26)
3 Mut s型工程菌的构建和10-L发酵罐高密度发酵
3.1 引言 (28)
3.2 材料与方法 (28)
3.3 结果与分析 (31)
3.4 讨论 (38)
3.5 本章小结 (38)
4 双启动子工程菌在10-L发酵罐中的高密度发酵
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4.1 引言 (40)
4.2 材料与方法 (40)
4.3 结果与分析 (41)
4.4 讨论 (46)
4.5 本章小结 (47)
5 全文总结与展望
5.1 总结 (48)
5.2 展望 (49)
致谢 (50)
参考文献 (51)
附录1 攻读学位期间发表论文目录 (57)
附录2 各种仪器和设备 (58)
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1 文献综述
1.1 脂肪酶概述及应用
脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)即三酰基甘油水解酶，能够在油水界面发挥活性，可催化水解、酯化、酯交换、酸解、醇解、氨解等多种反应[1]。脂肪酶来源十分广泛，动物、植物和微生物都可产生脂肪酶。其中微生物脂肪酶产量最高，基因操作简单，相对于动植物脂肪酶更加稳定。而且微生物脂肪酶以其酶活力高、选择性强和底物特异性广泛等优点在工业应用中得到极大地推广[2]。许多微生物都能生产脂肪酶，包括细菌和真菌[3]。脂肪酶具有界面激活特性，只有在油水界面上才能被激活，在含有可溶性底物的水溶性介质中活力较低。它能够识别油脂底物的特殊酯键并催化其水解为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。绝大多数脂肪酶为碱性和中性脂肪酶，分子量一般在17~70 kDa之间，最佳反应温度在30~70°C之间。不同来源的脂肪酶可与不同碳链长度的脂肪酸酯和不饱和双键酯类发生催化反应，具有链长偏好性和位置特异性。脂肪酶因催化效率高，反应条件温和，绿色无污染等而在油脂加工、生物柴油、饲料、食品、洗涤、制革、有机合成及对应体拆分等领域被广泛应用[1]。
1.1.1 脂肪酶在生物柴油生产中的应用
利用脂肪酶催化动植物油脂与短链醇间的酯交换反应而生成相应的脂肪酸酯就是酶法合成生物柴油，与传统化学催化相比，该法具有反应条件温和、设备投资少、提取纯化工艺简单、污染小、耗能低、对油脂原料要求低等优点。由于生物柴油具有可再生、环境友好、闪点高等优点，它可作为良好的石油替代品[4]。本课题组与清华大学、海纳百川公司合作，在湖南益阳建设了年产2万吨的生物酶法生产生物柴油的示范线，并于2006年12月正式建成投产，是世界上首个脂肪酶催化生产生物柴油工艺的生产示范线[5]。
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1.1.2 脂肪酶在洗涤剂工业中的应用
目前脂肪酶的最大商业应用领域是作为添加物应用于家庭或工业用清洁剂中。1988年，Novozymes公司相继推出了两种应用于洗涤剂工业的脂肪酶Lipolase?和Lipoprime?。脂肪酶可以将甘油三酯水解为更易于溶解的单甘酯、甘二酯、甘油和游离脂肪酸，将其添加到洗涤剂中可有效去除含脂肪的污渍。应用基因工程开发出洗涤剂专用脂肪酶是现代生物技术大规模工业化最成功的应用之一[6]。
1.1.3 脂肪酶在手性药物中间体制备中的应用
手性化合物在医药行业的应用极其广泛，且在新材料及农药等行业中也有着较为广泛的应用。利用酶的高度立体选择性所制备的单一手性化合物具有光学纯度高的特点。此外，酶拆分反应具有反应条件温和，能源消耗少，产物纯度高，环境污染小等优点。因此，在单一手性药物中间体合成中，人们越来越青睐于酶法拆分。而脂肪酶作为水解酶的一大类在酶法拆分中的应用越来越普遍[7]。
1.1.4 脂肪酶在食品工业中的应用
脂肪酶在焙烤食品中可作为绿色生物改良剂；在油脂工业上可促油脂水解、促酯交换和促酯化；在乳品工业中可用于水解乳酯；在食品添加剂中应用可增香改质、哦提高食品档次[8]。脂肪酶可以通过特异性的改变脂肪酸的位置或者替换其中一个或多个脂肪酸来改良油脂性质，从而提高油脂营养价值以实现油脂及脂肪的高值化。
1.1.5 脂肪酶在环境保护中的应用
脂肪酶应用于环境的生物修复以及废物的处理是一个新兴的领域。脂肪酶可用来处理油脂加工过程中产生的含脂废物及餐饮业中产生的食用油等；脂肪酶还可用于制造液体肥皂，处理废水及清理排水管，去除造纸产生的废水以及冷却水系统中的生物膜沉积物等[9]。
1.1.6 脂肪酶在其他方面的应用
此外，脂肪酶在纺织工业、皮革业、造纸工业和废水处理等[10]领域也具有较为
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广泛的应用前景。特别是随着固定化、全细胞催化等技术的深入研究与开发，脂肪酶将会在各个行业和各个领域被广泛利用。
1.2 毕赤酵母表达系统研究进展
脂肪酶来源虽然广泛，大多数微生物生产脂肪酶的产量仍较低，无法满足大规模工业应用的需求。相对物理提取法和化学合成法，微生物发酵生产脂肪酶具有产物纯度高、成本低、产酶周期短、易于生产管理等优点。所以，选择微生物发酵法生产脂肪酶制剂是一种经济而实用的方法[11]。
毕赤酵母表达系统是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一，是继酿酒酵母表达系统之后被迅速推广的一种真核表达系统。毕赤酵母含有如醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)、二羟丙酮合成酶、过氧化氢酶等甲醇代谢途径所必需的酶[12]，是一种甲醇营养型酵母，相较于其他表达系统具有诸多优点：易培养，对营养要求低，可在廉价的盐培养基中生长，易于高密度发酵培养与工业化生产，且自身分泌的背景蛋白少，目的蛋白纯化较简单，对蛋白质产物的糖基化方式更接近高等生物，因而临床应用更安全[13]。
1.2.1 表达载体和启动子
毕赤酵母表达载体分为游离型和整合型。由于稳定附加型载体的缺失，所以在毕赤酵母体内通常采用整合型载体。胞内表达型载体和分泌表达型载体是常见的两类整合型载体，胞内表达型主要有p GAPZ、p PIC3.5K、p PICZ、p AO815等系列，分泌表达型有p GAPZα、p PIC9K、p PICZα、p PIC9、p PMETα等系列，其中p GAPZα系列带有α因子。Invitrogen公司已开发推出多种毕赤酵母表达系统试剂盒，如：Easyselect Pichia Expression Kit、Multi-copy Pichia ExpressionKit、Pichia meth-anolia Expression System等。表达载体应包含以下基本组件：能进行自主复制的起始位点；有功能的选择标记一般包括营养缺陷型HIS4、Zeocin抗性；启动子和终止子；将外源基因融合克隆到表达载体阅读框架内，使目的蛋白分泌表达的信号肽序列。
启动子是基因表达调控的重要元件之一，其强弱直接影响着目的基因的表达。
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目前，毕赤酵母中的许多启动子已被克隆并得到功能鉴定[14]。醇氧化酶启动子p AOX1是最常用的启动子，能在甲醇诱导下高效表达外源蛋白，而在葡萄糖、乙醇或甘油培养基上生长则检测不到目的产物[15]。AOX2启动子与AOX1启动子有92%的基因序列同源性和97%的编码蛋白质同源性，但其启动子强度远低于AOX1[16]。甲醛脱氢酶启动子p FLD1也是一种强启动子，与p AOX1相当，并且分别能以甲醇和甲胺作为唯一碳源诱导目的基因的表达[17]。本实验室的申旭光利用p FLD1启动子表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2，在摇瓶和10-L发酵罐水平均获得很高的表达量[18]。组成型强启动子p GAP无需甲醇的诱导，就可以在含甘油或葡萄糖等碳源的培养基上表达外源蛋白，因此其发酵工艺更为安全，更适合于外源蛋白的大规模发酵生产，正在受到越来越多的关注。Goodrick等[19]用GAP启动子表达几丁质酶，以葡萄糖为唯一碳源进行大约1个月时间的连续发酵，并且无酶蛋白降解现象的出现。
近年来，有学者根据不同载体的筛选标记不同，用两种不同的启动子实现目的蛋白的表达。例如，Wu[20]将人类巨噬细胞激活因子用GAP和AOX1两个启动子在重组菌中表达。He等[21]利用GAP和AOX1两个启动子实现了β-甘露聚糖酶在P. pastoris 中的重组表达，β-甘露聚糖酶活力相较与单独使用的GAP启动子和AOX1启动子均有不同程度的提高。毕赤酵母的启动子各具特色，为外源蛋白表达系统的构建提供了更多的启动子选择。如果能联合应用不同启动子的特点，构建高效基因工程菌，将为重组蛋白的大规模生产奠定基础。
1.2.2 菌株和表型
目前，应用最广泛的P. pastoris宿主菌株有X-33、GS115、KM71、KM71H等。其中GS115和KM71为组氨酸缺陷型均不能合成组氨酸，因此在表达质粒上必须携带基因才能使转化菌株在不含组氨酸的培养基上生长。KM71和KM71H对甲醇的消耗量远低于GS115，前者是组氨酸缺陷型，而KM71H非组氨酸缺陷型。另外，SMD1163、SMD1165、SMD1168等为一系列的蛋白酶缺陷菌株，这些菌株的某些蛋白酶缺失，导致蛋白酶的降解作用降低，分泌蛋白的稳定性增高，从而目的蛋白的产量大大增加。
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根据菌株对甲醇的利用情况又可分为三种表型：（1）甲醇利用正型（Mut +），如X-33、GS115和SMD1168等，这类菌株同时含有aox1和aox2基因，对甲醇的利用效率最高，能在含甲醇的培养基上以较快的速率生长；(2)甲醇利用慢型（Mut s ），如KM71H 和KM71等，此类菌株的aox1基因被arg4取代，利用甲醇速度很慢；(3)甲醇利用负型(Mut -)，该类菌株的两个aox 基因缺失，完全不能利用甲醇，如MC100-3菌株的两个aox 基因均发生突变，不能以甲醇为碳源[22]。常见的P. pastoris 菌株类型及特点见表1.1[23]。
表1.1 毕赤酵母菌株的基因型和表型
Table 1.1 Genotype and phenotype of the P . pastoris strains
1.2.3 影响外源蛋白表达的因素
外源基因在酵母基因组中的拷贝数直接影响外源基因的表达水平。一般情况下，外源基因在毕赤酵母中整合的拷贝数越高，外源蛋白的表达量就越高。相比S. cerevisia ，单拷贝表达就足已达到最佳的生产效果，特异地增加拷贝数对表达量有一定效果[24] ，提高整合的拷贝数已经成为提高外源基因产量的重要手段。其次，外源基因的表达水平与基因本身的性质有关，基因片段中 A+T 含量高常会由于提前终止而不能有效转录而得不到完整的蛋白质产物，如果使 A+T 含量保持在 30~55%之间可以避免转录提前终止。此外，在毕赤酵母在密码子的使用上有其偏好性，61个密菌株
基因型 表型
GS115
His4 Mut + His - KM71H
Aox1Δ::SARG4 his4 arg4 Mut s His + KM71
Aox1Δ::SARG4 his4 arg4 Mut s His - X-33
Wild type Mut + His + Y11430
Wild type NRRL a MC 100-3
Aox1Δ::SARG4 aox2Δ his4 his4 arg4 Mut - His - SMD 1168
Pep4Δ his4 Mut + His - pep4- SMD 1165
Pbr1 his4 Mut + His - pbr1- SMD 1163
Pep4 pbr1 his4 Mut + His - pep4- pbr1-
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码子中有25个是酵母所偏爱的[25]。当用毕赤酵母表达非自身的基因时，一些稀有密码子的出现可能限制细胞中氨酰tRNA对氨基酸的正常运转而导致翻译提前终止[26]，因此，在设计合成基因时，不改变所翻译的氨基酸而增加毕赤酵母偏爱的密码子，可以获得外源蛋白高效表达的菌株。例如，有学者在毕赤酵母中表达抗ErbB2单链抗体时，通过密码子优化及控制G+C含量将产量提高了3~5倍[27]。
1.3 毕赤酵母高密度发酵研究进展
外源蛋白的高效表达主要依靠优良的工程菌和有效的发酵过程控制。P. pastoris 能在廉价的培养基上生长至较高的细胞密度而被广泛用于高密度发酵[28]。据报道，多种外源蛋白通过P. pastoris高密度发酵获得了很高的表达量，如胞内表达的破伤风片段C产量为12 g/L[29]，分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶表达量达22 g/L[30]，SAM 表达量达11. 63 g /L[31]。但是，不同外源蛋白因为重组菌特性以及发酵工艺的不同而导致外源蛋白表达水平存在较大差异。
目前，已应用甲醇诱导进行大规模发酵的P. pastoris表型有Mut+型和Mut s型，分别通过AOX1启动子和AOX2启动子代谢甲醇。AOX2启动子活性只有AOX1的1/10，所以Mut s型细胞代谢甲醇速率较低，只有Mut+型的1/4，甚至更低[32]。而且Mut+型在表达外源蛋白时需氧量高，进而增大了对发酵设备的要求，一旦供氧不足就会导致外源蛋白的降解，而Mut s型对溶氧要求不高。一般情况下，Mut+型产酶的速度较快，而Mut s型可通过延长发酵时间也可能获得比Mut+型更高的蛋白产量[33]。如Cos等[34]对比了Mut s型和Mut+型重组毕赤酵母工程菌表达ROL，发现Mut s型比Mut+型有更高蛋白表达效率和强度。
目前，针对甲醇诱导毕赤酵母高密度发酵的补料分批发酵和连续发酵两种方式都已比较成熟。其中补料分批发酵过程一般分为两个阶段，甘油生长期和甲醇诱导期。甘油期主要积累足够的生物量，而甲醇诱导期主要积累目的蛋白。在发酵过程中，通常毕赤酵母发酵发酵培养基可以选用FM22或BSM基础盐培养基，而不同的诱导温度、pH、溶氧、补料策略等对目的蛋白表达均有很大影响。
温度对菌体生长及生物合成过程有重要影响。一般情况下，P. pastoris的最适生
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长温度为28~30°C[58]，诱导分泌目的蛋白则应降低温度。有研究表明，低温有利于新生肽的正确折叠而增加目的蛋白的稳定性，有利于分泌型产物在培养基中的积累[34, 35]。
pH对P. pastoris生长和蛋白表达过程的影响非常明显。在菌体发酵过程中，由于培养基的利用、菌体分泌产物等影响，菌体所处环境的pH会不断发生变化。P. pastoris能够在pH 3.0~7.0间生长，但是控制pH在5.0~6.0时菌体的生长状况和蛋白的表达量最好。控制好发酵过程中的pH，对菌体的生长和产物的合成具有重要意义。
溶氧(dissolved oxygen, DO)是P. pastoris高密度发酵过程中需要控制的重要参数。溶氧对菌体的生长和外源蛋白的表达影响十分明显，当出现供氧不足时，菌体的生长会受到抑制；当供氧过高时，发酵液中生成的大量氧自由基会对菌体产生一定程度的毒害作用。一般在发酵过程中DO控制30%以上[36]。在实际的高密度发酵过程中，一般通过调整搅拌速率、改变通气量、调整罐压、控制补料速率等方式来控制溶氧。
甲醇的补加策略会直接影响菌体的生长和外源蛋白的合成[37, 38]。因为甲醇浓度过低，细胞得不到足够的碳源和能量；甲醇浓度过高，细胞会受甲醇毒害。目前甲醇的补加策略主要有三种：溶氧控制甲醇流加、气相色谱检测控制甲醇流加和甲醇传感器在线检测控制甲醇的流加[37]。另有报道称，采用甲醇山梨醇混合补料可有效缩短并提高外源蛋白表达量，如Wei等[39]按77:23 (v/v) 混合甲醇和甘油，相对单一甲醇诱导，菌体密度和rljGH 表达量迅速达到最高值的时间缩短了6h；Jungo等[ 40, 41] 在连续发酵中，甲醇和甘油、甲醇和山梨醇混合使得目的蛋白表达量分别提高了10%和30%，产热和耗氧速率分别降低28%和38%。甘油、山梨醇是常用的混合补加的碳源，但甘油对AOX1启动子有一定程度的阻遏作用，需控制其在发酵液中的含量。而山梨醇与甲醇混合补料时，其残留不会对AOX1启动子产生抑制，且产热和耗氧速率更低，有利于菌体生长和外源蛋白的高效表达，且能够大大缩短发酵时间。
1.4 白地霉脂肪酶GCL及其研究进展
白地霉的形态介于酵母和霉菌之间，以裂殖方式繁殖，具有广泛的生态适应性。
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白地霉脂肪酶（GCL）是一种无位置选择性的酶，但对C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸）具有高度底物特异性[42~44]。GCL广泛应用于催化油脂水解、酯化反应及酯交换反应[45~47]，其中在选择性水解鱼油富集多不饱和脂肪酸(如EPA和DHA)[48]及选择性酯化分离共轭亚油酸异构体等领域有很大的应用潜力[49]。随着白地霉脂肪酶研究的深入，发现白地霉产生两种胞外脂肪酶GCLⅠ和GCLⅡ。GCLⅠ对长链不饱和脂肪酸有更强的选择性，而GCLⅡ底物选择性则更宽[50]。
野生型白地霉菌株所产脂肪酶稳定性和耐受性差，产量很低，且菌株遗传不稳定。Burkert等[51]应用响应面法优化野生G. candidum菌株产酶条件，酶活力可达20 U/mL。阎金勇等[52]，应用单因子-响应面法优化筛选到的一株高产G. candidum菌株后酶活力达31.85 U/mL。随着表达系统研究的发展，很多蛋白在异源表达系统中得到高效的表达。Yan等[52]从G. candidum 中克隆到脂肪酶基因，构建工程菌GS115/pPIC9K-gcl，橄榄油酶活力达100 U/mL，蛋白含量达到0.4 g/L。
白地霉脂肪酶要应用到工业规模上，摇瓶培养完全满足不了需求，这就需要对白地霉脂肪酶进行大规模发酵生产。而据目前文献报道，关于GCL在毕赤酵母表达的发酵罐高密度研究还不多。其中，Catoni等[53]将含有gcl B基因的重组P. pastoris GS115在1-L发酵罐中培养，其酶活力达到200 U/mL。智晓燕[54]等构建了一株具有3个拷贝子的高产酶工程菌GS115/pPIC9K-gcl，摇瓶优化后最高酶活力达735 U/mL，并在3-L发酵罐上进行高密度发酵得到最高酶活力3,360 U/mL，蛋白含量达到4.3 g/L。由此可见，对高密度发酵条件进行优化是提高重组毕赤酵母产酶能力的重要手段。
1.5 本课题研究的目的及意义
本课题为国家863计划重点项目课题“食用油生物制造高效特异性脂酶的创制”(2010AA101501)和重大项目课题“聚氨酯类产品的生物-化学组合合成技术”(2011AA 02A204) 的部分研究内容，同时也受新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0336)的资助！
白地霉脂肪酶是一种优良的工业催化剂，对长链不饱和脂肪酸具有高度底物特
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异性。在选择性水解鱼油富集高营养价值的多不饱和脂肪酸(如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、选择性酯化分离功能性共轭亚油酸异构体等领域，其应用潜力巨大，但表达量较低是限制其应用的主要因素。高效的表达系统和手段可以得到足够的产物，而合适的发酵工艺可以大幅度提高外源蛋白表达量。
毕赤酵母的表达菌株容易进行大批量高密度发酵，且发酵产物的累积不毒害毕赤酵母本身，外源基因表达水平也不会受到影响。发酵罐中的培养过程经过优化控制后，绝大多数外源蛋白的表达量与摇瓶发酵相比一般会提高10%至10倍[58]。发酵条件优化包括培养基成分、温度、pH、溶氧、甲醇流加，以及其他发酵工艺的优化控制。
本文以含有gcl基因的不同甲醇利用表型P.pastoris为研究对象，探索摇瓶到发酵罐的放大工艺和补料策略优化，以提高白地霉脂肪酶（GCL）的产量，为GCL的后续放大生产提供参考。同时，毕赤酵母重组工程菌高密度发酵条件的探索及工艺放大研究对提高脂肪酶的酶活力和产量以及实现工业化发酵生产都具有重要意义。
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2 Mut+型工程菌摇瓶及10-L发酵罐发酵条件优化
2.1 引言
毕赤酵母工程菌具有较大的工业应用潜力，容易从摇瓶培养放大到发酵罐高密度培养，且外源基因表达水平较高。不同外源蛋白表达能力差异很大，主要与菌株特性、目的基因的拷贝数及发酵条件相关。获得毕赤酵母脂肪酶工程菌，一般通过观察重组菌株在罗丹明B酶活检测平板上的水解圈大小以及摇瓶发酵来筛选。通过发酵条件优化可以有效提高重组菌的生物量和脂肪酶产量。摇瓶培养相对于发酵罐高密度培养来说成本较低，且操作简单，所以一般选择先在摇瓶上进行发酵条件的初步探索，为10-L发酵罐的高密度培养提供参考。
毕赤酵母高密度发酵多采用分批补料方式，其典型培养过程分为两个阶段：第一阶段，菌体生长期，该阶段菌体以甘油为碳源大量繁殖，其目的是积累足够的生物量。此阶段分为两个小阶段：一是基础培养基中的甘油喂养阶段，此阶段结束时溶解氧(DO) 会急剧上升；二是甘油补加阶段，此阶段是在第一阶段结束时开始向发酵液中补加甘油，并根据DO变化情况调节甘油补加速率，且维持DO不低于30%。第二阶段，诱导产酶期。甘油补完后，开始补加甲醇诱导目的蛋白表达，在维持DO 不低30%基础上根据DO变化情况调节甲醇流加速率，一方面保证充足的营养和DO，另一方面降低细胞死亡率，减少蛋白酶的分泌。
据文献报道，高温利于毕赤酵母生长代谢和蛋白表达，但温度过高会导致发酵周期缩短，降低脂肪酶产量和活性，而低温有利于新生肽的正确折叠和脂肪酶稳定性的提高，并且低温有利于蛋白酶活性的降低[34, 35]。所以在发酵不同阶段采用不同温度。pH对毕赤酵母生长和蛋白表达都有很大的影响，且通过调节pH抑制蛋白酶活性来减少蛋白降解。因此选择合适的pH对发酵过程至关重要，且多采用变pH发酵[58]。采用混合碳源补料，可以提高生物量和脂肪酶产量，并大大缩短发酵周期，从而可以大大提高生产效率。
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2.2 材料与方法
2.2.1 菌种
X-33/pPICZα-gcl 为本实验室保存。
2.2.2 实验仪器与设备
实验用到的仪器和设备见附录2。
2.2.3 培养基与常用溶液
YPD液体培养基(w/v, 100 ml)：葡萄糖2 g，，蛋白胨2 g，酵母提取物1 g ,121°C 灭菌。
YPD固体培养基：YPD液体培养基中加入1.5~2.0%琼脂，121°C灭菌。
YPDS液体培养基：在YPD液体培养基中加入终浓度为1 mol/L的山梨醇和终浓度为100 g/mL的Zeocin，
YPDS固体培养基：YPDS液体培养基中加入1.5~2.0%琼脂，121°C灭菌。
罗丹明B酶活力检测固体培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%琼脂，10%磷酸钾缓冲液(1 mol/L,pH 6.0)，1%橄榄油乳化液，3.5 mL罗丹明B，121°C灭菌后，补加10% 10×YNB，0.2% 500×B，5 mL甲醇。
500×B (0.02%生物素)：40 mg生物素溶于200 mL双蒸水(ddH2O)中，过滤除菌。
10×YNB：26.8 g无氨基酸氮源溶于200 mL ddH2O中，过滤除菌。
10×磷酸钾缓冲液（1 mol/L）：分别配置1 mol/L的K2HPO4和1 mol/L的KH2PO4，根据《分子克隆手册》按比例混合配置不同pH的缓冲液。
BMGY液体产酶培养基(w/v, 100 ml）：10×磷酸钾缓冲液（1 mol/L, 10 ml），酵母提取物1 g，蛋白胨2 g，甘油1 g，灭菌后加入无菌10×YNB 10 ml。
5%浓缩胶：1 mL 30%聚丙烯酰胺，0.06 mL 10%过硫酸铵，0.75 mL Tris (1 mol/L, pH 6.8)，0.006 mL TEMED，0.06 mL 10% (w/v) SDS，4.1 mL ddH2O。
12%分离胶：6.0 mL 30%聚丙烯酰胺，0.15 mL 10%过硫酸铵，3.8 mL Tris (1.5 mol/L, pH 8.8)，0.006 mL TEMED，0.15 mL 10%(w/v)SDS，4.9 mL ddH2O。
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
发酵工业中常用常见的酵母菌
发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。 目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。 底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵 及酶学性质分析 姓名：李善军 学号：2015304120225 院系：华中农业大学生科院
摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。 关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析
本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。 毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。 1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵 1.1种子液培养 1.1.1种子培养基 YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%） YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2% 1.1.2培养温度与菌龄 挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。 1.2发酵罐培养 1.2.1菌体培养 清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响
V o l .30N o.62004212 华 东 理 工 大 学 学 报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金 E -ma il :qye @ecust .edu .cn 收稿日期:2003212208 作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为 发酵工程。 研究简报 文章编号:100623080(2004)0620723204 重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响 谢静莉1, 周庆玮2, 杜 鹏2, 甘人宝2, 叶 勤13 (1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237; 2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。 关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris X IE J ing 2li 1 , ZH OU Q ing 2w ei 2 , DU P eng 2 , GA N R en 2bao 2 , Y E Q in 13 (1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience , Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina ) Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S pheno type ),feeding w ith glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on . Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on 3 27
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏2 1.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039； 2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071； 3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000 ［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78 ［文献标识码］A ［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04 Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer?mentation XIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2* 1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850; 3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China *Corresponding author,E-mail:liuzhm@https://www.sodocs.net/doc/5516272307.html, ［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently. High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ?est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ?um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questions existing in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentation course 综述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026 20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类 疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母 大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模 的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L [4]，破伤风片段C 产量高达12g/L [5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L [6]等，而最低的报道只有1mg/L ，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation ）也成为一个关键技术环节。 1 毕赤酵母工程菌的选择和改良 1.1 工程菌的选择 目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut +和mut s ，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制 性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow ， mut s 或mut -），它们只能利用弱的aox2基因启动合成 收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail ）liuzhm@https://www.sodocs.net/doc/5516272307.html,
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验 一、实验目的 1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。 二、毕赤酵母简介 甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。 毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
6毕赤酵母介绍
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。 酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。现将毕赤酵母表达系统优点概括如下: ①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全; ②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产; ②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会 在传代过程中出现丢失现象; ③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白 分泌至胞外; ⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控; ⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性; ⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化; ⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
酵母菌
酵母菌 子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。是遗传工程和细胞周期研究的模式生物。 酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。可在缺氧环境中生存。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中。 生理 酵母营专性或兼性好氧生活，目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇（俗称酒精）来获取能量。 在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。 在有氧气的环境中，酵母菌将葡萄糖转化为水和二氧化碳.无氧的条件下，将葡萄糖分解为二氧化碳和酒精. 在温度适合时，氧气和养料充足的条件下，以出芽方式迅速增殖。 化学元素组分 酵母的化学组成与培养基、培养条件和酵母本身所处的生理状态有关。 一般情况下： 酵母细胞的平均元素组成(%)如下：碳-47 氢-6.5 氧-31 氮-7.5~10 磷-1.6~3.5 其他元素的含量很少（%） 钙-0.3~0.8 钾-1.5-2.5 镁--0.1~0.4 钠-0.06-0.2 硫-0.2 在酵母中发现的微量元素（mg/kg) 铁--90-350 铜：20-135 锌：100-160 钴：15-65 特征 各种酵母菌的菌落 多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米或5~20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的
毕赤酵母发酵罐发酵
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母） 灭菌前： 室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）； 室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定 灭菌： 1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至 80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在 0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。 2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 （注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。） 灭菌后: A.消耗甘油阶段 1.灭菌后冷却30℃时： 2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐； 3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。 4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。 【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。】 5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。 B.甘油补料阶段 1.将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。 2.甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。 【4％甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。】 重要:如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的
酵母菌的高密度发酵
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：酵母菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：吴亚非 学号：201006040051 专业班级：10 生物技术 指导教师：马瑞霞 2013年5月26日
课程设计任务书设计题目酵母菌的高密度发酵 学生姓名吴亚非所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10级生物技术 设计要求： 1、设计题目选择要求紧扣发酵工程相关教学内容和生产实际。 2、要充分查阅相关背景资料，了解相关内容的前沿进展及存在问题。 3、设计说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、实验方案要切合实际，严密合理 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、在老师的指导下确定设计题目。 2、学生查阅相关文献和资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可操作性。 3、学生在实验室完成既定方案。 4、完成课程设计说明书的初稿，经过指导老师的帮助修改，最后定稿。 参考文献阅读： [1]李寅等著，高细胞密度发酵技术[M]，化学工业出版社，2006-10-01，230-280 [2]陈思如，萧熙佩酵母生物化学[M]，济南：山东科学技术出版社，1990年 [ 3 ] ( 日) 山根恒夫( 周斌译) , 生化反应工程( 第二版)[M] , 西安: 西安大学出版社, 1992: 243 [4]Craig. T.B. and Trotter S G Intern. Symp. SCP. A lgiers A lgoria, O ct, 1983:17-20 [5]陈洪章，李佐虎，酵母菌的高密度发酵[J]，工业微生物，1998-28-1 工作计划： 2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期：2013年5月13日 任务完成日期：2013年5月26日 指导教师（签名）：学生（签名）：